细胞cck8检测实验

细胞增殖-毒性实验步骤

1、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：

实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含10%FBS、80U/ml 青霉素及0.08mg/ml链霉素的培养基中，放入３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养，每２天换液１次。

2）倒去培养瓶内的培养液；

3）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；

4）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；

5）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；

7）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；

8）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；

9）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；

CCK-8实验：

10）在96孔板中，给每孔加100μL（约10000个细胞）的细胞悬液，每组设５个复孔，将培养板放在培养箱预培养 24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；11）向培养板中加入100ul含药物培养基

12）将培养板在培养箱干预 24、48、72ｈ后，每孔加入20ulCCK-8液，在培养箱继续培养0.5-２ｈ，酶标仪检测 450nm处吸光值（A），计算抑制率

抑制率＝（阴性对照A值－二甲双胍各浓度A值）／阴性对照A值×100%

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

13）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。

CCK8对照组的设置及测定的注意事项

?设定参比波长：

CCK8试剂在参比波长处没有吸光度，设定参比波长为了去除由于样品浑浊所带来的吸光度。

?设定空白对照：

1.在不含细胞的培养基中加CCK8，测定450nm的吸光度作为空白对照。

2.在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞、加入药

物的培养基中测定450nm的吸光度作为空白对照。

?合适的OD值范围：

一般OD值在0.1-2.0范围内，在1.0左右较好。

?吸光值太高：

1.细胞数量过多，应适当减少细胞量。

https://www.360docs.net/doc/db18888097.html,K8试剂孵育时间过长，应缩短孵育时间（1-2小时）

CCK8标准曲线、检测时间、终止反应以及减少加样误差的方法?培养板的选择

除96孔板外，24孔板、12孔板均可用于CCK8检测，只是采用24孔板、12孔板CCK8的用量较多，使用量仍为培养基体积的1/10。

?减少CCK8加样的误差：

1.避免CCK8在枪头和孔壁上的残留。

2.可在加样前用培养基稀释CCK8试剂并混匀后加样。

?制作标准曲线的方法：

1.取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中。

2.用培养基依次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液。

3.细胞培养一段时间后加入CCK8试剂孵育1-4小时。

4.酶标仪进行测定，以细胞数量为X轴，OD值为Y轴，就可以制作标准曲线。

?CCK8加入后最佳的检测时间：

https://www.360docs.net/doc/db18888097.html,K8试剂和细胞内的脱氢酶反应是一个循环反应，随着时间的增加，颜色

不断加深，OD值也会不断增加，但细胞数量却没有变化。

2.一般情况下，建议在确定最佳的实验条件（合适的时间、合适的OD值）后，

把加入CCK8试剂后的培养时间固定下来，以后在同样的培养时间点进行检

测。

终止CCK8显色的几种方法（96孔板）：

1.每孔加入10ul 0.1M HCl溶液。

2.在显色反应后，将培养板放入4度冰箱内。

3.每孔加10ul 1%（W/V）的SDS溶液。