内皮素受体B基因多态性与慢性阻塞性肺疾病及吸烟因素的相关性研究

｝缶床内科杂志２０１１年８月第２８卷第８期Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｔｅｒｎ　２０　：垫　：　内皮素受体Ｂ基因多态性与慢性阻塞性　肺疾病及吸烟因素的相关性研究　

尹琦　梁永杰　任涛　郭忠良　陆晶晶　张路　芮庄华　［中图分类号］Ｒ５６３　［文献标识码］Ａ　［ＤＯＩ］１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１　９０５７．２０１１．０８．０１３　［摘要］　目的探讨内皮素受体Ｂ（ＥＤＮＲＢ）基因的第４外显子－３０　Ｇ／Ａ处单核苷酸多态性　与慢性阻塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）易感性及吸烟因素之间关系。方法采用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ技术，检测并　分析ＥＤＮＲＢ基因一３０Ｇ／Ａ（Ｌ２７７Ｌ）单核苷酸多态性位点在ＣＯＰＤ组和健康对照组中的基因型频　率、等位基因频率，同时分析该多态性位点与吸烟相关ＣＯＰＤ之间是否存在相关性。结果　研究　发现ＥＤＮＲＢ基因一３０Ｇ／Ａ处基因型频率分布在ＣＯＰＤ组和对照组之间差异有统计学意义（Ｐ＜　０．０５），但等位基因频率的分布在两组之间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。在对ＣＯＰＤ组和对照组　中吸烟者的基因型分布频率和等位基因分布频率比较后，发现两组之间差异无统计学意义　（Ｐ＞０．０５），提示该突变位点与吸烟所致的ＣＯＰＤ之间可能无相关性存在。结论ＥＤＮＲＢ一３０Ｇ／Ａ　位点多态性可能与ＣＯＰＤ易感性相关，与吸烟相关的ＣＯＰＤ无关。　［关键词］慢性阻塞性肺疾病；　内皮素受体Ｂ；单核苷酸多态性；等位基因　

Ａ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ＥＤＮＲＢ　ｇｅｎｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ＣＯＰＤ　ａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ｓｍｏｋｉｎｇ　ＨＮ　Ｑｉ，ＬＩＡＮＧ　Ｙｏｎｇｆｉｅ，ＲＥＮＴａｏ，ｅｔ　ａ１．ＴｈｅＰｕｌｍｏｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ　ｏｆＳｈａｎｇｈａｉＥａｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００１２０，　Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｗｔｅｅｎ　ＥＤＮＲＢ　ｇｅｎｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ａｎｄ　ＳｌｌＳ—　ｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ＣＯＰＤ　ａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ｓｍｏｋｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｅｓ　Ｗｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｓｉｔｅ　ｏｎ　ＥＤＮＲＢ一３０Ｇ＞Ａ　ｗｉｔｈ　ＰＣＲ—ＲＦＬＰ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ａｎａｌｙｓｅｄ　ｔｈｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｌｌｅｌｅ　ｉｎ　ＣＯＰＤ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｅ　ａｌｓｏ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｉｓ　ｐｏｌｙｍｏｐｈｉｓｍ　ｓｉｔｅ　ａｎｄ　ｓｍｏｋｉｎｇ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ＣＯＰＤ．Ｒｅｓｕｌｔ　Ｗｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｓｉｔｅ　ｏｎ　ＥＤＮＲＢ一３０Ｇ＞Ａ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＣＯＰＤ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜０．０５），　ｗｈｅｒｅａｓ　ｔｈｅ　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＣＯＰＤ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞　０．０５）．Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ｏｆ　ｓｍｏｋｉｎｇ　ｐｅｒｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＣＯＰＤ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｉｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＥＤＮＲＢ一３０Ｇ＞Ａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｍｉｇｈｔ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ＣＯＰＤ　ａｎｄ　ｍｉｇｈｔ　ｈａｖｅ　ｎｏ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｍｏｋｉｎｇ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ＣＯＰＤ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｃｈｒｏｎｉｃ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅ；　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｂ；　Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏ—　ｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；　Ａｌｌｅｌｅ　

ＣＯＰＤ是由遗传和（或）环境因素造成的一种复杂　的多基因、多因素性疾病。遗传性危险因素被认为是　该疾病的一种易患因素。内皮素受体Ｂ（ＥＤＮＲＢ）为　内皮素的特异性受体之一，主要介导内皮素一１（ＥＴ．１）　的气道收缩、黏液分泌、气道重塑以及炎症反应的作　用。ＥＤＮＲＢ基因的第４外显子．３０　Ｇ／Ａ处存在单核　苷酸多态性，有研究发现该处多态性位点是人类在诸　如烟雾暴露或哮喘等诱发因素下导致气道阻塞的一个　重要因素¨　。因此，本研究中我们将ＥＤＮＲＢ作为候　选基因，探讨其在ＣＯＰＤ发病易感因素中的可能作用　及与吸烟之问的相关性。　基金项目：上海市卫生局青年科研项目（２００９Ｙ０８０）　作者单位：２００１２０上海，同济大学附属东方医院呼吸内科　对象与方法　・５３９・　・论著・　１．对象　（１）ＣＯＰＤ组８１例，为２００９年１月～２００９年６月　在我科明确诊断为ＣＯＰＤ急性加重期　的住院患者，　其中男６５例，女１６例，年龄５Ｏ～７９岁。此外根据吸　烟问卷调查将ＣＯＰＤ组患者分为吸烟组（吸烟指数≥　１００年支）与非吸烟组，其中吸烟组４７例，非吸烟组３４　例。所有患者均根据中华医学会呼吸学会２００７年制　定的ＣＯＰＤ诊断标准　确诊。并符合下列标准：①无　哮喘史，吸人沙丁胺醇４００　ｇ后ＦＥＶ　％预计值的可　逆性＜１２％。②无合并严重心、肝、肾等系统疾病。③　胸片未见其他胸部疾病。　（２）对照组７７人：为本院门诊健康体检者，其中　临床内科杂志２０１１年８月第２８卷第８期Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ，Ａｕｇｕｓｔ　２０１１，Ｖｏｌ。２８，Ｎｏ．８　男６２人，女１５人，年龄５０～７５岁，并分为吸烟组４Ｏ　人，非吸烟组３７人。人选标准：经病史询问、体格检　查、胸片以及肺通气功能检查均未发现异常者。同时　无合并严重心、肝、肾等系统疾病。两组人选者的性　别、年龄比较差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５），具有可　比性。　２．方法　（１）标本采集：所有受试者晨起空腹采集外周静　脉血标本４　ｍｌ，注入ＥＤＴＡ管抗凝，一７０℃保存待测，　避免反复冻融。　（２）全血白细胞基因组ＤＮＡ抽提：取收集的外周　静脉血，严格按照ＴＩＡＮＧＥＮ试剂盒说明书步骤和注　意事项操作，避免样本问交叉污染。　（３）抽提的ＤＮＡ纯度分析：使用紫外分光光度计　检测所有样本ＯＤ２６ｏ／ＯＤ：　。值１．７～１．９之间，将样本　稀释到工作浓度１０　ｎｇ／ｍｌ，一２０％保存待用，并避免　反复冻融。　（４）ＰＣＲ扩增：参考文献…上游引物：５　Ｇ１１ＩＴｒｒＡ—　ＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡ　ＩＴＧＧ　ＴＧＧＡ—Ｔ３　（下戈Ⅱ线处为　

设计的突变核苷酸）。下游引物５　ＡＴＣＡＣＣＴＡＡＡＧ－　ＣＡＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧ３　（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＰＣＲ反应条件：反　应体系为２５　ｌ，预变性９４＂Ｃ　１０分钟，变性９４￣Ｃ　３０　秒，退火５４％４０秒，延伸７２￣Ｃ　４０秒，后延伸７２℃１０　分钟，共４０个循环。产物大小为１６１　ｂｐ。ＰＣＲ产物经　２％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察目标条带。　（５）基因分型：采用限制性片段长度多态性　（ＲＦＬＰ）法进行基因分型，将ＦＯＫ　Ｉ限制性内切酶　（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）加入ＰＣＲ扩增产物中，充分混合均匀，　３７℃水浴３小时，ＰＣＲ扩增产物经ＦＯＫ　Ｉ内切酶消化　后进行琼脂糖凝胶电泳可区分三种基因型：ＥＤＮＲＢ－　ＧＧ型可被ＦＯＫ　Ｉ酶消化，终产物为１２８　ｂｐ、３３　ｂｐ；ＥＤ—　ＮＲＢ．ＡＡ型不能被消化，终产物为１６１　ｂｐ；ＥＤＮＲＢ—ＧＡ　型为１６１　ｂｐ、１２８　ｂｐ、３３　ｂｐ。　３．统计学处理：采用ＳＰＳＳ　１１．０统计软件包进行　数据分析。计量资料用均数±标准误（元±ｓ）表示。　ＣＯＰＤ组与对照组间的计量资料比较采用ｔ检验。基　因频率采用基因计数法计算。基因型分布是否符合　Ｈａｒｄｙ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ遗传平衡定律及组问等位基因频率的　差异比较采用ｘ　检验。分析各位点多态性与患病风　险的关联以Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析所得的优势比（ＯＲ）及其　９５％的置信区间（ＣＩ）表示　

结　果　１．ＥＤＮＲＢ基因型频率分析：ＥＤＮＲＢ・３０Ｇ／Ａ处基　因型在ＣＯＰＤ组中以ＡＡ型为多，对照组中以ＡＧ型为　

多。基因型频率分布在ＣＯＰＤ组和对照组之间差异有　统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表１。各组基因型频率经　Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ遗传平衡定律检验，表明可以达到遗　传平衡（Ｐ＞０．０５），具有较好的群体代表性。　

表１　ＣＯＰ［｝组与对照组ＥＤＮＲＢ基因型频率的比较［例，（％）］　

注：与对照组比较，　Ｐ＜０．０５　此外，ＡＡ型与含有Ｇ等位基因的ＡＧ＋ＧＧ型基　因型频率在ＣＯＰＤ组和对照组之间差异有统计学意义　（Ｐ＜０．０５），Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析表明，其ＯＲ值为Ｉ．８９８　（９５％ＣＩ：１．００１～３．５９８）。见表２。　

表２　ＣＯＰＤ组与对照组ＥＤＮＲＢ合并基因型　频率的比较［例，（％）］　

注：与对照组比较，　Ｐ＜０．０５　２．ＥＤＮＲＢ等位基因频率分析：统计学分析发现　ＥＤＮＲＢ基因的．３０Ｇ／Ａ处等位基因频率在ＣＯＰＤ组和　对照组之问差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。见表３。　

表３　ＣＯＰＤ组与对照组ＥＤＮＲＢ基因的等位　基因频率比较［例，（％）］　组别　例数　等位基因频率　

ＣＯＰＤ组　１６２　对照组　１５４　１１１（６８．５２）　

９７（６２．９８）　５１（３１．４８）　５７ｆ３７．ｏ２）　

３．ＣＯＰＤ组和对照组中吸烟者的ＥＤＮＲＢ基因型　频率分析：对ＣＯＰＤ组和对照组中吸烟者进行基因型　频率分析后发现，在ＣＯＰＤ组中以ＡＡ型为多，对照组　以ＡＧ型为多，但两组之间差异无统计学意义（Ｐ＞　０．０５）。见表４。　

表４　ＣＯＰＤ组和对照组中吸烟者的ＥＤＮＲＢ　基因型频率［例，（％）］　

４．ＣＯＰＤ组和对照组中吸烟者的ＥＤＮＲＢ等位基　因频率分析：对ＣＯＰＤ组和对照组中的吸烟者进行　ＥＤＮＲＢ等位基因频率分析，发现两组之间的等位基因　频率的分布差异亦无统计学意义（Ｐ＝０．７０）。见表５。