癫痫大鼠海马锌含量及两种锌转运体表达的研究

http://www.paper.edu.cn - 1 - 癫痫大鼠海马锌含量及两种锌转运体表达的研究 杨丹1，2，刘宇3，王清华 1，李鸿飞4，孙凤1，王占友5，高慧玲5，蔡际群1 1中国医科大学药物毒理学教研室，沈阳 （110001） 2沈阳医学院药理学教研室，沈阳（110034） 3沈阳市公安局人口信息中心，沈阳 （110001） 4解放军第205医院，辽宁锦州（110034） 5中国医科大学组胚教研室，沈阳 （110001） E-mail：ld_love415@yahoo.com.cn 摘 要：目的 通过实验研究遗传性癫痫大鼠海马锌含量及两种锌转运体表达的改变与癫痫发生发展的关系。方法 以原子吸收光谱法检测大鼠海马锌元素含量；应用western blotting 和RT-PCR技术分析两种锌转运体表达。结果 遗传性癫痫大鼠海马锌含量及锌转运体1表达明显高于对照组，锌转运体3表达与对照组相比无明显改变。结论 遗传性癫痫大鼠海马锌元素含量增高可能与癫痫发生发展有关；锌转运体1表达上调可能在癫痫发生发展过程中起到保护神经元的作用。 关键词：癫痫；微量元素锌；锌转运体

1. 引言 锌是人体内重要的微量元素，其代谢紊乱可引起神经系统多种疾病，在一些神经损伤所致脑疾患中有重要作用。近年来，有关锌对癫痫的发生、发展的作用逐渐受到人们的重视。动物实验及临床资料表明癫痫的发病与体内锌代谢异常密切相关。 细胞锌转运途径由锌铁调空转运体ZIP（zrt,irt-like protein）和助阳离子扩散体CDF（cation diffusion failitator）两大锌转运体家族来完成。锌转运体1（zinc transporter,ZnT-1）为助阳离子扩散体CDF家族中的一员。ZnT-1定位于胞浆膜。细胞膜上的ZnT-1在细胞处于高锌环境时，可促使胞内锌外排，从而可维持细胞内适宜的锌水平。另外，除Zn2+以外的

其他离子成分的改变，如Ca2+，Cu2+，Mg2+，Na+，K+，Cl-等，对ZnT-1的锌外排作用几乎无影响，说明ZnT-1对锌的外排不受这些离子的干扰，是专一性的锌转运体[1]。 锌转运体3（zinc transporter,ZnT-3）是锌离子的专一性转运体。ZnT-3蛋白定位于突触囊泡膜上，提示其可能参与将锌转入突触囊泡，敲除ZnT-3基因的小鼠在其囊泡中不出现组化反应锌。ZnT-3促进胞浆内锌富集于囊泡中,一方面避免胞浆高锌可能产生的细胞毒性,更重要的是通过介导胞浆锌的跨囊泡膜转运,构成囊泡‘锌池’,伴某些神经递质(如谷氨酸、GABA等) 释放,调控神经元的信号传导,进而参与脑功能调节[2]。Cole等的研究表明,小鼠ZnT-3基因破坏后,海马神经元囊泡中锌含量下降,用药物诱发小鼠边缘系统癫痫,发现ZnT-3缺陷鼠对药物的敏感性远高于正常鼠,更易诱发癫痫,初步揭示了ZnT-3对海马中某些神经元的兴奋性具有间接抑制作用。而将ZnT-3基因和MT-3基因均切除的小鼠对海人酸所致癫痫的反应性与ZnT-3基因均切除小鼠表现相同，提示ZnT-3和MT-3作用于相同路径[3]。 自发性癫痫大鼠（spontaneously epileptic rat, SER）为双基因突变大鼠，由Tremor大鼠（TRM）杂合子（tm/+）和zitter大鼠（ZI）纯合子(zi/zi)杂交得到。出生8周后，SER自发性地出现癫痫大发作和小发作，对于抗癫痫药物的反应同癫痫患者类似，是研究遗传性癫痫的理想动物模型。 http://www.paper.edu.cn - 2 - 震颤大鼠(Tremor Rat, TRM）[4-5]是一种理想的研究癫痫小发作的动物模型。震颤大鼠为tm 基因突然变异的结果。断奶前的幼鼠发作时，全身及头部左右剧烈震动。7 周大时，在发作停止时可观察到其到脑皮质和海马出现5-7Hz 的多波峰波群放电，同时伴有失神样发作。TRM 鼠癫痫发作无性别差异。 野生型大鼠（wild type control, WTC）是TM同代无tm基因变异并且无癫痫发作的大鼠。 本实验将通过比自发性癫痫大鼠和震颤大鼠与野生型大鼠及正常wistar大鼠脑海马组织锌元素含量及ZnT-1、ZnT-3表达为揭示锌在癫痫发生发展中的作用提供更多的证据。

2. 材料和方法 2.1 实验动物、试剂与仪器 TM大鼠32只，SER大鼠16只，WTC大鼠24只，正常wistar大鼠18只。雌雄各半，均由中国医科大学实验动物部提供。 TRIzol(Invitrogen)、TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)试剂盒（TaKaRa biotechnology CO.LtD） 引物由TaKaRa公司合成。ZnT-1抗体（中国医科大学组胚教研室王占友教授惠赠）, ZnT-3（中国医科大学组胚教研室王占友教授惠赠），抗体辣根酶标记二抗（北京中杉公司），ECL（supersignal@ PIERCE）,硝酸（优级纯），其余试剂为国产分析纯。

PCR扩增仪（美国Biometra）,DYY-5型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器）,Tanon Eps300电泳仪,Centrifuge5810R低温高速离心机（德国，EPPendorf），胶片（柯达 MXG-1），原子吸收光谱仪（HITACHI 180-80）。

2.2 TM大鼠及WTC大鼠基因鉴定 取TM大鼠交配所生非SER两周龄幼鼠，取每只鼠鼠尾100毫克，Tris-饱和酚-氯仿法提取DNA，以tm基因特异性引物进行PCR扩增，扩增产物阳性者为TM大鼠，阴性者为WTC大鼠。引物上游5’-TTC AAC AGA GGA ATG GAT ACA GAA A – 3’,下游5’-CAC TCC ATG CTT CCT TTT CAA CAG C-3’，反应条件：94℃预5变性3分钟后，94℃变性30秒、54℃退火45秒，72℃延伸30秒，共扩增29个循环后72℃延伸分钟。

2.3 原子吸收光谱法测定大鼠海马中锌元素含量 大鼠断头，迅速冰上取海马。每只大鼠取海马称重后置于50毫升三角烧瓶中，加入两毫升硝酸，盖过组织，放置于70℃电热板上消化过夜。于三角烧瓶中滴加双氧水约1毫升至无色。将液体全部移入10毫升具塞刻度试管中，去离子水定容至10毫升。 测定条件：波长：213.8nm；灯电流：10mA；狭缝宽度：1.3nm；火焰高度：7.5mm；火焰类型：空气－乙炔；空气流量：9.4L/min；乙炔流量：2.0L/min。 锌元素标准溶液用分析纯锌粒配成1mg/ml的储备液，使用前用去离子水稀释成10µg/ml的溶液保存在塑料试剂瓶中备用。用Zn标准溶液（10µg/ml）于50ml容量瓶中分别配成标准系列浓度为0.00、0.050、0.10、0.20、0.30µg/ml。 加样量10µl,自动进样，微机自动绘制标准曲线。样品锌浓度（µg/g）=（测试值-空白值）*稀释倍数/样品重量（g） 玻璃仪器试管吸管均用盐酸＋高氯酸（3+1）溶液浸泡处理24h以上，用超声波清洗后双蒸去离子水冲洗干净，烘干备用。 http://www.paper.edu.cn - 3 - 2.4 Western blotting 半定量ZnT-1、ZnT-3蛋白表达 大鼠以20%乌拉坦腹腔麻醉后迅速冰上取一侧海马。提取每只大鼠海马组织膜蛋白。Lowry法进行蛋白定量。每个样品取30µg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。浓缩胶浓度5%，分离胶浓度10%，电压110V。电泳后将蛋白以50V电压稳流转印至PVDF膜上。脱脂奶封闭3小时后，加入以TBST稀释的ZnT-1抗 体（1：500），37℃放置2小时。孵育结束后，洗膜3次*10分钟。加入以TBST稀释的辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG（1：5000），室温轻摇两小时。TBST洗膜3次*10分钟。ECL发光显色。ZnT-3抗体（1：1000）4℃过夜，ZnT-3二抗为辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG（1：5000）。以GAPDH为内参。GAPDH抗体（1：20000稀释）4℃过夜。GAPDH二抗为辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG（1：5000）。

2.5 RT-PCR 半定量ZnT-1 mRNA表达 大鼠以20%乌拉坦腹腔麻醉后迅速冰上取一侧海马。置于经去RNA酶处理的1.5毫升离心管中，加入800µl TRIzol，按说明书操作，提取海马总RNA。取1µg总RNA，参照Takara公司RC-PCR试剂盒说明书进行，RT反应条件：42℃30min、99℃5min, 反应体积为10µl。PCR反应体积为50µl，除RNA样本外加所有试剂的反应管作为空白对照，以等量的DEPC水代替RNA样本。 PCR1：以β-actin为内参照，引物上游5’- GTGTTGTCCCTGTATGCCTCTG -3’，引物下游5’- TGTCACCGCACGATTTCCCT -3（220bp）。另设计一组引物专门分析ZnT-1 mRNA的表达,引物上游5’—GATGTTGAAGGAGTGGAGGAAGT-3’，引物下游

5’-GATTCGGGCTGTTTGTTTGG-3’（434bp）。反应条件：94℃预变性2分钟后，94℃变性30秒、56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增30个循环后72℃延伸10分钟。

2.6 统计学分析 各组结果以x±s表示，两组间比较用t检验。 3. 结果 3.1 TM大鼠及WTC大鼠基因鉴定

Fig 1 tm gene expression by PCR ，1.2.3.4.6.8 are TRM rats，5.7 are WTC rats. 3.2 原子吸收光谱法测定大鼠海马中锌元素含量 检测结果显示16只TRM大鼠及WTC大鼠脑单侧海马平均重量相近，均明显低于正常Wistar大鼠单侧海马重量（p<0.05）。正常Wistar大鼠及WTC大鼠脑海马锌浓度相近，明显低于TRM大鼠脑海马锌浓度（p<0.05）。所有大鼠均为10周龄。