绿色荧光蛋白的研究
绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析
绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG 分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
绿色荧光蛋白的结构与应用
GFP荧光持续时间较长，在450-490nm蓝光激发下，能保持 10min以上荧光。
03 GPF的应用
显像与示踪技术
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
由于GFP稳定无毒，所以可 使动物体内复杂结构可视化，使 得实验研究更加直观清晰。You 等通过GFP标记的裸小鼠，检测 GFP基因在小鼠各器官中的表达 状况，为选择疾病模型和移植供 体提供了依据。
报告基因
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
GFP由于具有光信号传导机制，可用 作活细胞内的荧光感受器。荧光感受器常 用于检测各种分子对生物的有效性，甚至 可以用于研究活细胞中蛋白质的构象变化。 在检测某物质对于某种生物是否有毒性方 面，GFP荧光感受器也有较大的利用价值。
荧光感C 受器
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
GFP
GFP的发光现象由其生色团决定，GFP表达后折叠，在有氧条件下 第66位氨基酸残基脱氢，使Ser65-Tyr66-Gly67环化形成对羟基苯咪唑啉 酮，即生色团。
02 GPF的优点
GPF的优点
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
性质极其稳定，高温、甲醛固定和石蜡包埋不影响其发光性 能，对强光或长时间光照都有较强的耐受能力，对大多数普 通酶有较强抗性。
GFP
Байду номын сангаас
目录
CONTENTS
01 GFP的结构
03 GFP的应用
02 GFP的优点
04 +
参考文献
01 GPF的结构
绿色荧光蛋白（GFP）的结构与应用
GFP
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激 发而发出绿色荧光的蛋白。
gfp绿色荧光蛋白序列_概述及解释说明
gfp绿色荧光蛋白序列概述及解释说明1. 引言1.1 概述GFP（绿色荧光蛋白）是一种具有独特发光特性的蛋白质，被广泛应用于细胞和分子生物学领域。
其绿色荧光可以通过外源激活而观察到，使得科学家们能够可视化细胞内发生的过程，并实时跟踪靶标分子的定位与转移。
GFP的序列是理解其结构、功能以及应用关键的基础。
1.2 文章结构本文将从多个方面对GFP绿色荧光蛋白序列进行概述及解释说明。
首先，我们将介绍GFP的历史和发现过程，以及其在现代生物学中的重要性。
随后，我们将详细探讨GFP序列的组成和编码基因信息，并解析与功能相关性方面的研究进展。
最后，我们将阐述GFP序列在生物学研究中的广泛应用，并就目前存在的问题和未来发展进行思考。
1.3 目的本文旨在提供有关GFP绿色荧光蛋白序列的全面概述及解释说明，深入探讨其组成、结构、功能和应用，并对其未来发展进行展望。
通过本文的阐述，读者将能够更好地理解和应用GFP序列在生物学领域中的价值，为相关研究提供指导和启示。
同时，我们也希望通过此文促进对GFP技术的探索和创新，推动生物科学的不断发展。
2. GFP绿色荧光蛋白序列概述2.1 GFP简介GFP（Green Fluorescent Protein）绿色荧光蛋白是一种来自于海洋水母的蛋白质。
它的主要特点是能够发出绿色荧光，并且在非生物致死条件下仍然保持稳定。
由于这些特性，GFP成为了生物学领域中一种广泛使用的标记工具。
2.2 GFP的发现历程GFP最早是在1960年代末期由奥斯汀·盖因斯、罗德南·麦迪安和道格拉斯·普里肯特等科学家在研究水母Aequorea victoria时发现的。
他们观察到当GFP暴露在紫外线下时会发出绿色荧光，并且将其提取出来进行进一步研究。
随后，科学家们发现GFP能够自身形成一个染色体，而不需要其他辅助物质。
2.3 GFP的结构特征GFP的序列长约238个氨基酸残基，具有高度保守性。
绿色荧光蛋白的研究进展
绿色荧光蛋白的研究进展作者：杨慧敏， 李文刚， 吴高锋， 魏娟， 王鑫作者单位：杨慧敏,吴高锋,魏娟,王鑫(河南农业大学,郑州,450002)， 李文刚(郑州牧专,郑州,450011)刊名：中国畜牧兽医英文刊名：CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：2008，35(8)引用次数：1次1.方六荣.陈焕春表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性[期刊论文]-中国兽医学报 20012.李夏.陈素文.喻达辉绿色荧光蛋白及其在转基因动物研究中的应用[期刊论文]-南方水产 20053.范伟兴.宋建兰表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK突变株的构建[期刊论文]-畜牧兽医学报2003(05)4.林爱星.刘小军.陈永福绿色萤光蛋白及其在转基因表达检测中的应用 1997(03)5.岳莉莉.齐义鹏.社会胜用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HB Ve抗原[期刊论文]-病毒学报 1998(03)6.Chafee I.Too Y.Euskirchen G Green fluorescent protein as a marker for gene expiree 19947.Fleckenstein J M.Holland J T.Hasty D L Interaction of an outer membrane p rotein ofenterotoxigenic Escherichia coliwith cell surface heparan sulfate proteoglycans 2002(03)8.Galipeau J.Li H.Paquin A Vesicular stamatitis delivery in experimental brain cancer 1999(12)9.Grignani F.Kinsella T.Mencarelli A High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein 1998(01)10.Heim R.Cubitt A B.Tsien R Y Improved green fluorescence 1995(6516)11.Heim S.Freeman R B J.Eulitz C Auditory temporal processing deficit in dyslexia is associated with enhanced sensitivity in the visual modality 2001(03)12.Ikawa M.Kominami K.Yoshimura Y Green fluorescent protein as a maker in transgenic mice 1995bas Y A.Gurskaya N G.Yanushevich Y G Diversity and evolution of the green fluorescent protein family 200214.Loimas S.Toppinen M R.Visakorpi T Human prostate carcinoma cells as targets for herpes simplex virus thymidine kinase-mediated suicide gene therapy 2001(02)15.Ogawa H.Inouye S.Tsuji F Localization,trafficking,and temperature Dependence of the Aequorea GFP in culture dvertebratet 199516.Rasher D C.Eckerd S W W Primary structure of The Aquaria Victoria green fluorescent protein1992(02)17.Valdivia R H.Alexander E H Applications for green fluorescent protein (GFP) in the study of hostpathogen interactions 199618.Wang S.Hazelrigg T Implications for bed mRNA localization from spatial distribution of exuprotein in Drosophila genesis 1994(6479)1.期刊论文罗文新.陈敏.程通.管宝全.李少伟.李少菁.张军.夏宁邵橙色荧光蛋白--绿色荧光蛋白GFPxm的改造-生物工程学报2003,19(1)最近报道了从大型多管水母中分离出新的gfp基因.经大肠杆菌表达并纯化出的绿色荧光蛋白(GFPxm)具有476nm的激发峰和496nm的发射峰,但是只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用.这里进一步报道GFPxm的12种突变型.在大肠杆菌中的表达结果表明,有7种突变型在37℃条件下产生高的荧光强度.在25、32和37℃条件下表达6 h,GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的相对荧光强度均高于增强型绿色荧光蛋白(EGFP),而GFPxm16和GFPxm163在42℃高温表达时仍能保持高的荧光强度.这7种突变型中的4种在哺乳动物细胞中已获得良好表达.此外,有6种突变型的荧光光谱红移,目前所达到的最长激发峰为514nm、最长发射峰为525nm.另外有3种突变型具有包括紫外在内的两个激发峰,1种突变型只有单一的紫外激发峰.首次报道具有橙色荧光的突变型OFPxm,它的激发峰为509nm、发射峰为523nm.523nm属于黄绿色,但肉眼看到的蛋白为橙色.OFPxm在高温下可得到高水平表达且很好地成熟,但是因为低的量子产率而荧光强度相对较低.2.学位论文左妍四环素-绿色荧光蛋白生物传感器的构建及活性测定2004将来源于水母的绿色荧光蛋白基因(gfp)和来源于E.coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因(tetR)共同构建到E.coli表达载体pET-30a+上,使融合蛋白两部分蛋白间插入不同长度肽联,获得TetR C-端与GFP N-端融合蛋白:TR∷GFP和TR∷GFPs.在E.coli BL21中诱导表达并纯化了两种形式的融合蛋白.TR∷GFP(蛋白间间隔19aa)保留了GFP的荧光特性,即在395nm激发,可以510nm附近有最大发射峰.在四环素存在时,TR∷GFP在400nm-700nm范围内的荧光强度普遍增强,在510nm处增幅最大,由原来1.132增至2.214,增幅为95.6﹪,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大,表明TR∷GFP,能感受外界四环素.TR∷GFPs(蛋白间间隔5aa)具备GFP荧光性质,但不具备感受四环素能力.对其中GFP部分定点突变(T203Y),获得发射荧光红移的突变融合蛋白(TR∷GFPsm).在E.coli BL21中诱导表达并纯化了TR∷GFPs和TR∷GFPsm,TR∷GFPsm经395nm激发,在526nm处出现最大发射峰;在四环素存在时,TR∷GFPsm在400nm-700nm范围内荧光强度普遍增强,以526nm处增幅最大,由原来20.33增至41.6,增幅为104.6﹪;而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响幅度较小,表明TR∷GFPsm,能感受外界四环素.用不同浓度的tc滴定TR∷GFPsm,显示4.1218μM的TR∷GFPsm随着tc浓度的增加,荧光强度相应呈指数增长,最终达到饱和.初步说明TR∷GFPsm具有tc生物传感器性质.为了使TetR与四环素结合所产生的构象变化能更好地传递给GFP,将TetR插入到GFP171aa-172aa,构建了GFP与TetR中间融和蛋白GFP()TR,在E.coli BL21中诱导表达,该融合蛋白失去荧光性质.为了获得对四环素更为敏感的传感器,用易错PCR构建了TR∷GFP和TR∷GFPsm突变体库,初步摸索了平板筛选荧光突变体的方法.3.期刊论文左妍.杨克迁四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定-生物工程学报2005,21(1)将来源于水母的绿色荧光蛋白基因(gfp)和来源于E.coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因(tetR)共同构建到E.coli表达载体pET-30a+上,获得TetR C-端与GFP N-端融合蛋白.对经诱导表达并纯化后的融合蛋白(TR::GFP)进行荧光发射光谱分析表明,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性,即在395 nm激发下,可在510 nn附近有特征发射峰.在加入四环素后,融合蛋白在395 nm激发下,在400 nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化,荧光强度普遍增加,且以510 nm处最大发射峰增幅最大,由原来1.132增至2.214,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大,结果表明该融合蛋白,能感受外界四环素,并产生一定的荧光变化.4.学位论文邹奇大鼠肝卵圆细胞移植对暴发性肝衰的治疗作用及示踪研究2007目的：建立成年大鼠肝卵圆细胞增殖模型，进一步进行卵圆细胞的分离、纯化、鉴定和培养；利用绿色荧光蛋白基因转染和荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色两种方法进行标记，比较两种方法标记细胞的可行性；随后选择较优标记方法标记的卵圆细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭大鼠，探索卵圆细胞移植治疗暴发性肝衰的可行性及有效性。
绿色荧光蛋白的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白的基因克隆和表达研究（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）摘要：目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
方法：通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG 诱导GFP基因表达，可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
结果：结果显示构建的重组质粒pET-28a-GFP在E.coli中成功表达。
关键词：绿色荧光蛋白；质粒重组；原核表达；诱导表达中图分类号：Q53Studies On Cloning and Expression of Green FluorescentProtein geneAbstract: Objective:Studies indicated that the cloning and expression of the GFP gene in the E.coli. Methods:Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N3) and DH-5α(pET-28a). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pET-28a-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR transfected into E.coli DH-5α to ensure the expression of green fluorescent protein. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of GFP into E.coli for expression, through transformative method. The expression of GFP gene can be induced by the IPTG and then we can see green. Results: The results suggest that pET-28a-GFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords: G ed Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression绿色荧光蛋白的基因克隆和表达的研究引言随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用教学资料
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。
转化 筛选及复筛及酶切验证
PCR检测 IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测目的蛋白
包涵体检测 分离纯化
电泳检测 酶切
pET28a质粒酶切位点选择
实验用品及方法介绍
方法介绍
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等
绿色荧光蛋白和荧光素发光原理
绿色荧光蛋白和荧光素发光原理1. 引言：荧光的魅力说到发光，大家脑海中是不是会闪现出五光十色的景象？比如夜空中的星星、深海中的生物，甚至是那些可爱的小虫子们。
今天，我们就来聊聊“绿色荧光蛋白”和“荧光素”的发光原理。
这俩家伙可不简单，它们在科学界可是赫赫有名！就像小朋友们喜欢的超级英雄一样，它们都有各自的“超能力”。
那么，这些荧光家伙到底是怎么让我们眼前一亮的呢？2. 绿色荧光蛋白（GFP）2.1 GFP的起源绿色荧光蛋白，简称GFP，最初是从一种海洋水母中发现的。
想象一下，这水母在海里游来游去，随时随地都能发出迷人的绿色光芒，简直就像海底的明星！后来，科学家们把这个神奇的蛋白提取出来，发现它在研究生物体时可以发挥大作用。
比如，它可以标记细胞，帮助研究人员观察细胞的活动，真是个无敌的小帮手。
2.2 GFP的发光原理那么，GFP是怎么发光的呢？这就要提到它的结构了。
GFP里有一种叫“色氨酸”的氨基酸，平时看起来毫不起眼，但它一遇到特定的光照，就开始“激动”起来。
经过一番“舞动”，它就会释放出能量，变成美丽的绿色光芒。
就好比一颗小星星在黑夜中闪烁，光彩夺目。
这种发光过程，我们称为“荧光”。
而且，GFP是相对稳定的，能在细胞中长时间发光，所以它被广泛应用于各种生物研究中。
3. 荧光素（Fluorescein）3.1 荧光素的介绍说到荧光素，大家可能觉得这个名字听起来有点陌生，但它可是在化学界里炙手可热的存在！荧光素是一种合成染料，颜色多样，最常见的当然是鲜艳的绿色。
它广泛应用于医学、环保监测，甚至是材料科学。
这玩意儿就像一位多才多艺的明星，能够在不同的场合展现自己的才华。
3.2 荧光素的发光原理荧光素的发光原理和GFP有点相似，但又各有千秋。
它的分子结构里有多个共轭双键，这些双键就像一条条“小桥”，让电子在分子间自由游走。
当荧光素被激发光照射时，这些电子就会快速跃迁，随后又很快回到原来的状态，同时释放出能量，形成荧光。
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《生物工程进展》1997,Vol.17,No.4
绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物
岳莉莉 齐义鹏(武汉大学病毒学研究所 武汉430072)
摘要 从多管水母属Aequorenvicturia分离出的绿色荧光蛋白(GFP)
,因其特有的生物
化学性质及该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广阔前景。本文就其研究进展及其应用进行简要综述。关键词 GFP 荧光 基因表达 突变株 应用
基因的表达或蛋白质的定位及时序的变化常需要用荧光物质作为标记。这种标记也是免疫荧光和免疫组化的基础。传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上,但是化学计量和染料附着的部位难于控制,因此尚需再次纯化。若该蛋白需用于活细胞内检测,最关键的问题是如何使其通过细胞膜。现在可用分子生物学的方法产生荧光蛋白,以取代传统的标记方法。常用的有荧火虫和细菌的荧光素酶基因,但由于它们都需要底物和辅助因子,因而在活体组织中的应用受到限制。由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质,且该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光,使其在生命科学中的应用具有美好的前景。本文就其研究进展进行简要综述。 一、绿色荧光蛋白的生物发光现象早在六十年代初期,Shimomura等[1]首先从多管水母属(Aequoriavictoria)中分离出一种称为aequoria的蛋白,该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光,当时称为光蛋白(photoprotein)。它是分子量为20kD的单一多肽链,在其发光前,1Mol的aequoria结合3Mol的钙离子及1Mol非共价键结合的腔肠动物荧光素。尽管光蛋白体系本身发射蓝光,然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色,推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)[1,2]。
Morise
等[3]对GFP进行了分离和纯化,他们的实验结果表明,GFP的荧光发射峰在509nm,最大激发波长为395nm,并在475nm处有一肩峰。当将Ca2+加入到含低浓度GFP的aequorin溶液中时,光谱接近于aequorin发射的蓝光(Κmax
472nm);而将aequorin和GFP
按大自然比例
混合时,加入Ca
2+
,则光谱接近于活体的发射
光(Κmax509nm
)。推测在活体内
,GFP
通过荧
光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程,吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光。Aequorea发光系统分子间的能量转换过程如下:
AequorinCa2+BFP3+blueLightGFP↓激发GFP3+
greenlight(BFP为蓝色荧光蛋白)
二、GFP的生色基团从jellyfishAequoreavicioria分离出的GFP分子量约27230kD,为一单链多肽,它的生色基团(chromophore)
在各种苛性条件下
(如热、极端pH、化学变性剂)都很稳定,比如用
04酸、碱、或盐酸胍处理,一旦恢复中性pH环境,
或是除去变性剂,荧光就可恢复并具有和原来一致的发射光谱[5,6]。绿色荧光蛋白独特的生物化学性质暗示它含有特殊的结构,它的生色基团和另外一种荧光蛋白——藻胆蛋白(Phyco2biliproteins)的生色基团完全不同,它是由链内几个被修饰的氨基酸残基经共价键连接而成。最初由Shimomura提出,并被大家所公认的生色基团化学结构见图1[7,8]。
图1.AequoreaGFP的生色基团化学结构示意图 构成生色基团的3个氨基酸:Ser-dehy2droTyr-Gly位于第65—67位,生色基团由丝氨酸—脱水络氨酸—甘氨酸形成的对羟苯甲基咪唑环酮(42P2hydroxybene252imidazolinone)构成,其上游第8个氨基酸为色氨酸,不寻常的是这个色氨酸的荧光是检测不到的,可能是它和生色基团之间的能量转移阻抑了色氨酸荧光(320—350nm),这个色氨酸附近有多个脯氨酸残基(Pro2Val2Pro2Try2Pro),它的重要性现在还不明了,但从蛋白质数据库(PIRver25;Swiss2Protver14)中只找到细胞色素P2450蛋白具有这种结构[9]。 三、GFP基因的克隆及特征为了探索GFP发光的奥秘,传统的生物化学技术一直没有得到满意的答案,进入九十年代,采用分子生物学手段研究GFP,才使其有了重大突破。1992年,Prasher等[9]根据GFP的氨基酸序列合成了相应的寡核苷酸片段,以此作探针从A.Victoria的cDNA文库[10,11]中筛选出了gfp的几个阳性克隆,并对EcoR1片段的全序进行了分析,该序列有三个特征:1.此cDNA共有965个核苷酸,而用Northernblot证实的gfpmRNA全长是1105kb。215′末端非编码区很短,只有26个核苷酸。31无Poly(A)
尾,而gfpmRNA则有Poly(A)
尾。从
cDNA
的序列推算:gfp含有一个开放阅读框,编码238个氨基酸,分子量为26888kD,同经SDS—PAGE测定的天然GFP的分子量(27230kD)比较接近。由于用来构建基因文库的A.victori2
a基因组DNA来自于大量的jellyfish组织,电泳纯化的GFP显示至少有三种主要的同分异构体,其紫外吸收率(A395A280)均在1110～
1125[8]。根据限制性酶切和Southernblot分析
这些阳性克隆,也发现至少存在有三种不同的内切酶图谱,因而可能存在三种不同的gfp基因,见图2。与前述的gfp序列相比,gfp2基因在216kb的DNA片段上,至少有3个外显子(、、),分别编码69、98和71个氨基酸,推测在该基团组的上游可能还有一个外显子。生色基团的氨基酸残基位于外显子的3′末端。目前尚不清楚这些cDNA是否来源于不同的gfp
基因,但它们的核苷酸和氨基酸确有不同之处。见表1。
14图2.三种Aequoreagfp基因的限制性酶切图谱双线代表可与gfpicDNA杂交的DNA片段
表1 不同gfp克隆编码区序列比较A.与gfp2基因不同的核苷酸序列B.氨基酸不同处
aa位置gfp2基因gfp10基因gfp1基因gfp10cDNA12(8个沉默)100TyrPheTyrgfp1cDNA2(2个沉默)108SerThrSer141MetLeuMet
219IleVal
四、发光机制的研究GFP基因的克隆为探索GFP的发光机制打下了坚实的基础。人们很自然地想到GFP在异源细胞内能否形成生色基团?在受到激发后能否产生特征性的绿色荧光?1994年2月Chalfie等人[12]以“绿色荧光蛋白作为基因表达的标记”为题在Science上发表了他们在大肠杆菌和线虫体内表达GFP的初步结果,当期的封面也登载了他们的照片。通过测定重组GFP的荧光光谱发现,它和提纯的天然GFP光谱完全一致。随着GFP基因分别在大肠杆菌[12,13]、线虫[13]、酵母[14]、果蝇[15]、昆虫细胞[16]和cos细胞[17]内的表达成功,说明GFP的生色基团在没有A.victoria其它产物存在的异源细胞内可以自发形成,其发光不需要特殊的辅助因子参与。但是荧光形成的机制究竟是什么?荧光的产生与蛋白质的结构有何关系?荧光的特性能否被改变?依然亟待解决。为了解决这些问题,
Heim等[18]将GFP基因的编码区插入到
pGE2
MEX22表达质粒T7启动子下游并诱导其表
达,在不同的时间和条件下测定重组GFP的荧光谱,结合SDS2PAGE分析,提出其发光机制如下:
翻译后的GFP前蛋白在有氧条件下,Gly267位与Ser265的羧基环化形成第5位碳原子上的咪唑基,新的N=C双键促其脱氢连接成生色基团,第5位碳上的咪唑基再自身氧化与第4碳形成双键,从而构成完整的生色基团。它24的自身环化与氧化过程见图3。图3.GFP生色基团的生物合成机制示意图[17] 虽然Aequorea和Renilla的GFP有相同的生色基团,且有相同的发射光谱(Κmax509nm),但两者的吸收光谱不同(Aequarea的GFP有两个吸收峰:395nm和475nm,而Re2nilla的GFP只有一个:498nm,其消光系数比前者高出10倍)。Ward[19]认为不同的吸收光谱是其分子微环境不同造成的。已知Aequorea的GFP是30kD的单体,而RenillaGFP为54kD的二聚体。在实际应用中发现,RenillaGFP的长波激发优于AequoreaGFP,但尚未得到Reniliagfp基因的克隆。然而AequoreaGFP长波吸收峰(475nm)的优点是有较大的光稳定性,且更适合于标准的荧光滤镜,缺点是振幅较低。为了增强荧光亮度使它更适合于应用,Heim等[16]用羟胺(hydroxylamine)处理使
GFPcDNA随机突变,或在PCR扩增GFP编码区时加入MnCl2增加其错配率,将产物再插入pGEMEX22表达质粒,从中筛选出3个有意义的突变株:H9在398nm处、P9和P11在471nm
处的荧光强度增加。这些突变株的单个
氨基酸替换均位于GFPC′末端,远离生色基团;而第4个突变株:P4用紫外光激发,可产生鲜艳的蓝色荧光,它是由于生色基团中心的Try266变成了His266的缘故,见表2。
表21AequoreaGFP突变株的特性GFP突变最大吸收波长(nm)最大发射波长(nm)相对荧光强度(%)野生型无396(476)508(503)100
H9突变株Ser202→PheThr203→Ile398511117P9突变株Ile167→Thr471(396)502(507)166P11突变株Ser167→Thr471(396)502(507)188P4突变株Tyr66→His38244857W突变株Tyr66→Trp458480(未测)
考虑到Ser65位于生色基团2对羟苯甲基咪唑环酮的氨基端,为了证实Ser65在脱氢形成乙烯基侧链假说中的作用[20],他们于1995年又在Nature上发表了实验结果[21]。出乎意外的是,当将Ser65分别突变成Ala、Leu、Cys
或Thr,都在470—490nm处有单一的吸收峰,
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