细胞永生化实验服务
细胞及组织培养的准备工作
细胞及组织培养的准备工作一、实验目的1.掌握细胞培养的基本概念2.了解细胞培养的基本条件3.掌握清洗和消毒的基本方法4.学习细胞培养使用液的配制及准备方法二、实验原理1.细胞培养的基本概念细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。
细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。
细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。
2. 组织细胞培养的优点能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。
通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。
在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程。
3. 组织细胞培养的不足之处培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。
培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响。
长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。
4. 细胞及组织培养的基本条件（1）无污染的环境条件：物理污染；化学污染；生物污染。
（2）适当的温度：35－37℃(人和哺乳动物细胞)（3）气体环境与pH环境：pH7.2-7.4(人和哺乳动物细胞)（4）营养条件（5）其它条件：等渗条件、附着底物5.清洗与灭菌（1）清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。
微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。
因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。
玻璃器皿的清洗组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。
一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
细胞生物学在药物研发中的应用
基因表达。
信号传导异常与疾病发生关系探讨
癌症
癌细胞中常常出现信号传导途径的异常，如酪氨酸激酶受体信号途径的过度激活，导致 细胞增殖失控和肿瘤形成。
神经退行性疾病
如阿尔茨海默病和帕金森病等，与神经元内信号传导途径的异常有关，如G蛋白偶联受 体信号途径的失调。
炎症性疾病
炎症反应涉及多个信号传导途径的激活，如NF-κB信号途径在炎症反应中发挥重要作用 。
基因过表达与沉默
通过基因过表达或RNA干扰等技术，上调或下调特 定基因的表达，观察细胞表型变化，揭示潜在药物 靶标。
单细胞测序技术
结合单细胞测序技术，分析单个细胞的基因 表达谱，发现特定细胞类型的特异性药物靶 标。
高通量筛选技术在靶标验证中应用
高通量测序技术
利用高通量测序技术对大量样 本进行快速、准确的基因表达 分析，验证潜在药物靶标的表 达情况。
创新药物开发
通过细胞命运调控技术，可以设计和开发能够精确调控细胞命运的创新药物， 为疾病治疗提供新的解决方案。
THANK YOU
感谢聆听
100%
酶
药物作为酶的底物或抑制剂，影 响细胞代谢和生理功能。
80%
DNA/RNA
药物直接作用于细胞核内的DNA 或RNA，影响基因表达和遗传信 息传递。
细胞生物学在药物研发中重要性
靶点发现
通过研究细胞生物学过程，发现新的药物作用靶 点。
药物筛选
利用细胞模型筛选具有潜在治疗作用的候选药物 。
安全性评估
该技术能够模拟人体器官的三维结构 和生理功能，为药物评价提供更接近 生理状态的模型。
药物评价
利用类器官培养技术，可以观察药物 在类器官中的代谢、分布和药效学反 应，为药物研发提供重要参考。
端粒酶
端粒酶抑制剂用于肿瘤治疗的研究新进展近年来，肿瘤细胞永生化的“端粒—端粒酶学说”已为越来越多的研究结果所证实。
端粒酶是唯一的一种以自身RNA序列为模板将端粒重复序列复制添加到染色体3′末端的核蛋白酶。
许多研究结果表明：人类85%～90%的肿瘤细胞的端粒酶活性呈阳性，端粒酶的激活及端粒长度的稳定与肿瘤、衰老的发生和发展有密切关系，针对端粒酶基因的调控可以通过抑制端粒酶的活性来抑制肿瘤的生长并促进其凋亡，具有对肿瘤细胞特异性的作用，是肿瘤靶向治疗的一个新的研究方向。
本文中对端粒、端粒酶的结构和功能，端粒酶活性的调控，端粒酶与肿瘤和衰老的关系，端粒酶抑制剂的最新研究进展以及在肿瘤等疾病治疗中的应用前景进行综述和分析，为进一步开发天然来源的端粒酶抑制剂、研发肿瘤靶向治疗新药提供参考。
1.端粒与端粒酶1.1端粒端粒（T elomers）为真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质组成，其DNA 含有大量的TTAGGG n串联重复结构，其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体融合、重组和降解，起着保护染色体末段的作用。
端粒是线性DNA，它的末端会随周期性的复制而逐渐缩短。
Muller1于1938年首次发现这一结构并将其命名为端粒（T elomers）。
由于末端复制问题，细胞每分裂1次，端粒就缩短50～100，当端粒缩短到临界长度时，细胞就会出现衰老以致死亡，因此在正常真核细胞中，端粒可被看成是“生命的时钟”或“有丝分裂的计数器”2。
1.2端粒酶端粒酶(T elomerase) 是一种由RNA和蛋白质组成的特异核糖核酸蛋白复合体，具有逆转录的酶活性，能以自身的RNA为模板5’-CUAACCCUAAC-3’通过逆转录合成端粒重复序列并连接到染色体末端以补偿细胞分裂时端粒的缩短，使细胞获得无限增殖能力3。
端粒酶的主要功能是：①通过自身的RNA 模板、催化亚单位和辅助蛋白将端粒DNA 添加到染色体的末端；②维持和平衡端粒序列长度；③修复断裂的染色体末端4。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法：1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测：1典型的生化特征：DNA 片段化2检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法：1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测：1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响；3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞；亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标：磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1用苏木素-伊红HE染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1细胞体积变小,全面皱缩；2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项：细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS：磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液：H2O2 ；PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配：Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O 1000ml7、％二氨基联苯DAB溶液：DAB 5mg；PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、％甲基绿：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml;9、100％丁醇,100％、95％、90％、80％和70％乙醇,二甲苯,10％中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理：1石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug／ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇：乙酸2：1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 × 107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1～5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的％DAB溶液,室温显色3～6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100％正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理：吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光＞580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液：AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液：Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液：将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果：活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液：20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液：甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果：在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织：有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液；标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟；23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟；3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟；5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法：凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下：每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级;阳性对照：经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照：切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞：凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制：100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。
细胞系的建立及鉴定
细胞系：
有限细胞系，人的正常组织多数可以建立有 限细胞系。如间充质来源的成纤维细胞，牙 髓细胞、牙髓干细胞、牙周膜细胞等
无限细胞系，永生化细胞系，肿瘤细胞系
细胞系/细胞的鉴定
细胞系的建立：
1.组织块方法
2.单层细胞法
原代培养
传代培养
大量扩增细胞后用于实验研究
使用前对细胞的组织特异性进行鉴定
形态学：多核细胞
牙髓干细胞：需多少个指标证实
干细胞表面标志：CD44,STROL 1,MUC18 ,alpha-SM actin
多潜能功能鉴定： 成骨细胞功能： 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性检测：采用 Gomarri 法测定细胞内碱性磷酸酶的活性。
细胞体外矿化能力的检测：细胞经矿化诱导
剂处理后，用von Kossa染色法观察细胞在体外 形成矿化物沉积的能力。
除一般生物学性状外
1. 不死性，代次， 2. 细胞特性的改变： 3. 转染基因的鉴定：PCR, Southern blot ,
证实HPV-16/18 DNA 4. 成瘤性实验：免疫缺陷动物皮下细胞移
细胞悬液的制备
要求：5个浓度的细胞悬液分别是： 10000个；8000个；6000个；4000 个；2000个/100ul/孔 每个浓度3个复孔
丧失生长抑制性
当培养细胞所需任何一种关键性营养物质或生长因子 降到阈值以下时,正常细胞的生长即受到抑制,如异 亮氨酸,磷酸盐,上皮生长因子等。
转化的细胞对一些生长因子需求降低,或失去了对激素 和生长因子的需求，在营养不足的情况下可继续生 长,它们甚至可以杀死一些自身的细胞,以便在不可 能生存的环境下继续生长。或者由于某些转化产生 了生长因子类似物,为自身提供了生长因子。
碧云天生物技术产品说明书：GES-1 (人胃上皮细胞)
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线：400-168-3301或800-8283301订货e-mail：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站微信公众号GES-1 (人胃上皮细胞)产品编号产品名称包装C6268 GES-1 (人胃上皮细胞) 1支/瓶产品简介：Organism Tissue Morphology Culture Properties Homo sapiens (Human) Stomach Epithelial Adherent本细胞株详细信息如下:General InformationCell Line Name GES-1 (Human Gastric Epithelial Cells)Synonyms GES1Organism Homo sapiens (Human)Tissue StomachCell Type －Morphology EpithelialDisease －Strain －Biosafety Level* －Age at Sampling 9FMGender －Genetics －Ethnicity －Applications －Category Transformed cell line* Biosafety classification is based on U.S. Public Health Service Guidelines, it is the responsibility of the customer to ensure that their facilities comply with biosafety regulations for their own country.CharacteristicsKaryotype －Virus Susceptibility －Derivation －Clinical Data －Antigen Expression －Receptor Expression －Oncogene －Genes Expressed －Gene expression databases GEO: GSM1152880; GSM1152881; GSM1152882; GSM1152883; GSM1152884; GSM1152885; GSM1923245; GSM1923246; GSM1923247; GSM1923248; GSM1923249; GSM1923250Metastasis －Tumorigenic －Effects －Comments －Culture Method Doubling Time －Methods for Passages Wash by PBS once then 0.05% trypsin-EDTA solution and incubate at room temperature (or at 37ºC), observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 1 to 5 minutes)Medium RPMI-1640+10% FBSSpecial Remarks －Medium Renewal －Subcultivation Ratio －Growth Condition 95% air+ 5% CO2, 37ºCFreeze medium DMEM (high glucose)+20% FBS+10% DMSO，也可以订购碧云天的细胞冻存液(C0210)。
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端粒和端粒酶与肝细胞的永生化
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粒 酶 介 导 的端 粒 延 长作 为 细 胞 中端 粒 缩 短 的 主要 补 偿 机 制 ，对 正 常细 胞
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细胞爬片免疫组织化学染色注意事项
2．PBS洗 3．0.3%双氧水封闭10分钟。 4．PBS洗 5．滴加一抗37℃孵育2小时。 6．PBS洗 7．滴加通用二抗。 8．PBS洗 9．DAB显色
二、实验过程中应注意的一些问题
细胞载体的处理： 盖片和载片在接种细胞前一定要处理好， 不要怕麻烦。盖片和载片入酸前要将所附 着的脏东西洗干净。过蒸馏水和酒精时要 用镊子一片一片的过，平放在干净滤纸上 自然干燥。包装好后经烤箱干烤消毒保存。
2．细胞种植时应注意的一些问题：
选用何种载体：细胞在盖片和载片上一般4小时就 可以贴壁并开始生长，如果细胞贴壁后不需再进 一步处理，则可以将细胞爬在载片上，载片不用 消毒，也可以用DAKO笔在载片上画圈。用 DAKO笔划过圈的载片最好不要干烤消毒。细胞 帖壁后还要加药继续培养若干时间的则应选用盖 片爬片，这时盖片最好选用160度干烤消毒。
不要放在木制的片盒里，尤其是新的木 制片盒，木制品里的甲醛会影响抗原的表 达。如果放在新的木制片盒,要做恢复抗原. 细胞爬片制好后最好马上染片.
细胞的亚建康对实验结果的影响
当我们培养细胞时,细胞长得很差时我 们会把它们扔掉,不会用它们做进一步 的实验.但长得不太好,我们观察细胞时 有时分辨不出来,就可能使我们白做工, 既浪费了时间又浪费了 经费.这是一个 值得我们注意的问题.
此爬片由于该盖片 处理得不好,虽爬上 细胞但细胞的形态 很差,表现在细胞膜 和细胞器边界不清 晰
U251MG培养细 胞 (10hr)扫描电镜图
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细胞转化
细胞转化 一,细胞转化的基本概念
细胞转化是细胞发生遗传性改变而导致细胞永生化的转变方式,由限定性细胞系转变成连续性传代细胞系,获得了永生化
二,细胞转化与恶变的区别 转化:只是遗传特性,生长特性,生物学性状改变,但无致瘤性 恶变:是细胞癌性变,有致瘤性 三,细胞转化的方式 1.细胞自发转化:体外培养的细胞在无任何诱变剂存在的条件下,细胞自发出现的转化现象. 2.人工诱发转化(人工诱变):在体外培养的细胞中,常因化学,物理和生物等各种致癌因素的影响,而使细发生转化,转化周期大大缩短,转化率高.
四,细胞转化的基本过程 1.诱发(Initiation)阶段 诱变剂直接接触细胞(6小时以上最高不超过24小时),诱变剂种类多如:物理因素:如放射线,温度,电磁波,药物等化学因素:如甲基胆蒽,土醌80,7.12—二甲基苯醌(DMBA),3-甲基胆蒽,甲基甲磺醌(MMS),乙基甲磺酸(EMS),乙基亚硝基脲(ENC),甲基硝基亚硝基胍类化合物等;生物因素,如毒素,黄曲霉素,病毒SV40,EB病毒,多发瘤病毒(Polioma),逆转病毒等促癌剂(Promotor) :如TPA 2.DNA的损伤与修复阶段 修复过程中发生修复错误,引起DNA结构的改变,细胞发生了遗传性改变. 3."转化灶"的产生 进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分(大约5%左右),这些细胞称为癌前细胞(Precancerous Cell),均散在未受损伤的细胞中,随着细胞的继续培养,那些未受损伤的正常细胞由于接触抑制的限制而停止运动,细胞分裂消失,但那些散在的癌前细胞由于失去了接触抑制,加上生长繁殖速度变快,而进行持续不断的分裂增殖,由于在局部癌前细胞的数量增多而堆积,呈厚厚的多层排列,最后形成了明显可见的"转化灶"(Focus),常见有灰白细胞堆积中心点和放射排列的灶
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细胞永生化实验服务
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实验技术原理：衰老是体外培养的哺乳动物细胞的一般特性。从动物或人的组织细胞 取材
培养，体外经过第一次传代后的具有增殖能力的细胞群体称为细胞系。一些细胞系在体外有
一定寿命，只能有限期传代，一般不超过50代，称为有限细胞系； 另一类体外培养的细胞
经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力、可以无限
传代的细胞系称为永生化细胞系。【晶莱生物】
实验操作流程：
1、原代细胞的获取 ；
2、永生化基因慢病毒包装、纯化（永生化慢病毒量5X10E7TU，滴度≥1X108TU/ml）；
a.永生化基因慢病毒质粒大抽
b.永生化基因慢病毒重组质粒和包装质粒共转染293T细胞，收集病毒上清
c.过滤上清液
d.慢病毒浓缩和纯化
e.慢病毒滴度检测
3、永生化基因慢病毒感染原代细胞；
4、永生化细胞的筛选。
实验注意事项：
客户提供：
1、提供新鲜的肝素或者EDTA抗凝的外周血；
2、提供新鲜的培养细胞，提供新鲜组织，需要实验室制备成单细胞悬液。
交付标准：
1、永生化细胞
2、完整项目报告（材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果）
其他：
1、体外培养细胞经过自发的或受外界因素的影响而从增殖危机中逃逸，细胞获得持续生长
增殖能力的特性.永生化的细胞具有无限增殖生长性，可长期传代，并多伴有核型改变。
2、 原代细胞永生化后即获得无限增殖的能力，但它们没有恶性转化的表型特征，即不能在
软琼脂上形成克隆(锚着独立性生长)，也不能在裸鼠皮下成瘤。如果细胞在 永生化的基础
上发生更多的分子突变事件如癌基因的活化、抑癌基因的失活、表观遗传突变等，这些突变
在细胞中不断累积，达到一定的负荷时，细胞就可能发生恶 性转化，因此细胞永生化实际
上可以看作是细胞转化前的一个特殊阶段。
3、目前普遍认为细胞永生化是细胞恶性转化的必经阶段，因为所有的肿瘤细 胞都具备无限
分裂的特性。也就是说永生化细胞有可能是肿瘤细胞的前奏，它和肿瘤细胞都是无限增殖的，
但是永生化细胞无成瘤性，肿瘤细胞有成瘤性质，它们在 癌基因的活化、抑癌基因的失活、
表观遗传突变等方面分子方面应该有很多不同
4、永生化细胞和肿瘤细胞：虽然二者均可无限增殖，永生化细胞没有肿瘤具有的浸润性和
转移性 。
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