分子标记研究价值及创新点
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
【国家自然科学基金】_微卫星分子标记_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
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微卫星分子标记 常染色体显性 屠宰性能 居群遗传结构 奶牛 大豆 多样性分析 多态性频率 多态信息含量 基因表达 基因组原位杂交 基因组 坛紫菜 北京鸭 分子育种 分子定位 养殖群体 关联分析 产羔性状 中甸牦牛 whbe兔封闭群 ssr scar标记 sativa qtl l.) fiasco castanea mollissima 1bl/1rs易位
科研热词 微卫星标记 微卫星 遗传多样性 遗传多态性 表达序列标签 猕猴桃 遗传变异 微卫星dna 小麦 基因定位 est-ssr 黑龙江省 黑龙江 黑斑狗鱼 黄绿叶 鸭 醇溶蛋白 遗传结构:遗传多样性 遗传定位 遗传图谱 遗传分析 遗传分化 连锁分析 近交f5代 视网膜色素变性 表达序列标签(est) 行为性状 芥菜型油菜 线粒体控制区 简单重复序列(ssr) 等位性测定 种质资源 种皮颜色 研究进展 相关分析 番鸭 牙鲆 湖羊 海岛棉 泌乳性状 泉水鱼 水稻(oryza 水电站 母羊可能生产力 梅花鹿 桃蚜 标记辅助育种 染色体组 杂合度 显性核不育 微卫星荧光标记 微卫星序列
科研热词 推荐指数 微卫星 7 遗传多样性 5 微卫星标记 5 微卫星dna 3 小麦 3 黄花柳 1 黄牛,分子育种 1 鲤鱼 1 预后 1 陆地棉 1 长穗偃麦草 1 铜鱼 1 遗传图谱 1 迟发性脊椎骨骺发育不良 1 连锁分析 1 跨种pcr扩增 1 赤点石斑鱼 1 表达序列标签(est) 1 螨类系统学 1 茎结构特性 1 芝麻 1 腾冲雪鸡 1 肉用性能 1 线粒体d-loop 1 纤维品质 1 简单重复序列(ssr) 1 等位基因共享分析 1 研究进展 1 白粉病抗性 1 白粉病 1 癌,肝细胞 1 湖羊 1 湖北钉螺 1 模拟分析 1 核酸序列分析 1 来源 1 条锈病 1 杂合性缺失 1 杂合度 1 普通小麦 1 日本大耳白兔 1 新西兰兔 1 抗病基因 1 抗性基因 1 抗倒伏 1 微卫星锚定聚合酶链反应 1 微卫星富集 1
黄瓜白粉病抗性基因挖掘结论及参考文献
02
材料与方法
试验材料
黄瓜品种选择
选用具有不同白粉病抗性的黄瓜 品种，包括高抗、中抗和感病品 种。
病原菌株
采集多个地区的黄瓜白粉病菌株 ，确保试验具有广泛的代表性。
试验方法
接种方法
采用喷雾法或涂抹法将病 原菌接种于黄瓜叶片上， 接种后置于适宜发病的环
展望与建议
深入研究抗性基因作用机制
01
进一步探讨黄瓜白粉病抗性基因的作用机制，为黄瓜
抗病育种提供更加精准的理论指导。
拓展抗性基因应用范围
02 将所发掘的抗性基因应用于其他作物抗病育种中，提
高作物的整体抗病水平。
加强野生资源保护利用
03
加大对野生黄瓜种质资源的保护力度，合理利用野生
资源，为黄瓜抗病育种提供更多的遗传资源。
05
结论与展望
主要研究结论
黄瓜白粉病抗性基因成功定位
通过遗传分析和分子标记辅助选择，成功将黄瓜白粉病抗性基因定 位在特定染色体区域。
抗性基因功能验证
利用转基因技术和基因编辑技术，验证了所定位的抗性基因在黄瓜 抗白粉病中的功能，并明确了其作用机制。
发掘新的抗性资源
在野生黄瓜种质资源中发掘到新的白粉病抗性基因，为黄瓜抗病育 种提供了新的遗传资源。
抗性基因在育种中的应用前景
1 2
抗性基因的利用
将抗性基因应用于黄瓜育种中，有望培育出具有 白粉病抗性的新品种，提高黄瓜的产量和品质。
基因聚合育种
通过基因聚合技术，将多个抗性基因聚合到同一 植株中，进一步提高植株的抗病性和适应性。
3
转基因育种的安全性评价
国家重点研发 种质创新及新品种选育指南
国家重点研发种质创新及新品种选育指南1. 引言1.1 概述种质创新是指通过各种手段和技术对种子进行改良和优化，以培育出具有更强抗病性、适应性和产量的新品种。
随着农业科技的飞速发展，国家对于种质创新及新品种选育的重视程度也在不断加大。
本文将深入探讨国家重点研发项目关于种质创新及新品种选育的指南。
1.2 文章结构本文共分为五个部分，包括引言、种质创新的重要性、新品种选育流程与关键环节、技术手段在新品种选育中的应用以及结论与展望。
通过这些内容来系统地介绍国家重点研发项目关于种质创新及新品种选育的相关指南。
1.3 目的本文旨在全面了解国家对于种质创新及新品种选育工作的支持政策以及相关科学方法和技术。
同时，通过对不同环节和流程进行详细阐述，希望能够提供一个指导性参考，促进我国农业领域科学研究水平和生产效率的提升。
以上是“1. 引言”部分的内容。
2. 种质创新的重要性2.1 定义与概念种质创新是指通过收集、保育和利用种质资源，通过遗传改良方法和技术来培育出具有优异性状、抗逆性强或者其他特殊特点的新品种。
种质创新是现代农业发展中不可或缺的环节，对于提高农作物产量、品质和抗病虫害能力具有极大的意义。
2.2 种质创新对农业发展的意义种质创新在农业发展中起着至关重要的作用。
首先，种质创新可以提高农作物的产量和品质。
通过选取具有良好遗传基础的优良材料进行交配与育种，可以获得更好的后代并且增加了植物个体间的遗传多样性，从而提高了农作物的适应力和生产潜力。
其次，种质创新可以提高农作物对环境变化及病虫害等逆境的抵抗能力。
随着全球气候变暖以及各种疾病和害虫问题日益严重化，培育具有抗逆性强的新品种将成为保障农作物生产稳定性和可持续发展的重要手段。
此外，种质创新对于实现农业可持续发展也有着重要影响。
通过优化植物基因组，可以降低农药和化肥的使用量，减少对环境的污染，提高农作物品质和安全性，推动绿色农业的发展。
2.3 国家对种质创新的支持政策为了促进种质创新的发展并推动现代农业的进步，国家制定了一系列支持政策。
阐述林木育种的作用及问题和建议
阐述林木育种的作用及问题和建议一、林木育种在林业建设中的地位和作用总体来讲，我国林木育种工作绩效较为突出，不过较之先进国家，还存在很多缺陷，例如：选育树种单一。
以前优选树种时，只关注干形好、生长速度快等因素，而对材质、抗性等其他因素顾虑较少，以至于已经确立的这些良种，无法满足立地条件、不同造林用途对林木良种的需求。
由于当时未进行种源试验或试验结果不科学，导致所选的优树，选择区域不在适宜种源区内选择具有一定的盲目性。
那些不适宜种源区的优树材料来建园，其后代无法与适宜种源区的树木的后代相比；育种进程缓慢。
虽然我国良种基地建设起步较早，不过由于多种因素存在，特别是近年来，建设资金缺乏，延缓了基地建设速度，基地建设还处于初级园水平。
这可能要晚于先进国家10-20年时间；种质资源下降。
森林无止境的采伐与利用，使得一些种质资源濒临灭绝，尤其是珍稀阔叶种质资源，已经愈来愈少。
培育良种离不开种质资源，透明需要经历长时间自然选择来形成。
种质资源的数量与质量及遗传的特性，对林木育种有着非常直接的影响；树种结构不合理。
材林树种是目前最基本的良种基地建设树种，其中针叶树种是占绝大部分，而经济林树种和阔叶树种相对来说要少很多，特别是名、特、优树种稀少。
鉴于上述不足，林木两种无法满足绿化造林的具体需求，随着林业新领域、新技术的不断推广和运用，我省的林木育种工作也开始向高新技术方向发展。
林业跟农业差不多，种子是林业改革与发展的关键。
从孟德尔遗传学说及遗传原理形成期来看，林木育种在林业上的应用几乎是改变了整个传统林业。
改良林业上使用的种子或品种，改变林产品的数量和质量，可以促进森林的经济、生态和社会效益的提高。
以东北为例，早在60年代，选、引、育、繁的树种就有100多个，收集贮存可使用的优良基因型有5000多个。
通过林木良种审定委员会审核的林木良种达75个。
到1997 年底，共生产良种55万公斤，各种无性系繁殖条材25亿根。
建立时间较早的种子园，其经济效益都比较好，种子产量逐年增加。
育种优秀技术解决方案
育种优秀技术解决方案全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：育种是农业生产中至关重要的一个环节，通过对作物、家畜等生物的人工选择和繁殖，达到改良遗传性状、提高产量和品质的目的。
随着生物科技的发展，育种技术也在不断创新，各种优秀的技术解决方案不断涌现，为农业生产带来了巨大的发展机遇。
一、基因编辑技术近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术的广泛应用为育种领域带来了革命性的变革。
CRISPR-Cas9系统具有简单、高效、精准的特点，可以实现对作物和家畜基因组的定点编辑，从而快速获得具有特定遗传性状的新品种。
比如通过对水稻中致病基因的编辑，可以培育出耐病的抗性品种；通过对猪的生长发育基因的调控，可以提高猪的生长速度和肉质品质。
二、分子标记辅助育种技术分子标记辅助育种技术是利用分子标记与目标性状的遗传连锁关系，加速选择和育种过程的一种新技术。
通过对作物或家畜中关键性状的分子标记检测，可以快速、准确地筛选出具有目标遗传性状的亲本组合，从而加快新品种的培育速度。
分子标记辅助育种技术还可以帮助育种者进行精细的遗传背景分析，为遗传改良提供更准确的信息。
三、遗传多样性保护与利用遗传多样性是生物进化和适应环境变化的基础，也是育种成功的关键因素之一。
为了保护和利用遗传多样性，育种者可以通过采集、保存和鉴定野生种质资源，构建全基因组遗传资源库，以备不时之需。
还可以利用遗传多样性进行种质资源的交配改良，创造出更具适应性和抗逆性的新品种。
四、基于大数据和人工智能的育种技术随着信息技术的迅猛发展，大数据和人工智能技术在育种领域的应用也日益广泛。
育种者可以通过对大规模的遗传数据进行分析和挖掘，发现和利用遗传变异信息，加速新品种的培育过程。
人工智能技术还可以帮助育种者进行遗传背景的预测和优化设计，提高育种效率和成功率。
五、组学技术在育种中的应用组学技术，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学等，为育种领域提供了全新的研究手段和技术支持。
查新项目科学技术要点和查新点的填写与案例
查新项目科学技术要点和查新点的填写与案例查新项目的“科学技术要点”应充分反映出查新项目的概貌，简述项目的背景技术、要解决的技术问题、解决技术问题所采用的方案、主要技术特征、技术参数或指标、应用范围等相关技术内容。
（切忌与主要技术内容无关的空泛叙述以及修饰性、广告性宣传用语）一科学技术要点的撰写对各种目的的查新，从写法上要有所侧重：1．立项查新报告应概述项目的国内外背景，拟研究的主要科学技术内容，要研究解决哪些问题，达到的具体目标（指标）和水平。
博士生论文开题查新属于此类。
2．项目鉴定查新应简略说明项目的研究背景，介绍项目的主要科学技术特征，已完成项目与现有同类研究、技术、工艺相比所具有的新颖性所在，主要创新点，体现项目科学技术水平的数据和量化指标。
3．科学研究类项目应简要地说明项目所在领域的背景、发展趋势，阐明研究的意义、学术水平、主要创新和优点。
4．专利申报项目应阐明项目的主要技术特征或权项范围，与现有（专利）技术的比较，突出项目的创新内容。
5．开发类项目（产品、技术）应简述其用途、功能，介绍能反映其技术水平的主要工艺（技术组合）、成分、性能指标等数据，与国内外同类产品的参数对比，项目已达到的规模（小试、中试、工业化生产）及效益。
6．申报科技成果奖励项目应说明项目的国内外背景、基本原理和技术指标、与同类研究相比项目达到的水平、产生的经济效益和社会效益、推广应用前景。
二查新点和查新要求的撰写1查新点是技术要点中要求查证新颖性的部分，即体现该项目新颖性的全部技术创新点。
查新点一般从技术要点中提取，或者是技术要点中技术关键的全部，但不要把查新项目中的一般特征列为查新点。
查新点是查新人员拟定检索词和制定检索策略以至对比分析和判断新颖性的依据，写法上要精练明确，条理清楚。
有多个新颖性查证要求的项目，要以1、2、3来标记查新点，逐条列出，以便在查新结论中，分别针对每一个查新点作新颖性结论。
2查新要求可按下列方式（或其他方式）表述，如：（1）对本查新项目（查新点）的新颖性作出判断。
分子植物育种的原理与方法育种学课件
优势 精准选择 快速育种 多基因改良
局限性 技术成本高 公众关注和接受度 遗传多样性保护
分子植物育种在农作物种质资源创新中 的应用与前景
种质资源创新
介绍分子植物育种在农作物种 质资源创新方面的应用案例和 前景。
农作物产量提高
探讨分子植物育种对于提高农 作物产量和营养价值的潜力。
逆境抗性
讨论分子植物育种在培育抗旱、 抗病虫害的农作物方面的应用 前景。
解释不同类型的分子标记技术 （如SSR、SNP和AFLP）， 并说明其在育种中的应用优势。
介绍分子标记技术在构建遗传 图谱方面的应用，以支持基因 定位和分析。
辅助选择
探讨分子标记技术在育种中的 辅助选择方法，加速品种改良 和遗传进化。
基因编辑技术及其在植物育种中的应 用
CRISPR-Cas9系统
详细介绍CRISPR-Cas9系统的原理和操作步骤，以及其在植物育种中的应用前景。
分子植物育种的原理与方 法育种学课件
本课件介绍了分子植物育种的原理与方法，概述了基因组学的基础知识，并 探讨了分子标记技术、基因编辑技术、转基因技术在育种中的应用。也涵盖 了分子育种的优势、局限性以及其在农作物种质资源创新中的应用与前景。
分子植物育种的概述
简要介绍分子植物育种的起源和发展，重点强调其在农业领域中的重要作用，提出分子育种对于提高作 物品质、抗病虫害和适应环境的意义。
基因组编辑
说明如何利用基因编辑技术对植物基因组进行精确编辑，以创造或改良有益性状。
转基因技术在植物育种中的应用
1
转基因概念
概述转基因技术的原理和定义，并探讨其在植物育种中的应用潜力。
2
转基因作物
列举转基因作物示例，讨论其重要性和争议，并呈现相关研究的成果。
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分子标记研究价值及创新点分子标记技术的进展及其应用综述了分子标记产生与发展的过程,综合比较、分析了目前常用的RAPD、DAF、SSCP、AFLP、VNTR、RFLP、同工酶等分子标记技术的原理、特点和适用范围,简要介绍了分子标记技术的研究与开发现状以及未来的发展趋势。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但以一般性的意义而论,判断一种分子标记优劣的依据应当包括以下几方面的内容(如表1所列):PCR分析利用PCR技术的忠实性、效率和特异性可以极大地简化样品的收集与处理工作,同时也降低了对样品数量和质量的要求,通常几十纳克(ng)以内的DNA样品就足以应付分析的需要,这对于分子标记辅助育种、QTL定位等研究带来了很大的便利。
此外,PCR还可以锁定特定的目标DNA区域进行扩增,有利于后续工作的开展(序列测定、功能研究等)。
但是,同时也必须注意不严格的PCR条件的准确度(如RAPD)。
单位点标记理想的分子标记应当既具有单位点分析的精确性又具有多位点分析的效率和便利,单位点与多位点分析技术到目前为止还是难以协调一致的。
多位点分析(RAPD、DAF等)在技术上相当简单而高效,但存在显著的缺陷和局限性。
如显性遗传方式无法准确估计等位基因频率、杂和度等,在分子进化、种群遗传等结果准确性要求比较严格的应用受到严重制约。
而单位点标记(SSR、RFLP等)虽然分析结果可靠但工作效率却较低,不可能在大规模的遗传分析中广泛应用。
共显性表达分子标记最重要的属性之一。
只有共显性表达方式的分子标记才能进行各项精确的遗传分析并满足各个领域研究发展的需要。
数据的连续性/通用性涉及分子标记技术的精确度和重复性。
在许多研究领域,包括QTL定位、系统演化、分子进化等等,都需要往往是一个实0引言遗传与变异是生物进化的基础,也是生物学研究的核心问题。
分子标记是以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异的一种有力工具。
在分子标记技术诞生以前,宏突变(macro2mutation)由于具有显著的表型效应,是用于观察、研究生物遗传变异及其规律的最重要的手段。
但是,尽管某些宏突变生物个体在实验室中比较易于得到,自然界中却非常罕见,其原因是宏突变对于生物个体而言绝大多数都是有害的,因而会为自然选择所淘汰[1]。
这极大地限制了人们对生物进化的过程和内因的深刻认识。
虽然自然界里宏突变产生的几率是相当低的,但这绝不意味着生物群体不存在大量的变异,实际上,最为常见的变异就是由多基因(polygenes)控制的、呈连续分布的表型变异。
随着当代生物技术水平的提高,更深层次的遗传变异被大量地揭示,使人们对生物进化的认识产生了质的飞跃。
这一跨越就是依赖直接检测蛋白质乃至DNA分子水平遗传变异的分子标记技术的发展而实现的。
以20世纪50年代同工酶的发现为开端[2],伴随着生命科学领域理论与技术所取得的重大突破,尤其是DNA双螺旋结构的阐明、PCR技术的诞生,使分子标记技术从蛋白质、酶向DNA分子水平逐步深化,至今已衍生出不下几十种、用于不同研究目的的分子标记。
验室无力而且也不可能独自承担的大量的分子标记用于研究,良好的数据连续性/通用性是保证分子标记有效应用的前提。
变异检测范围与分辨力:一个好的分子标记能够检测的变异数目应当是无限制的,也就是同时拥有良好的分辨力,这样才能客观地反映生物实际的变异水平,不至于把目的DNA掩盖起来。
其它需要考虑的因素诸如一次可检测的位点数、技术复杂程度与易用性等的对分子标记的影响是容易理解的,在此不再赘述。
由于现有的分子标记没有一种能够取得全面的、理想的效果,因此,针对需要解决的问题选择合适的分子标记技术意义十分重大,对研究结果的产生、分析和应用有着决定性的影响。
以下就各种常用分子标记技术的原理、技术本身的优缺点与应用范围作一简要介绍,以期为相关领域的工作开展提供参考。
表1常用的分子标记及其主要特征标记类型线粒体、叶绿体标记DNA序列RFLP核基因组多位点标记SSR/VNTRRAPDAFLPDAF核基因组单位点标记同工酶(等位酶)SSRVNTRDGGE/TGGESSCPPCR几乎所有基于PCR扩增对任意未知基因组DNA模板序列的多态性进行检测的分子标记技术都是建立在合成的随机寡聚核苷酸引物所产生的特征性指纹图谱基础上的。
用较短的引物(一般为10bp左右)扩增基因组DNA通常都能够得到随机分布在整个基因组上的多重扩增产物。
这一现象使三种分子标记技术得以建立:RAPD[7]、AP2PCR[8]以及DAF[9]。
它们所依据的原理是基本一致的,即模板DNA在94℃变性解链后,在较低的退火温度)引物与模板DNA互补形成双链结构,下(如37℃如果基因组DNA两个位点间为可扩增的距离(约200～4000bp),同时引物以3’末端相对的方式分别位于两条互补链上,即可通过延伸、循环得到一个扩增产物。
这个扩增产物在通常情况下可被视为基因组上的一个位点。
就某一特定引物而言,它与基因组结合位点的序列互补,决定了扩增产物也是具有—100—一定特异性的,如果不同个体在结合位点上的序列因突变存在差异,或者两个结合位点间由于DNA序列的插入、缺失造成距离变化,就会形成扩增产物的出现/消失或长度变异等多态现象,从而成为指示基因组DNA多态的分子标记。
由于一个随机引物在基因组DNA上与其互补序列相结合的位点是有限的,不可能反映出总体的变异状况,通过使用大量不同的随机引物,就可得到许多的扩增产物(位点),使检测范围涵盖整个基因组,从而形成生物的特征性指纹图谱。
可以看出,上述分子标记技术由于使用的是随机引物,因此一方面免除了其他如微卫星标记引物设计的繁琐、复杂,另一方面又不存在种属特异性,同样的引物可应用于任何一种未知基因组中去,因而在DNA分子多态的检测中得到广泛的应用,如DNA、RNA指纹图谱、遗传连锁图谱的构建,分子标记辅助育种,系统发育与分子进化,种群生物学,以及疾病检测等许多方面[9]。
虽然RAPD等分子标记技术有其独特的优势,但在实际应用中也必须注意到他们固有的缺陷。
短的引物序列只能通过较低的退火温度寻求较高的结合几率,这样做虽然提高了扩增产物的数量,使其一次检测的“位点”可以达到几十甚至数百个,但这种方式是以降低PCR反应的忠实性为代价的,它可使误配的几率大大增加,检测到的变异实际是非遗传的或根本不是目标生物的,有时假阳性的比例甚至可以达到60%[12]。
另一个根本性的限制因素是显性表达机制,只能用电泳条带的有无而不是等位基因识别多态,无法区分杂合子,对于结果准确性要求比较高的研究,还需要通过Southern转移来加以验证,因此在应用于亲缘关系很近(种属以下)的物种/同种种群中才有较高的可信度。
112RFLP(限制性酶切片段长度多态性)RFLP是较早产生的基于DNA多态的分子标记技术。
它所检测的DNA 分子多态来源于:(1)突变形成的、决定限切片段数量的限制性内切酶酶切位点位点的存在与否,(2)两个限切位点间因DNA插入、重排或缺失造成的长度变异。
经典的RFLP标记是模板DNA经过限制性内切酶消化、电泳分离、Southern转移后,再用DNA探针进行杂交后得到的,整个的处理过程比较冗长,步骤繁琐,有一定的技术难度,因此在应用中尤其是需要大量分子标记的研究中受到限制。
但是,由于RFLP标记具有很高的分辨力,又以共显性的方式遗传,其结果有着很强的重复性和准确度,在高密度遗传连锁图谱、指纹图谱的构建、群体遗传与系统演化等研究领域仍然具有重要的应用价值[3]。
113AFLP(扩增片断长度多态性)AFLP是近年来迅速发展起来的一种分子标记AFLP集RFLP与RAPD两种分子标记技术的优势于一体。
由于使用了具有特异识别位点的限制性内切酶消化模板DNA,以及在3’末端加入了选择性核苷酸的半特异性引物,尽管同样是一种核基因组多位点分析的分子标记技术,它避免了RAPD分子标记重复性差、假阳性反应过高等不利因素的影响,同时,它又无需任何目的基因组DNA的背景资料即可完成模板DNA多态的检测,摆脱了RFLP繁琐的转膜、克隆、探针制备、分子杂交等一系列繁重而且有一定难度的工作。
因此,高分辨力、准确性和重复性使AFLP 目前已成为制作高密度连锁图谱、分子标记辅助育种、遗传多样性检测、系统分类、QTL定位、基因定位等的主要分子标记。
当然,AFLP 也同样存在一些技术上的不足,它所得到的主要是显性(约占多态位点数的85%～96%)而非共显性标记[4],制约了在相关领域的应用。
114 SSR/VNTR(简单序列重复或微卫星/数量可变串联重复或小卫星)SSR和VNTR是两类在基因组中大量存在的基因外的重复序列,其中SSR指由2～6个碱基组成的核心序列多次串联重复而成。
VNTR一般指核心序列较长,由十几到几十个碱基组成的串联重复序列。
由于这些重复序列的突变率很高(10-5～10-3),导致核心序列的的数目产生增减变化,在不同的个体间表现为DNA片段长度高度可变,因而成为极其丰富的限制性长度多态标记[11,13]。
基因组DNA经过酶切、Southern转移后,用微卫星作为探针即可得到具有高度个体特异性的指纹图谱。
由于微卫星序列在整个基因组中都有分布,产生的是稳定遗传的共显性标记,而且体细胞和生殖细胞在微卫星指纹图谱上完全一致,因此,尽管微卫星探针具有高度的种属特异性,使得探针的制备以及对未知基因组微卫星指纹图谱的构建具有相当的难度,需要投入大量的人力、物力等种种因素的限制,上述的巨大优势仍然使SSR/VNTR标记在医学、生命科学的相关领域高精度的分析中具有无可替代的价值,例如,利用SSR高度特异、高密度的指纹图谱,已经成功地获得了对虾抗病基因的分子标记,具有该标记的对下成活率显著提高,达到90%以上(对照组的成活率仅为5%)。
115SSCP/SNP(单链构向多态性/单核苷酸多态性)与蛋白质一样,单链DNA的二级结构由碱基组成所决定。
最初被称为SRFA(SelectiveRestrictionFrag2mentAmplification,限制性片断选择扩增)[14],它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来,并通过5’端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段从而形成指纹图谱的分子标记技术[6]。
它主要通过以下步骤来实现基因组DNA多态性的检测:(1)两个不同的限制性内切酶消化模板DNA(通常采用一个高频的和一个低频的限制性内切酶作为酶切组合);(2)限切片段末端连接到双链接头;(3)用与接头、限切位点序列互补的引物对连接产物进行预扩增;(4)预扩增产物再次用选择性引物扩增并加以标记,最终形成数量非常丰富的DNA扩增片段库(一对引物组合通常能够得到50～100个扩增产物)。