抗原与免疫血清的制备
抗血清制备原理、步骤及应用
抗血清制备原理、步骤及应用抗血清是一种含有高效价特异性抗体的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。
通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。
一、抗血清制备原理：将抗原注射于动物体，将引起免疫应答。
可刺激动物的淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体，待血清中积累大量抗体时，采集动物血液并分离析出血清，此即含抗体的免疫血清（抗血清）。
抗血清包括抗细菌、抗毒素、抗病毒血清。
二、抗血清制备步骤：1、选择免疫动物➢免疫动物一般选择青壮年期、健壮雌性个体。
➢抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
➢针对不同性质的免疫原选择相应的动物。
➢制备H血清用马，制备R血清用兔，制备补体用豚鼠血清。
２、抗原制备➢抗原剂量：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/mL，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。
➢免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。
通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100～1mg/次，合成免疫原为2mg（半抗原约为20～200μg），一般需要与等量的福氏完全佐剂混合。
加强免疫原与福氏不完全佐剂混合或不用免疫佐剂，剂量为首次计量的1/2。
➢抗原乳剂的配制：将等量的佐剂与抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，形成油包水乳剂。
制成的油包水乳剂直接影响免疫效果，因此使用前需进行质量检查。
检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整不分散，不合格的乳剂立即扩散，水面油亦逐渐扩大。
若检查不合格，则须继续操作至质量合格为止。
３、确定免疫方案➢根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。
可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。
免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径，对抗原的吸收速度为静脉=腹腔=淋巴结＞肌肉＞皮下＞皮内。
若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。
免疫接种剂量应根据分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。
鸡新城疫高免血清的制备
参考内容二
基本内容
鸡新城疫是一种高度接触性的传染病毒性疾病，对养鸡业和家禽业造成巨大的 经济损失。为了有效预防和控制鸡新城疫的传播，生产高质量的鸡新城疫灭活 疫苗至关重要。本次演示将详细介绍鸡新城疫灭活疫苗生产的关键环节质量控 制，包括生产流程、工艺参数、质量控制标准等，旨在提高生产厂家的责任意 识，确保疫苗的质量和安全性。
为了更好地说明鸡新城疫灭活疫苗生产关键环节的质量控制，我们以某生产厂 家的生产流程为例进行阐述。该生产厂家在生产过程中严格遵循了上述关键环 节的质量控制要求。在病毒培养环节，他们选择了合格的种毒，并在适宜的培 养基质和培养条件下进行了病毒的培养。在灭活处理环节，他们选择了有效的 灭活剂，并在适当的灭活时间和温度下进行了灭活处理。
3、静置30分钟后，观察结果，记录待检样品是否出现血凝现象。
二、阳性血清国家标准品的研制
为了提高鸡新城疫血凝抑制试验的准确性，我们需要制备阳性血清国家标准品。 首先，我们需要挑选具有代表性的鸡新城疫康复鸡，并采集其血液样本。将血 液样本通过特定工艺处理后，制备成国家标准品。制备过程中需要注意以下几 点：
鸡新城疫灭活疫苗是一种利用病毒灭活株生产的疫苗，具有高度的安全性和有 效性。疫苗的生产流程包括病毒培养、灭活处理、纯化、配制和包装等环节。 每个环节都需要严格的质量控制，以确保疫苗的质量和安全性。
1、病毒培养
病毒培养是鸡新城疫灭活疫苗生产的第一步，也是关键环节之一。培养病毒的 目的是为了获得足够数量的病毒，以便进行后续的灭活处理。在这个环节中， 病毒的种毒、培养基质和培养条件都需要进行严格的质量控制。种毒必须来自 于已经建立了毒种库的合格供应商，同时培养基质也需要经过严格的检验和灭 菌处理。另外，培养条件也需要进行严格的控制，以确保病毒的正常生长和繁 殖。
生物制品生产工艺—治疗类生物制品的生产
免疫血清的基本制备过程
动物的选择 免疫原的生产 制定免疫程序
免疫 血液的采集与血清的提取 测试、分装、保存 检验
纯化
以IBD为例，其卵黄抗体液的制备过程是，选择健康无病的产蛋鸡群， 以免疫原性良好的油佐剂灭活苗对开产前或已开产的蛋鸡，每只肌肉注射 2m1，7-10日后，重复注射一次，再过7-10日再注一次，油苗剂量适度递 增，第三次免疫后定期检测卵黄抗体水平，待琼扩效价达1:128时开始收 集高免蛋，4C贮存备用，琼扩效价降到1:64时停止收蛋。高免蛋合格时 间大约持续一个月。
免疫血清的应用
目前，虽然免疫血清的生产量不大，但是抗病血清的特殊作用仍是 不容忽视的。有些病的治疗虽然可以使用抗生素类制剂，而要彻底控制 和消灭传染病，在特定情况下，抗病血清的作用是抗生素不能全部代替 的。
免疫血清用作紧急预防注射，通常是在已经发生传染病或受到传染 病威胁的情况下使用，其优点是注射后立即产生免疫，疫苗是起不到这 种作用的。但是这种免疫力维持时间较短，一般仅2-3周，因此，在注射 血清后2-3周仍需再注射一次疫苗，才能获得较长时间的抗传染能力。
二、单价特异性抗血清
亲和层析法：杂抗原交联Sepharose 4B柱 吸附剂方法：借助双功能试剂用不含特异抗原的抗
原混合液制成固相吸附剂
几种重要免疫血清的制造
（一）破伤风抗毒素
选择5-12岁营养良好的马匹，先用破伤风类毒进行基础免疫，第一次 注射精制破伤风类毒素油佐剂抗原1m1（或明矾沉降类毒素10ml），第二 次注射2ml（或明矾沉降类毒素20ml），1-3个月后进行高度免疫。
动物免疫血清的制备
动物免疫血清的制备目的：探讨制备动物免疫血清的方法和效果，以适应其在实验教学中的需要。
方法：制备好的免疫原，按照一定的免疫程序(免疫途径、次数、间隔时间、剂量)接种给所选择的动物。
待动物体内产生抗体后，采集动物血液，分离血清对其效价进行测定。
结果：经免疫后的抗血清最终分别达到1：2040以上的高效价。
结论：此方法制备的抗血清效价高，特异性高，亲和力强，既经济又方便，适用于实验教学，提高了实验的开出率。
标签：免疫血清；免疫；免疫学试验；效价[文献标识码]B[文章编号]1674-4721(2009)12(b)-139-02动物免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术，广泛用于临床诊断、治疗和预防中，为教学、科研、检验之常用。
在医学免疫学教学中，形象、直观、简易的直接凝集反应有助于学生了解抗原、抗体及抗原抗体间的免疫反应等抽象的概念，免疫血清的质量直接影响实验的特异性和敏感性。
因此，制备高质量的免疫血清是建立高水平检测方法的前提条件。
但免疫血清的制备较复杂，且需学生动手操作，用量较大，为达到这一目的，除了具备理想的免疫原外，还需要选择适宜的动物和设计有效可行的免疫程序或方案。
通过多年的工作实践，笔者制备了高效价、高特异性、高亲和性的动物免疫血清，既经济又方便，供教学、科研所用，提高了实验的开出率。
1方法与结果1.1动物的选择及饲养制备抗血清的动物主要是哺乳类和禽类。
羊、马、豚鼠、兔都是常用的动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、要求以及动物个体等因素。
因不同动物对同一抗原的敏感性不同，免疫时至少取用2只以上动物。
选择制备免疫血清的动物必须是适龄、健壮、无感染的正常动物，体重最好在2～3 kg，年龄6个月以上，因雌性动物在性周期的不同阶段和怀孕、授乳时机体对抗原的敏感性有较大改变，所以一般挑取雄性动物。
动物免疫后要认真做好动物的编号、标记、管理和记录，本实验用的动物是健康家兔。
抗原抗体杂交所需抗体制备流程
抗原抗体杂交所需抗体制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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[讲解]高免血清的制备及效价测定
![[讲解]高免血清的制备及效价测定](https://img.taocdn.com/s3/m/2644263ae3bd960590c69ec3d5bbfd0a7956d5ee.png)
高免血清的制备及效价测定目的意义1、了解高免血清的制备过程；2、学习家兔采血的方法和血清分离方法；3、学习琼脂双向扩散法检测血清效价。
实验原理抗原进入机体后，被机体的抗原递呈细胞所识别并加以处理，递呈给B淋巴细胞，B淋巴细胞增殖、分化形成浆细胞，浆细胞分泌产生特异性抗体。
（示意图）该特异性抗体与相应抗原在电解质存在的情况下，在琼脂凝胶中相对扩散，相遇时结合形成肉眼可见的抗原抗体复合物，由于复合物分子较大，不能继续扩散，所以在琼脂凝胶中沉淀下来，形成肉眼可见的沉淀线。
此法可鉴定所制备的高免血清的特异性，并检测出其效价。
（示意图）。
实验材料实验动物：健康成年家兔，体重1.5-2.0Kg；药品：沙门氏菌油乳剂灭活苗（自制）；消毒酒精及碘酒；琼脂粉；硫柳汞、NaCL等；器械：剪刀、镊子、止血钳、三角瓶、平皿、打孔器等。
操作步骤1、家兔的免疫在家兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射含有完全佐剂的抗原0.1ml，抗原含量5mg/ml初次免疫；待两侧腹股沟淋巴结肿胀后注射含有完全佐剂的抗原0.1ml， 7-10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各2点、共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.5ml；7-10天后脊柱两侧重复注射1次；7-10天后试血，不合格者重复脊柱两侧注射。
2、琼脂扩散平板的制备称取一定量的琼脂按1%左右的比例加入生理盐水，加热煮沸充分溶解，稍冷后加入终浓度1/万的硫柳汞混匀，将上述溶液倒入平皿中，厚度约为2-3mm，待凝固后用打孔器在其上打中间一孔，周围六孔的梅花形孔，孔径为2mm，孔间距3-4mm，挑出孔内琼脂，注意不要挑破琼脂边缘，然后在酒精灯火焰上缓缓加热，使孔底少量琼脂溶化封住孔底。
3、试血取耳缘静脉血待凝固后分离血清，用生理盐水将血清作2倍系列稀释后加入梅花形孔周围孔，中间孔滴加抗原，以加满为宜，加毕后，盖上皿盖，将平皿置湿盒中，37℃扩散24-48小时，观察结果。
4、免疫家兔的采血方法有颈动脉放血和心脏采血。
免疫学课件：免疫血清学技术
抗体的生物学功能
抗体具有中和毒素、调理吞噬、介导炎症反应等 多种生物学功能。
抗原抗体结合机制
锁钥学说
ห้องสมุดไป่ตู้01
抗原与抗体结合就像锁和钥匙一样，具有高度的特异性和互补
性。
诱导契合学说
02
抗原与抗体在结合过程中，会发生构象变化，使得两者更加紧
力。
抗原的特异性
抗原与相应抗体或致敏淋巴细胞发 生特异性结合的物质基础。
抗原的分类
根据抗原性质不同，可分为完全抗 原和不完全抗原。完全抗原具有免 疫原性和特异性，而不完全抗原仅 具有特异性。
抗体结构与功能
1 2 3
抗体的基本结构
由四条多肽链组成，包括两条重链和两条轻链， 通过二硫键连接。
抗体的功能区域
密地结合在一起。
多重识别机制
03
抗原抗体结合不仅依赖于锁钥关系或诱导契合，还涉及到电荷、
疏水作用等多重因素。
03 免疫血清制备技术
动物选择与免疫方案
动物选择
选用健康、适龄、免疫原性强的实验动物，如兔、马、羊等 。
免疫方案
根据实验需求和免疫原性质，制定合适的免疫程序，包括免 疫剂量、免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
补体结合实验方法
补体结合试验（CFT）
在补体参与下，用已知抗原或抗体检测未知抗体或抗原的方法。该方法具有较高的敏感性和特异性。
间接补体结合试验
先用已知抗原致敏红细胞，再加入待检血清中的相应抗体，最后加入补体，观察红细胞是否溶解来判 断结果。该方法常用于检测某些病毒、立克次体等微生物的抗体。
免疫印迹抗体的制备
免疫印迹抗体的制备一、抗原的选择与制备。
1. 确定目标抗原。
- 根据研究目的选择合适的抗原。
例如，如果研究某种疾病相关蛋白，要选择该疾病特异性或高表达的蛋白作为抗原。
可以从基因数据库中获取目标蛋白的基因序列信息，以确保准确识别。
2. 抗原来源。
- 天然抗原：可以从生物组织或细胞中提取。
如从病变组织中提取特定蛋白，需要先将组织破碎，采用机械破碎（如匀浆器）或化学破碎（如使用裂解液）的方法。
然后通过离心、层析等技术进行纯化。
- 重组抗原：利用基因工程技术表达目标抗原。
首先构建含有目标抗原基因的表达载体，将其导入合适的宿主细胞（如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞）。
在宿主细胞中表达后，再通过亲和层析、离子交换层析等方法纯化重组蛋白。
二、动物免疫。
1. 动物选择。
- 常用的动物有小鼠、兔子、山羊等。
选择动物时要考虑抗原的性质、所需抗体的量和类型等因素。
例如，对于少量多克隆抗体的制备，小鼠或兔子较为合适；如果需要大量的抗体，则可以选择山羊等较大型的动物。
2. 免疫方案。
- 初次免疫：将抗原与适当的佐剂（如弗氏完全佐剂）混合乳化，使抗原缓慢释放，增强免疫反应。
通过皮下注射、肌肉注射或腹腔注射等途径将抗原 - 佐剂混合物注入动物体内。
- 加强免疫：初次免疫后一定时间（一般2 - 4周），进行加强免疫。
使用弗氏不完全佐剂与抗原混合，采用与初次免疫相同的注射途径，多次加强免疫（一般2 - 3次），以提高抗体的效价。
三、抗血清的收集与处理。
1. 抗血清收集。
- 在最后一次加强免疫后一定时间（如小鼠7 - 10天，兔子10 - 14天），通过心脏穿刺或颈动脉放血等方法收集动物血液，将血液收集到离心管中，室温静置一段时间（约1 - 2小时），使血液凝固。
2. 血清分离。
- 将凝固后的血液离心（如3000rpm，10 - 15分钟），吸取上层血清，即为抗血清。
可以将抗血清分装后储存于 - 20℃或 - 80℃。
四、抗体的纯化（针对多克隆抗体）1. 盐析法。
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- 1 - 抗原与免疫血清的制备 生态学院 生物科学11 徐立 8号 抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。 免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用[1]。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。 凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象[2]。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。这种结合反应的特异性可能是生物学中已知的最特异的反应[3]。 1 材料与方法 1.1 实验材料 24h培养的大肠杆菌斜面，8~12周龄的健康小鼠，兔子。 1.2 实验试剂 硫柳汞，0.5%石碳酸生理盐水，生理盐水，小鼠红细胞等抗原溶液，HRP-羊抗兔IgG，兔抗鼠IgG，
小鼠抗兔IgG抗血清，HRP-兔抗鼠IgG，包被缓冲液，洗涤液，稀释液，底物溶液，2mol/L H2SO4。 1.3 实验用具 McFarland比浊管，乙醇棉花，碘酒棉花，消毒干棉花，灭菌吸管，毛细滴管，小试管，大试管与离心管，1ml注射器(灭菌)，灭菌的离心管、微量滴定板，玻片，微量吸管(20~80 µl)，微量吸- 2 -
管的吸嘴，接种环、滴管、湿盒、酶标测定仪等。 1.4 实验方法
1.4.1 血细胞抗原的制备 采取兔子静脉血0.2ml，用肝素抗凝。低速离心，收集血细胞，用0.9% NaCl调整细胞浓度至4×107个/ml。 1.4.2 大肠杆菌抗原的制备 吸取灭菌的0.5%石碳酸生理盐水5ml，注入大肠杆菌斜面培养物上，将菌苔洗下。用无菌毛细滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管。将此含有菌液的小试管放60℃的水浴箱中1h，并不时摇动。取一与比浊管同质量的小试管，加菌液1ml，再加石碳酸生理盐水4ml(或更多，视原菌液浓度而定)，混匀后与各比浊管比浊，假若与第3管的浊度相等，则此菌液每毫升的细菌数为： 5×900000000=4500000000(45亿) 附McFarland比浊管配制法（取同质量同大小的试管10支，按下表加入药品）： 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1%BaCl 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1%H2SO4 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 相当每毫 升的细菌数 3亿 6亿 9亿 12亿 15亿 18亿 21亿 24亿 27亿 30亿
用0.5%石碳酸生理盐水将菌液稀释至每毫升含9亿个细菌。将已稀释号的菌悬液接种少量于肉汤培养基中，培养24-28h，观察有无细菌生长，如无细菌生长，即可放冰箱备用。 1.4.3 免疫小鼠 先将此试验所需的试剂准备好。向2只小鼠的腹腔分别注射0.5ml的灭活的大肠杆菌，向另2只小鼠的腹腔内分别注射0.2ml的血清。每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次。 1.4.4 血清效价测定 ELISA法：在酶标滴定板内加0.05ml抗原，置湿盒内4℃过夜，去抗原溶液，用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后去洗涤液，加入0.05ml待测样品，置湿盒内，37℃，放置1小时，同时设阴、阳性对照。1小时后用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后加入0.05mlHRP-羊抗鼠IgG，置湿盒内，37℃，放置1小时。1小时后用洗涤液重复洗3次，每次3min。然后加入0.05ml新配底物溶液，置湿盒内，37℃，放置30min，然后加入0.05ml终止反应液。观察各孔的颜色，用酶标测定仪测定OD490光吸收值。 1.4.5 凝集反应 - 3 -
玻片凝集法：在玻片的一端加一滴1:10大肠杆菌免疫血清，另一端加一滴生理盐水。用接种环自大肠杆菌琼脂斜面上挑取少许细菌混入生理盐水内，并搅匀；同法挑取少许细菌混入血清内，搅匀。将玻片略为摆动后静置室温中，1～3min后即可观察到一端有凝集反应出现，另一端为生理盐水对照，仍为均匀浑浊。 微量滴定凝集法：在微量滴定板上标记10个孔，从1到10。用移液枪于第1孔中加0.08ml生理盐水，其余各加0.05ml。然后加0.02ml大肠杆菌抗血清于第1孔中。然后换一新的枪头，在第1孔中吸上，放下来回3次充分混匀，再吸0.05ml至第2孔。换枪头，同样在第2孔吸上，放下，3次后吸0.05ml至第3孔中，依次类推，一直稀释至第9孔，混匀后弃去0.05ml。每孔加大肠杆菌悬液0.05ml，将滴定板按水平方向摇动，以混合孔中内容物。然后将滴定板置湿盒内，35℃,1小时，再放冰箱过夜。最后观察孔底有无凝集现象。 1.4.6 制备血清 小鼠颈动脉采血，采集的血液移入离心管中，尽量放成最大斜面，凝固后放入4-6℃冰箱中，使其自然析出血清。用已灭菌的毛细滴管洗出血清。若血清中带有红细胞，则用离心沉淀法去掉红细胞。然后将血清分装于灭菌细口瓶中。加入防腐剂，使血清含有0.01%硫柳汞。用蜡或胶带纸封瓶口，贴上标签，注明抗血清名称，凝集效价及日期，放冰箱备用。 2 结果与分析 2.1 ELISA法的测定结果 在ELISA法的测定结果中，阴性对照孔和阳性对照孔均为无色，试验孔的颜色略显橙黄色。用酶标仪测定OD490光吸收值，结果如下表所示。 1-12孔的稀释度分别为：1，1/25，1/50，1/100，1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200，1/6400，1/12800，1/25600。 根据样品吸光值/阴性对照吸光值>2.1为阳性可知，本实验中1、2、3、4、5、6孔为阳性孔，而7-12为阴性孔。因此，该免疫血清的效价为400。 表1 各加样孔OD值 加样孔 OD490
空白对照孔 0.000 阳性对照孔 0.003 阴性对照孔 0.005 1号孔 0.016 - 4 -
2号孔 0.015 3号孔 0.015 4号孔 0.012 5号孔 0.012 6号孔 0.011 7号孔 0.004 8号孔 0.004 9号孔 0.005 10号孔 0.004 11号孔 0.004 12号孔 0.003
2.2玻片凝集结果 表1 玻片凝集结果 大肠杆菌抗血清+大肠杆菌 生理盐水+大肠杆菌
画图表示 阴性或阳性 以（-）或（+）表示 + -
从以上结果中可以看出，大肠杆菌和大肠杆菌抗血清混合后，出现明显的凝集现象；而大肠杆菌和生理盐水混合，则无凝集现象发生。这说明抗血清具有良好的生物活性和特异性。 2.2 大肠杆菌抗血清效价测定 表2 大肠杆菌微量滴定凝集结果 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
血清 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 对照
结果 凝集 凝集 凝集 凝集 凝集 凝集 未凝集 未凝集 未凝集 未凝集 效价是指抗血清或抗体仍能产生可观察带的标准免疫反应时的稀释度。从上表可以看出阴性- 5 -
对照未发生凝集现象，小鼠的血清稀释度为1:320时仍能看到凝集反应，稀释度为1:640时就未见凝集反应了，即小鼠免疫血清效价为320。 3 讨论 通过ELISA法测定血清效价是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点。通过使用酶标仪测定OD490光吸收值能够定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性。当试验孔和阴性孔的比值大于2.1时，可是认定为是阳性。本次实验得到的结果显示兔抗鼠免疫血清的效价为400。 从玻片凝集的结果当中我们可以看到大肠杆菌+大肠杆菌抗血清发生凝集现象，而大肠杆菌+生理盐水，无凝集现象发生。该实验结果为接下来的微量滴定凝集法提供了参考。在使用解剖镜对大肠杆菌微量滴定凝集结果显示当小鼠的血清稀释度大于等于1:320时仍能看到凝集反应，稀释度为1:640时就未见凝集反应了，因此最终确定小鼠免疫血清效价为320。 在生产应用上制备抗原须灭活细菌，抗体制备须研究抗原的注射剂量、注射时间和取血时间，避免抗原制备失败或抗体效价不理想。所需细菌样品要求不严格，用离心沉降集菌法或增菌培养均不影响检验的灵敏度和准确性。制备高效价和高特异的抗血清必须有理想的免疫原、适宜的动物和科学的方法，其中抗原纯化是制备特异性抗体的先决条件。本次实验中制备大肠杆菌抗原时使用石炭酸生理盐水和加热60℃1h的目的即是为了灭活，起到纯化抗原作用。 抗血清的分离常采用室温自然凝固，然后放置37℃或4℃使血块收缩。前者迅速，但获得血较少；后者时间较长，有时还会出现溶血，但获得血清量多，且效价不会下跌。本实验分离血清时要快速，并且所用器皿要干燥、清洁以防溶血。实验中我们组分离出的血清较其他小组的颜色会有些稍红，究其原因可能是由于器皿不清洁造成溶血。