雨生红球藻中虾青素的C30-反相高效液相色谱法测定

雨生红球藻中虾青素的C30-反相高效液相色谱法测定孙伟红;肖荣辉;冷凯良;邢丽红;苗均魁;许洋;王泽文【摘要】建立了雨生红球藻中虾青素的C30-反相高效液相色谱测定方法.雨生红球藻经二氯甲烷-甲醇(体积比25 : 75)研磨和超声提取后,在0.5 mL 0.1 mol/L NaOH甲醇溶液中于5 ℃避光皂化12 h,在YMC-Caarotenoid C30色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)上以甲醇(A)、叔丁基甲基醚(B)、1%磷酸溶液(C)为流动相梯度洗脱,采用紫外检测器在474 nm测定.在优化实验条件下,雨生红球藻中的虾青素酯可以很好地转化为游离虾青素.实验以虾青素酯和虾青素在C30色谱柱上不同的出峰时间作为判断是否皂化完全的依据.在0.1 ～5 mg·L-1时峰强度与虾青素质量浓度呈良好线性(r=0.999 7),方法的定量下限为2 mg/kg,平均回收率为95% ～108%,相对标准偏差为3.5% ～14.7%.方法准确可靠,适用于雨生红球藻中虾青素含量的测定.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2010(029)008【总页数】5页(P841-845)【关键词】雨生红球藻;虾青素;皂化法;C30-反相高效液相色谱法【作者】孙伟红;肖荣辉;冷凯良;邢丽红;苗均魁;许洋;王泽文【作者单位】中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东,青岛,266071;中国海洋大学食品科学与工程学院,山东,青岛,266100;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东,青岛,266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东,青岛,266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东,青岛,266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东,青岛,266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东,青岛,266071;中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东,青岛,266071;中国海洋大学食品科学与工程学院,山东,青岛,266100【正文语种】中文【中图分类】O657.72虾青素 (Astaxanthin,3，3′-二羟基 -4，4′-二酮基 -β，β′-胡萝卜素 )是一种类胡萝卜素衍生物 , 具有很强的抑制肿瘤发生和生长,抑制多元不饱和脂肪酸的氧化,抵御紫外线,增强人体免疫功能,改善视力、色素形成和神经连通以及改善生育等作用,同时还有清除二氧化氮、硫化物、二硫化物和降低脂质过氧化的作用[1-4],因此在化妆品、保健品和医药中具有广泛的应用前景。

游离的虾青素主要有 3种同分异构体:trans-astaxanthin、9-cis-astaxanthin、13-cis-astaxanthin,目前国内报道的虾青素的分析方法通常为高效液相色谱法,且一般只分析 trans-astaxanthin[5-11]。

美国食品药品监督管理局 (FDA)规定了雨生红球藻中总虾青素测定的分光光度法[12]。

除了碱皂化法转化虾青素酯为游离的虾青素外,亦有文献采用胆固醇酯酶转化胡萝卜素酯[13];日本 FUJ I化学工业集团建立了分光光度法和高效液相色谱法测定雨生红球藻中虾青素含量的方法[14],该方法采用胆固醇酯酶转化雨生红球藻中的虾青素酯,并采用 C30反相色谱柱测定了虾青素的 3种同分异构体的含量,但成本昂贵。

本文采用 C30-反相高效液相色谱NaOH皂化法测定了雨生红球藻中 trans-astaxanthin、9-cis-astaxanthin、13-cis-astaxanthin的含量,并对不同厂家生产的不同批次的雨生红球藻成品进行了验证。

1.1 仪器与试剂美国 Agilent 1100高效液相色谱仪,配紫外检测器;Millipore Q超纯水器 (美国Millipore公司);H imac CR22G高速冷冻离心机 (日本 Hitachi公司),KQ-300E超声波清洗机 (昆山市超声仪器有限公司);N-EVAP112氮吹仪 (Organomation Associates.jnc,USA);0.45μm滤膜;丙酮、甲醇、乙腈、二氯甲烷和叔丁基甲基醚均为色谱纯;雨生红球藻样品分别购于国内外不同虾青素生产厂家。

虾青素标准品购于德国 Dr.Ehrenstorfer公司,纯度为 (95.8±0.5)%;准确称取适量虾青素标准品,用二氯甲烷或丙酮配成1 000 mg·L-1的储备液 (超声波促进溶解),存放于棕色瓶中,保存于 2～8℃冰箱,使用前配成合适含量的工作液用于液相色谱分析。

1.2 色谱条件色谱柱为 Y MC-Carotenoid C30色谱柱(250 mm×4.6 mm×5μm,日本 Y MC公司);流动相 A为甲醇,流动相 B为叔丁基甲基醚,流动相 C为 1%磷酸溶液。

洗脱梯度程序为:0～15 min,81%～66%A,15%～30%B,4%C;15～23 min,66%～16%A,30%～80%B,4%C;23～27 min,16%～81%A,80%～15%B,4%C;27～30 min,81%A,15%B,4%C。

流速为1.0 mL·min-1;检测器为紫外检测器;检测波长为474 nm;进样量为20μL;柱温:室温。

1.3 虾青素酯的提取与皂化1.3.1 虾青素酯提取准确称取 50 mg市售雨生红球藻产品,置于 10 mL玻璃匀浆器中,加入约 1 mL二氯甲烷 -甲醇 (体积比 25使用不同皂化溶剂∶75)充分研磨,提取液转移至 50 mL离心管中,重复上述步骤 3～4次,使细胞壁充分破碎,合并提取液。

40～50℃下超声提取5 min,5℃下以 8 000 r/min离心 5 min,取上清液于 50 mL容量瓶中,重复超声提取 3～4次以充分提取虾青素酯至藻体为白色,合并上清液定容后稳定15 min,5℃下以 10 000 r/min离心 5 min,取上清液 5 mL定容至 50 mL,待用。

1.3.2 虾青素酯皂化准确移取5 mL“1.3.1”提取液,加入 0.5 mL新配的 0.1 mol·L-1的 NaOH甲醇溶液,涡旋混合,在氮气吹扫下定容至 5 mL,并充氮密封,在5℃冰箱中反应过夜 (12 h以上),用0.45μm滤膜过滤后进行 HPLC分析。

2.1 检测波长的选择游离虾青素和虾青素酯的吸收峰位于 470～480 nm[13],参考文献[11,14]确定 3种虾青素同分异构体 trans-astaxanthin、9-cis-astaxanthin、13-cis-astaxanthin的检测波长为 474 nm。

2.2 皂化条件考察2.2.1 皂化溶剂的影响考察了丙酮、二氯甲烷、二氯甲烷 -甲醇(25∶75)、乙腈 -甲醇(75∶25)作为皂化溶剂对虾青素酯皂化效率的影响。

3次平行实验的结果表明,使用不同皂化溶剂皂化后虾青素的含量分别为:丙酮为 0.4%,二氯甲烷为 0.72%,二氯甲烷 -甲醇为 1.58%,乙腈 -甲醇为1.24%,因此选择二氯甲烷 -甲醇(25∶75)作为皂化溶剂。

2.2.2 提取溶剂的影响以二氯甲烷 -甲醇(25∶75)为皂化溶剂,分别考察了丙酮、二氯甲烷、二氯甲烷 -甲醇(25∶75)作为提取溶剂对虾青素酯提取效率的影响。

3次平行实验的结果表明,采用不同提取溶剂时,皂化后的虾青素含量分别为:丙酮 1.20%,二氯甲烷为 1.25%,二氯甲烷 -甲醇为1.58%,因此选择二氯甲烷 -甲醇(25∶75)作为提取溶剂。

2.2.3 碱浓度的影响不同浓度的NaOH甲醇溶液影响虾青素的皂化效率,当浓度低时皂化不完全,浓度过高又会导致虾青素容易被氧化成虾红素,并破坏虾青素而使得皂化效率降低。

本文考察了添加0.3～5 mL的0.1 mol·L-1NaOH甲醇溶液的皂化效率。

结果表明,NaOH甲醇溶液添加体积在 0.5～2 mL时皂化后的虾青素含量均大于 1.5%,实验发现,随着 NaOH甲醇溶液添加体积的增加,transastaxanthin会转化为 9-cis-astaxanthin,添加体积增加 1倍转化的量约增加 50%,当添加体积超过 2 mL后虾青素容易被氧化。

综合考虑,本文取 0.5 mL作为NaOH甲醇溶液添加量。

2.2.4 皂化时间的影响在上述最优实验条件下对不同的皂化时间进行考察,结果表明,皂化 12 h后虾青素已皂化完全。

因此,本文取 12 h作为皂化时间。

2.3 色谱分离及定性由于雨生红球藻中色素较多,且含有多种虾青素的同分异构体和虾青素酯,因此在短时间内将各组分分离具有较大困难。

本文采用相对温和的皂化方法,即保证了虾青素不被破坏,又能使虾青素酯全部转化为游离的虾青素,对经质谱定性的游离虾青素的 3种同分异构体进行分离测定。

图1为皂化后虾青素标样、虾青素实际样品和未皂化的虾青素实际样品的色谱图。

从图 1A虾青素标准品(1.5 mg·L-1)色谱图可以看到,在优化实验条件下,虾青素反式、顺式异构体 13-cis-astaxanthin,trans-astaxanthin,9-cis-astaxanthin的保留时间分别为 10.12、11.41、12.36 min,因此在定量时反式体、顺式体合并计算[11,14-15]。

从图 1B中可以看到实际样品雨生红球藻提取液的虾青素酯的出峰时间为 21.5～25.1 min,当虾青素酯皂化不完全时,实际样品的色谱图在 21.5～25.1 min会出现虾青素酯的色谱峰,反之,不出峰(如图 1C),由此可以判断雨生红球藻的提取液中虾青素酯是否皂化完全。

2.4 提取方法的考察雨生红球藻中虾青素的提取方法包括微波法[16]、低温研磨萃取法、有机溶剂萃取法和低温研磨法[17]等,其中低温研磨法是比较常用的破壁方法。

但操作中发现,研钵在低温研磨时可能会破裂,且用溶剂转移时易造成损失。

对低温研磨法和有机溶剂研磨提取法的结果进行比较,结果表明,两方法的提取率接近,但有机溶剂研磨法的结果更稳定。

2.5 线性关系及检出限对不同浓度的虾青素标准样品在“1.3.2”皂化条件下进行了方法的线性范围考察,以虾青素反式体、顺式体合并峰面积 (y)为纵坐标,质量浓度(x,mg·L-1)为横坐标,得到虾青素在质量浓度为 0.1～5 mg·L-1时与响应值良好呈线性,其线性方程为 y=218.3x-0.320 0,r=0.999 7。

雨生红球藻中虾青素的含量约 1 mg/g,属于常规含量分析,实验以0.5 mg·L-1的游离虾青素皂化后进样分析,得到雨生红球藻中虾青素的定量下限 (S/N=10)为 2 mg/kg。