2011CB965000-G三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络
干细胞共培养的方法及其分化诱导_王珊青
ＣＲＴＥＲ复旦大学附属中山医院整形外科，上海市２０００３２王珊青★，女，１９８３年生，江苏省南京市人，汉族，２００７年复旦大学医学院毕业，硕士，住院医生，主要从事组织工程软骨方面的研究。
ｗｓｑｙｖｏｎｎｅ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ通讯作者：徐剑炜，主任医师，复旦大学附属中山医院整形外科，上海市２０００３２ｊａｍｅｓｗａｙ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ中图分类号：Ｒ３９４．２文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－８２２５（２００７）１１－０２１２２－０４收稿日期：２００６－１２－０７修回日期：２００７－０２－０１（０６－５０－１２－８８３１／ＺＳ・Ｑ）干细胞共培养的方法及其分化诱导★王珊青，徐剑炜Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｉｎｔｏｔｈｏｓｅｋｉｎｄｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｔｏｒｅｖｉｅｗｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＤＡＴＡＳＯＵＲＣＥＳ：ＴｈｅｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｉｎＰＵＢＭＥＤｂｅｔｗｅｅｎＪａｎｕａｒｙ１９９０ａｎｄＮｏｖｅｍｂｅｒ２００６ｕｓｉｎｇｃｏｍｐｕｔｅｒｗｉｔｈｔｈｅｋｅｙｗｏｒｄｓｏｆ＂ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ＂ｉｎＥｎｇｌｉｓｈ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｉｎＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌＦｕｌｌ－ｔｅｘｔＤａｔａｂａｓｅ（ＣＪＦＤ）ｂｅｔｗｅｅｎＪａｎｕａｒｙ１９９０ａｎｄＮｏｖｅｍｂｅｒ２００６ｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｋｅｙｗｏｒｄｓｉｎＣｈｉｎｅｓｅ．ＳＴＵＤＹＳＥＬＥＣＴＩＯＮ：Ｆｉｒｓｔｔｒｉａｌｗｉｔｈｔｈｅｄａｔａｗａｓｇｏｔｔｅｎ，ａｎｄｔｈｅｃｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｅｖｅｒｙｒｅｆｅｒｅｎｃｅｗｅｒｅｃｈｅｃｋｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ：Ｔｈｅａｒｔｉｃｌｅｓｔｈａｔｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｅｒｅａｄｏｐｔｅｄ．Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ：ＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｒＭｅｔａａｎａｌｙｓｉｓａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｅｘｃｌｕｄｅｄ．ＤＡＴＡＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ：Ｔｏｔａｌｌｙ４０ｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄ３０ａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅａｃｃｏｒｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ１０ｅｘｃｌｕｄｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｏｌｄｏｒｒｅｐｅａｔｅｄｏｎｅｓ．Ｉｎｔｈｅｓｅ３０ａｒｔｉｃｌｅｓ，ｔｈｅｙｄｉｓｃｕｓｓｅｄａｂｏｕｔｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆｃｅｌｌｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐａｒａｃｒｉｎｅａｃｔｉｏｎｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｃｅｌｌｓａｎｄｃｅｌｌｇａｐｊｕｎｃｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｄｕｅｔｏｃｒｅｖｉｃｅｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＤＡＴＡＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｍａｎｙｋｉｎｄｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉａ．Ｗｉｔｈｔｈｉｓｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｉｔｈａｄｐｒｏｖｉｄｅｄｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｉｔｈｍａｔｕｒｅｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｈａｔｋｉｎｄｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ６ｋｉｎｄｓｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｎａｍｅｌｙｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ，ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ，ｃｅｌｌｐｅｌｌｅｔ，ｃｅｌｌｓｈｅｅｔａｎｄｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓ＇ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗｅｒｅｔｈａｔｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｐｒｏｖｉｄｅａｓｕｉｔａｂｌｅｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｂｙｓｅｃｒｅｔｉｎｇｓｏｍｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗａｓａｓｅｐａｒａｔｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｔｈｅｇａｐｊｕｎｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃａｎｂｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｙｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｈａｖｅｂｅｅｎａｃｅｒｔａｉｎｆｅａｓｉｂｌｅａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄ．Ｂｕｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｓｓｔｉｌｌｕｎｃｌｅａｒ．ＷａｎｇＳＱ，ＸｕＪＷ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＺｈｏｎｇｇｕｏＺｕｚｈｉＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕｙｕＬｉｎｃｈｕａｎｇＫａｎｇｆｕ２００７；１１（１１）：２１２２－２１２５（Ｃｈｉｎａ）［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０７－１１／１１ｋ－２１２２（ｐｓ）．ｐｄｆ］摘要目的：体细胞与干细胞共培养可以诱导干细胞向该种体细胞表型分化，文章就干细胞共培养的不同方法及其诱导分化的机制进行综述。
神经干细胞的培养鉴定及分化
神经干细胞的培养鉴定及分化The manuscript was revised on the evening of 2021神经干细胞的培养鉴定及分化朱琼1，皋月娟2，高顺记1，陈重1，刘政1，徐亚丽1(1解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；2解放军第三○二医院超声科，北京市 100039)引用本文：朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J].中国组织工程研究，2017，21(17):2708-2713.DOI:ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼)文章快速阅读：文题释义：神经干细胞：是具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，主要存在于侧脑室下区和海马齿状回颗粒下层，不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。
细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。
如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。
同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。
摘要背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是后续研究的基础。
目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。
方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP、βⅢ-tubulin和MBP的表达。
脂肪干细胞培养2011-3-5
干细胞论坛脂肪干细胞培养吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织20 mL. 在1 h内将其移至离心管内，加入等量PBS缓冲液，充分振荡后低速离心800 r/min×10 min. 反复冲洗3次后加入等量15 g/L I型胶原酶. 37℃水浴中充分振荡30 min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心10 min后弃去上清. 将下层细胞用PBS悬浮后加入16 mmol/L NH4Cl 37℃水浴中10 min以裂解红细胞. 低速离心10 min后再用PBS冲洗3次. 最后将细胞用含100 mL/L FBS+10 g/L青霉素的DMEM悬浮后移入培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育，48 h后首次换液，弃去悬浮细胞. 随后每3 d换液，1 wk后传代. 将第3代细胞用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到109/L后进行流式细胞仪检测. 细胞传至第3代时将其以2×107/L 的细胞数分别转入各定向培养基中进行培养. 诱导培养2 wk后，对成脂诱导组进行油红Ｏ脂肪颗粒染色，另外：现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性的标志物有：cd13，cd29，cd59，cd49e，cd73，cd90，HLA-ABC等。
但表达阳性不代表具有特异性，所以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还是很困难的，应该说不具有很强的说服能力。
按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似干细胞，并且具有多向分化的能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。
你要是想证明你养的就是干细胞，最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。
干细胞传代吸出来以后，常速离心，用pbs洗两遍后，accutase管内消化5-10min，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。
人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定[摘要]目的: 进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定, 为组织工程的进一步研究提供实验依据。
方法: 将剪碎的人脂肪组织加入Ⅰ型胶原酶消化, 离心。
1-干细胞与再生医学
ppt_biochem_8@Password: ppt6662012-4-222中国科学院战略研究系列报告——《创新2050：科技革命与中国的未来》影响我国现代化进程的22个战略性科技问题：¾干细胞与再生医学¾重大慢性病的早期诊断与系统干预2009年6月10日2012-4-2232012-4-224再生与再生医学再生：组织、细胞损伤后，由周围健康细胞进行增生，以实现修复的过程称为再生。
2012-4-225再生医学：通过各种手段促进机体自我修复与再生，以治疗其所受损伤。
各种细胞的再生能力不同！胚胎干细胞源于受精卵的发育瑞士摄影师伦纳特•尼尔森1965年拍摄2012-4-2272012-4-2281981年建立小鼠胚胎干细胞系1998年建立人的胚胎干细胞系绿色为干细胞来源处Boiani M. and Schöler HR. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005, 6: 872-884 2012-4-229胚胎干细胞的优势与不足在理论上具有：•无限的自我更新能力：不断增殖•多向分化能力：成为任何类型组织细胞•伦理学问题•增殖与分化的控制2012-4-22102012-4-2211成体干细胞源于出生后个体的多种组织•骨髓•皮肤•外周血•脂肪•软骨•骨•骨骼肌•肝•……成体干细胞的优势与不足•能够不断增殖和多向分化•无伦理学问题，易采集•多数情况可以用自体细胞•增殖能力和分化能力有限•数量少，并非所有组织都有2012-4-22122007年的重大突破用四种蛋白改变皮肤成纤维细胞的命运•Oct3/4, Sox2, Klf4, c-MycTakahashi K. et al., Cell. 2007; 131: 1-12. •Oct4, Sox2, Nanog, Lin28Yu J. et al.,Science. 2007; 318: 1917-1920. 2012-4-22132012-4-2214皮肤成纤维细胞被诱导为多能干细胞(iPS)Takahashi K. et al.,Cell. 2007; 131: 1–12.iPS细胞具有分化为各种组织细胞的能力。
神经干细胞的增殖与分化调控机制
。
研究表明, NSC 广泛存在于发育期和成年哺乳 动物的 CNS 中。在对人胚胎期 NSC 的研究中, 已先 后从大脑皮质、 海马、 纹状体、 嗅球、 侧脑室、 室管膜 下层、 小脑和脊髓等区域分离出 NSC 。自从 1992 年 Reyno lds和 W e iss 周内
。
大鼠海马神经元数量明显减少, 但随后在坏死区和 边缘带可见显著的神经元新 生, 同时证实这些 N e uN 细胞来源于内源性神经前体细胞。上述研究表 明, NSC 的增殖和分化与局部微环境信号密切相关。 2 3 NSC 增殖和分化的内在机制 各类细胞因子对 NSC 的影响 最终在基因水平
W e i Tu , Zh i F eng Deng , Y ang W ang 1 Depart m ent o f Neurosurgery , the Second A ffiliated H ospital o fM edical Co llege of N anchang 2 Un iv ersity , Nanchang 330006 , Ch in a ; Institute of U rological Surgery , the F irst A ffilia ted H osp ital o fM ed ic al Co llege of N anchang University , N anchang 330006 , Chin a Abstract N eural stem cells ( NSC s) have th e ab ility o f h ig hly se lf renew a l and can be dif ferentiated into neurons , astrocytes and o ligodendrocytes . NSC s can be iso lated from the brain s o f em bryon ic and adu lt m amm als. T he proliferation and d ifferent iatio n of stem ce lls are regu lated by both m icroenv iron m enta l factors and genes . It has been found th at a num ber of cy tok in es and genes can regu late the pro liferation o f NSCs, and deter m ine their d irectio n of d ifferent iatio n . Furth er understanding of the m echan ism s of pro liferat io n and d ifferent iatio n of NSC sw ill sign if icantly prom ote the c lin ical app lication o f NSCs. K ey W ords neural stem ce l; l proliferation ; d ifferent iation 神经干细胞 ( neural stem cel, l NSC )是具有高度 自我更新能力并能分化为神经元、 星形胶质细胞和 少突胶质细胞的神经前体细胞。 NSC 概念的提出彻 底改变了 以往认 为中 枢神 经系 统 ( central nervous system, CNS) 细 胞不能 再生 的观 念。 NSC 移 植为 CNS损伤和神经 退行性疾病的治疗 提供了新的方 向。因此, 对 NSC 增殖和分化调控的研究显得尤其 重要。 1 N SC 的特性 、 来源和分布 NSC 具有 2 个显著的特性 : ( 1) 高度自我更新 能力, 能够重复进行有丝分裂, 产生大量子代细胞 ; ( 2) 在一定条件下可分化为神经元、 星形胶质细胞 和少突胶质细胞。在对称分裂情况下, NSC 产生的 2 个子代细胞可以均为 NSC, 也可以均为神经祖细 胞; 而在不对称分裂情况下 , 则 产生 1 个 NSC 和 1 个神经祖细胞。后者的自我更新能力有限, 终将逐 步分化成熟。这样 , 既 能维持 NSC 的自我更新 , 又 能不断补充分化的神经祖细胞。巢蛋白 ( nestin) 属 于细胞骨架蛋白 , 可作为 NSC 的标志性蛋白 , 从而 为进一步研究 NSC 的特性提供了一把钥匙
项目编号： 2012CB966700
项目编号: 2012CB966700项目名称：多能干细胞定向分化的表观遗传学调控网络项目第一承担单位：清华大学项目首席科学家：沈晓骅项目执行期：2012年1月-2016年8月主要研究内容与预期目标:干细胞分化和个体发育的本质就是在不同类型的细胞中建立不同的表观遗传状态或修饰图谱。
系统解析以表观遗传图谱的建立、维持和解读机制为中心的分子调控网络，是认识干细胞分化和发育的关键。
我们将以人和小鼠多能干细胞定向分化成为神经、心血管等体细胞和生殖细胞为模型，并结合小鼠动物模型，探讨干细胞分化和个体发育的内在规律，研究信号通路、转录因子、非编码RNA如何与表观遗传因子相互作用，以及这些互作对基因表达和细胞命运的影响（通称为表观遗传调控网络）, 最终利用这些规律来建立高效、安全的定向分化体系。
本课题设置四个课题：１）多能干细胞向体细胞（包括神经外胚层及心血管中胚层）分化模型及调控机制；２）多能干细胞向生殖细胞分化模型及调控机制；３）表观遗传学调控在干细胞定向分化中的作用；４）转录及转录后调控在干细胞定向分化中的作用。
预期目标：解析多能干细胞向三种模式细胞系分化过程中组织特异性的调控因子（包括蛋白、RNA）与表观遗传因子间相互作用的网络，解析全基因组表达谱和表观遗传修饰谱，构建以表观遗传因子为中心的蛋白-RNA-DNA相互关联的、涉及表观遗传修饰和基因表达的表观遗传调控网络，认识控制不同方向分化的调控网络的共通点和特异性。
筛选若干关键调控因子，获得高效、安全的诱导分化新手段，为再生医学技术体系的实际应用奠定基础。
发表高影响因子文章30～50篇，力争在国际顶尖学术期刊上发表论文3～6篇；培养一支具有国际影响力的、高水平的干细胞研究梯队，形成可持续发展的能力。
研究队伍（参加单位）：清华大学、北京大学、中科院动物所。
胚胎干细胞的分化与调控机制研究
胚胎干细胞的分化与调控机制研究胚胎是人类生命的起源。
胚胎发育过程中，细胞分化和调控是非常重要的研究方向。
其中胚胎干细胞是研究的重点，它们可以分化为不同类型的细胞并在不同的组织和器官中完成特定的功能。
本文将介绍胚胎干细胞的分化和调控机制的研究进展。
一、胚胎干细胞的定义和特性胚胎干细胞是从早期胚胎中获取并保存的一种细胞。
它们具有两个重要的特性：1. 多能性：胚胎干细胞可以分化为三个胚层的所有类型组织，包括内胚层（胚球的内部）、外胚层（胚球的外部）和中胚层（内胚层和外胚层之间的区域）。
2. 自我更新：胚胎干细胞可以不断地分裂和自我更新，保持其未分化状态。
以上的两个特性使胚胎干细胞在分化和发育过程中扮演着重要的角色。
二、胚胎干细胞的分化胚胎干细胞能够分化为不同类型的细胞，这种分化过程成为细胞命运的决定。
细胞命运在很大程度上由细胞内的信号通路和外部环境因素共同调控。
最近的研究发现，细胞外基质对胚胎干细胞的分化也有很大的影响，这包括生长因子、细胞外基质成分和细胞间相互作用等。
胚胎干细胞的分化过程可以显式的调控，这导致胚胎干细胞的定向分化成为一个重要的研究方向。
在胚胎干细胞分化过程中，特定的基因表达活动被激活或抑制，这促进了不同类型细胞的分化。
一些基因表达动态的短周期、稳态和长周期的过程，已经成为研究分化过程的前沿。
这些基因的表达模式可以帮助人们理解细胞命运的决定和分化过程的调控。
三、胚胎干细胞的调控机制胚胎干细胞的分化是复杂的，它需要由多个信号通路和调控模块所组成的调控网络。
最近的研究表明，在这些调控模块中，转录因子、非编码RNA、表观遗传调控和染色质结构调控等因素起着至关重要的作用。
在不同的细胞命运的分化过程中，不同的调控因素主导着分化过程。
例如，在心脏和肌肉分化过程中，ARK5的活性和ERK通路的活性相互作用，控制核外ATP的浓度，增加峰值活性，促进心肌分化并抑制脂肪细胞投入。
这种调控方案可以促进心肌细胞的定向分化，并在胚胎发育过程中起到重要的作用。
干细胞基因调控的分子证据
干细胞基因调控的分子证据干细胞基因调控的分子证据干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞，可以分化成多种细胞类型，具有广泛的应用前景。
干细胞的自我更新和分化能力是由基因调控网络控制的。
近年来，研究人员通过大量的实验和分析，逐渐揭示了干细胞基因调控的分子证据。
首先，干细胞的基因调控网络包括转录因子、表观遗传修饰和非编码RNA等多个层次。
转录因子是一类能够结合到DNA上，调控基因表达的蛋白质。
在干细胞中，转录因子起着重要的作用，能够控制干细胞的自我更新和分化。
例如，Oct4、Sox2、Nanog等转录因子是干细胞自我更新和多向分化的关键因子。
表观遗传修饰是指通过化学修饰改变DNA和染色质结构，从而影响基因表达的方式。
在干细胞中，表观遗传修饰也是基因调控的重要机制。
例如，DNA甲基化和组蛋白修饰等可以影响基因的转录和表达。
非编码RNA是指不能编码蛋白质的RNA分子，可以通过调控基因表达来影响干细胞的自我更新和分化。
其次，干细胞基因调控的分子证据还包括信号通路和代谢途径等多个方面。
信号通路是指一系列分子间的相互作用，可以传递细胞内外的信息，影响细胞的生长、分化和死亡等过程。
在干细胞中，信号通路也是基因调控的重要机制。
例如，Wnt、BMP和Notch等信号通路可以影响干细胞的自我更新和分化。
代谢途径是指细胞内的代谢反应，可以提供细胞所需的能量和物质。
在干细胞中，代谢途径也是基因调控的重要机制。
例如，糖酵解和线粒体呼吸链等代谢途径可以影响干细胞的自我更新和分化。
最后，干细胞基因调控的分子证据还包括基因表达谱和蛋白质组学等多个方面。
基因表达谱是指细胞内基因的表达模式，可以反映细胞的生理状态和功能。
在干细胞中，基因表达谱也是基因调控的重要机制。
例如，通过比较干细胞和分化细胞的基因表达谱，可以发现干细胞特有的基因表达模式。
蛋白质组学是指对细胞内蛋白质的组成和功能进行研究，可以揭示蛋白质在细胞内的作用和相互作用。
在干细胞中，蛋白质组学也是基因调控的重要机制。
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项目名称：三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络首席科学家：戴建武中国科学院遗传与发育生物学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：中国科学院二、预期目标本项目的总体目标：通过本项目的实施，建立干细胞三维培养和完善干细胞纳米示踪技术，解析干细胞自我更新与分化过程中遗传与表观遗传的调控网络，为干细胞的应用奠定基础。
取得一批具有重大影响的科研成果，提高我国在干细胞研究领域的自主创新能力。
五年预期目标:1．综合考虑多种因素，最大限度模拟体内环境，制备出适合干细胞生长分化的三维支架材料，建立三维培养多能干细胞和成体干细胞的自我更新和定向分化的研究体系。
2. 结合基因组、蛋白质组和磷酸蛋白质组分析结果探讨三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞自我更新和定向分化中起关键调控作用的信号通路和信号网络、转录调控以及表观遗传调控网络。
3．通过模式动物体内干细胞维持与定向分化研究，发现并鉴定与神经干细胞的维持、分化相关的一些新基因，阐明其作用机制。
明确体外三维培养的神经干细胞在体内的自我更新能力与分化潜能，并对其导入体内后的有效性、安全性进行评估。
分析三维培养干细胞与体内干细胞维持与分化机制的异同，获得干细胞调控的真实信息。
4. 建立干细胞纳米示踪与成像新技术，包括制备出高生物相容性、高量子产率的量子点，建立量子点标记活细胞及亚细胞组分的方法，实现对三维培养干细胞以及活体干细胞的特异性标记，建立三维培养干细胞和活体干细胞的三维、非损伤性的纳米示踪与成像技术。
5．培养研究生30名。
博士后10名。
6．在本领域发表论文30篇，其中影响因子5以上的15篇。
三、研究方案1）学术思路：干细胞的自我更新和定向分化是干细胞研究中的基本问题。
在体内，干细胞的自我更新和分化是处于三维环境中，体外三维培养体系下细胞的行为学特性近似于体内细胞的特性。
本项目将建立模拟体内环境的干细胞三维培养体系，并利用干细胞纳米标记与成像技术，研究三维培养干细胞自我更新和定向分化的调控网络。
在体内研究中，以线虫和小鼠为模式动物，系统研究体内干细胞的维持、分化调控机制。
2）技术途径：根据研究内容，本项目技术途径如图所示：具体内容如下：1）适合不同类型干细胞培养的三维胶原支架的构建分离纯化胶原蛋白，制备三维胶原支架材料，检测其生物相容性，运用不同生产工艺使其具有适宜的硬度和孔隙结构，建立适合不同类型干细胞培养的三维支架材料。
2）三维胶原支架材料的修饰、优化在胶原支架材料的基础上，将微环境中调控干细胞自我更新和定向分化的其它细胞外基质成份、信号分子或支持细胞等因素通过不同的方法整合到胶原支架材料上，对三维胶原支架材料进行修饰优化，以最大限度的模拟体内干细胞自我更新和定向分化的环境。
3）干细胞三维培养体系的建立干细胞选择多潜能干细胞（ES细胞和iPS细胞）和成体干细胞（神经干细胞、心肌干细胞、骨骼肌干细胞）。
（1）用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运动等动态行为。
在亚细胞水平用活体成像技术观测参与调控细胞行为的细胞骨架(如actin 或 tubulin的荧光融合蛋白)及其他因子的动态变化。
（2）将不同干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，与二维培养体系相比较，利用芯片技术对二者基因表达情况进行比较，分析在三维培养条件下干细胞的基因表达情况，利用western blot等技术对关键因子的蛋白表达进行定量分析。
综合利用细胞生物学和分子生物学的方法对两种培养体系下细胞的干细胞特性进行比较。
4）干细胞自我更新调控机制研究（1）将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行自我更新和定向分化研究。
分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞定向分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。
用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。
（2）三维培养干细胞的发育潜能研究，在建立胚胎干细胞三维培养体系的基础上，探索三维培养胚胎干细胞的发育潜能，体外研究中重点探索三维胚胎干细胞向神经、心肌等细胞分化的能力及其调控机制，体内利用嵌合以及四倍体补偿等方法鉴定三维培养的胚胎干细胞体内发育潜能及细胞多能性。
（3）以生物化学方法检测三维培养环境中干细胞的自我更新和分化受外界信号调控的各种信号转导通路的动态变化，并与通过细胞生物学手段检测信号通路中各组分激活状态的亚细胞分布相结合，检测其下游靶基因的表达水平，以分析细胞中各种信号通路的整合情况，解析干细胞对于不同培养条件作出反应的分子基础。
其中自我更新研究将以ES细胞和iPS细胞为主，探讨其以Oct4和Nanog为中心的干细胞自我更新的调控网络。
5）干细胞定向分化调控机制研究（1）选择成体干细胞包括神经、心肌和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。
将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行定向分化研究。
通过细胞形态观察及免疫荧光染色检测干细胞定向诱导分化后产生的细胞类型（针对神经干细胞分化产生的细胞类型将分别用神经元、星形胶质细胞及寡树突细胞标志蛋白的特异抗体（神经元TuJ1及MAP2，星形胶质细胞GFAP，寡树突细胞OSP）作免疫荧光染色, 针对人胚胎干细胞分化产生的心肌细胞类型将分别用α-肌浆球蛋白重链（α-MHC）、肌钙蛋白C、心房利钠肽（ANP）等标志蛋白的特异抗体作免疫荧光染色,骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3）。
例如肌原代成肌细胞或肌源性细胞系C2C12细胞在增殖阶段的培养条件为含10%胎牛血清的DMEM培养基，诱导分化的培养条件为含2%马血清的DMEM培养基，一般5～6天细胞可以分化成肌管。
针对成肌干细胞分化产生的骨骼肌细胞将分别用骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3作免疫荧光染色。
分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。
检测并比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞在分化过程中亚细胞结构水平的变化，用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。
通过与课题组四合作，用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运动等动态行为。
在亚细胞水平用活体成像技术观测参与调控细胞行为的细胞骨架(如actin或tubulin的荧光融合蛋白)及其他因子的动态变化。
（2）运用生化方法检测并比较二维和三维培养的干细胞分化过程中受外界信号因子诱导产生的细胞内信号通路的动态变化，并与通过细胞生物学手段检测信号通路中各组分激活状态的亚细胞分布相结合，并检测其下游靶基因的表达水平，分析它们各自信号转导途径整合的特性，解析干细胞对于不同培养条件作出反应的分子基础。
其中神经细胞的研究将以Erk及mTOR信号通路为主，肌细胞的研究将以PI3K/AKT/GSK3β信号通路为主。
此外，我们已发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通过STAT3-p63- Jagged-Notch 级联调控细胞维持细胞增殖和分化之间的平衡。
功能低下或高度活化的mTOR信号通过影响Notch信号抑制细胞分化。
因此计划探讨三维培养条件下干细胞定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞定向分化中mTOR信号传导通路是否起关键调控作用。
研究方案如下：分离选择小鼠条件性 mTOR、 PTEN或Tsc1基因敲除 (mTOR活化) 的成体干细胞包括神经和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，然后将TAT-NLS-Cre融合蛋白质加入细胞培养液，融合蛋白质将会被细胞摄取、入核，敲除mTOR基因或Tsc1基因，从而下调或上调mTOR通路的活性，然后检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。
还可让这些小鼠与组织特异性 CRE 表达小鼠交配，在小鼠体内敲除mTOR、 PTEN或Tsc1，以明确mTOR在干细胞的定向分化中的作用。
小鼠条件性敲除胚胎干细胞 (loxp-mTOR-loxp) 已从欧洲条件性基因敲除小鼠项目（European Conditional Mouse Mutagenesis program）得到，将培育loxp-mTOR-loxp转基因小鼠，为条件性敲除mTOR小鼠做准备。
已有条件性Pten或Tsc1基因敲除小鼠和神经、肌肉CRE表达小鼠。
（3）鉴定人胚胎干细胞向心肌前体细胞分化过程中起关键作用的转录因子网络和关键调节通路表达KDR的细胞是心肌细胞的前提细胞。
利用我们现有的心肌分化培养体系，将人胚胎干细胞在三维条件下分化成心肌细胞，并在相应的时间点，利用流式细胞分离仪分离取得KDR表达的心肌前体细胞和非表达细胞，然后再利用microarray 或深度测序技术获取这二类细胞的基因表达数据，并通过二者之间和与为分化的胚胎干细胞表达谱对比，找到在这一分化过程中上调和下调的前500个基因，并通过UCSC mm8得到这些基因的启动子序列，最后利用CREAD package 的Motifclass来发现出现在这些启动子中的具有代表性的（按出现频率划分）转录因子DNA结合位点。
通过这些转录因子DNA结合位点来找到调节这一细胞分化过程的转录因子网络。
最后，利用可诱导的基因表达系统在胚胎干细胞中验证这些转录因子在心肌分化中的功能。
6）三维培养干细胞自我更新和定向分化的表观调控网络研究（1）系统定量地分析在二维和三维培养条件下未分化干细胞和经诱导分化细胞之间的总蛋白质组和重要的蛋白质修饰（包括磷酸化、乙酰化和泛素化）的差异，从而找出在三维培养条件下控制干细胞自我更新与定向分化的特异性的调控网络。
研究方案包括下图所示七个步骤：①从三维和二维培养条件下未分化的干细胞和经诱导分化的细胞制备蛋白质样品。
这样一共有四个样品，分别标记为三维未分化，三维分化，二维分化，二维未分化。
②从每个样品中分出等量的蛋白样品进行胰蛋白酶（Trypsin) 酶解，产生多肽混合物。
③利用商业化的iTraq试剂，分别标记以上四个不同的样品。
iTraq试剂有四个不同的标记物。
这四个标记物在MS/MS图谱上所显示的峰其质量/电荷比分别为113，114，115，116。