重组质粒pSecTag2／B-OPG在Beagle犬骨髓基质细胞中表达与鉴定

合集下载

IBDVVP2基因重组质粒pBV220表达条件的优化

动物医学进展,2007,28(4):9213Progress in Veterinary MedicineIBDV V P2基因重组质粒pBV220表达条件的优化3程太平1,荣　俊2,刘晓娜1,邹浩勇1,齐晓亮1,樊友净1(1.长江大学动物科学学院,湖北荆州434025;2.长江大学生命科学学院,湖北荆州434025) 摘　要:采用三角瓶小量法振荡培养,对含传染性法氏囊病病毒V P2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化。

在37℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在42℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在37℃和42℃时诱导,分别对诱导时间(5、6、7、8h)及待选培养基(R1、R2、R3)进行筛选。

以菌体湿重和菌体V P2蛋白表达水平两个指标进行统计分析及综合评价。

结果表明,37℃时诱导,最适宜起始OD600为0.45±0.025,最佳诱导时间为7h,最佳培养基是R1;42℃时诱导,最适宜起始OD600为0.40±0.025,最佳诱导时间为5h,最佳培养基是R2。

42℃时的每一诱导时间组菌体湿重和V P2表达水平都显著低于37℃时。

因此,以重组质粒pBV220的大肠埃希菌BL21表达IBDV V P2基因,在37℃时诱导表达要比42℃时好。

关键词:传染性法氏囊病病毒;pBV220;表达优化;大肠埃希菌BL21中图分类号:S852.659.4文献标识码:A文章编号:100725038(2007)0420009205 以重组原核表达质粒在大肠埃希菌表达一些外源基因,常常得到含目的蛋白的包涵体,需要进行变性复性处理,还可能发生分子结构的改变,也不能表达糖蛋白。

但也有报道,以某些重组原核表达质粒在大肠埃希菌表达一些外源基因,得到可溶的、不需变性复性处理的、具有生物学活性的目的蛋白。

双相磷酸钙作用下牙周组织缺损再生的Beagle犬正畸牙移动的骨改建功能

双相磷酸钙作用下牙周组织缺损再生的Beagle犬正畸牙移动的骨改建功能时函;王洁;武影;陈扬熙【摘要】目的:观察应用双相磷酸钙(BCP)对Beagle犬牙周组织缺损进行再生后正畸牙移动的过程,阐明BCP作为牙周再生支架材料的改建机制.方法:选择6只成年雄性Beagle犬作为研究对象,以每只犬口内右上象限(B区)、左下象限(C区)为对照组,左上象限(A区)和右下象限(D区)建立犬上下颌双侧侧切牙牙周组织缺损模型,于缺损处植入BC P进行缺损组织再生12周后,建立正畸牙移动模型(实验组),分别对实验组和对照组施加应力刺激,并于加力后1、2和4周随机处死2只Beagle犬,标本处理染色后观察应力作用下再生牙周组织的组织学变化及调控成骨活动核心结合因子α1(Cbfα1)的表达情况,观察受应力作用的正常牙周组织内的情况.结果:M asson染色检测,施加正畸压应力刺激后1周,实验组和对照组犬牙周膜均明显变窄,纤维致密,实验组犬牙槽骨以蓝染为主,对照组犬牙槽骨除牙周膜的受压区域外大体呈红色.在施加正畸压应力刺激后4周,实验组犬牙槽骨红-蓝相间,对照组犬牙槽骨红染;2组犬牙周膜内血管管腔变圆.施加正畸压应力刺激后1周,实验组和对照组犬牙槽骨表面布满骨吸收陷窝,内含多核的破骨细胞,其胞浆Cbfα1染色呈阳性;受压变形的牙周膜内细胞排列无序.施加正畸压应力刺激后4周,实验组犬牙槽骨破骨细胞消失,吸收陷窝被成骨细胞充填,骨小梁另一侧的成骨细胞也处于活跃状态,牙槽骨的骨髓腔内间充质细胞和边缘的成骨细胞仍可见Cbfα1阳性表达;对照组犬牙槽骨中的成骨细胞为Cbfα1弱阳性表达.结论:应用BCP再生的牙周组织已接近正常牙周组织,其在正畸力作用下具备正常的成骨功能,可以完成正畸牙移动的骨改建过程.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2019(045)005【总页数】7页(P1025-1030,前插1)【关键词】双相磷酸钙;牙周再生;正畸牙移动;核心结合因子【作者】时函;王洁;武影;陈扬熙【作者单位】同济大学口腔医学院及附属口腔医院正畸科上海市牙组织修复与再生工程技术研究中心,上海200072;同济大学口腔医学院及附属口腔医院正畸科上海市牙组织修复与再生工程技术研究中心,上海200072;同济大学口腔医学院及附属口腔医院牙周科上海市牙组织修复与再生工程技术研究中心,上海200072;四川大学华西口腔医学院正畸科,四川成都600040【正文语种】中文【中图分类】R783.5随着生活水平的提高，人们对美观的追求程度日益增加，成年正畸患者的数量与日俱增，此类患者常伴有牙根暴露和牙槽骨吸收等不同程度的牙周组织丧失的情况，对于这些患者即使轻微的矫治力也是无法承受的，因此有效地再生缺失的牙周支持组织是保证正畸治疗顺利进行的前提。

犬瘟热病毒水貂株H与F蛋白基因原核表达重组质粒的构建及表达

犬瘟热病毒水貂株H与F蛋白基因原核表达重组质粒的构建及表达苏凤艳;温铁峰;宗颖;王全凯【期刊名称】《华南农业大学学报》【年(卷),期】2012(033)003【摘要】将克隆质粒pMD-18T-H和pMD-18T-F分别进行双酶切,获得纯化的H 基因和F基因,在T4 DNA连接酶的作用下,亚克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得原核重组质粒pET28a-H和pET28a-F.将原核重组质粒转化大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta2( DE3)中进行表达,SDS-PAGE结果显示H基因和F基因分别表达相对分子质量约为31 400和38 200的融合蛋白,Western-blot检测结果显示,表达蛋白均可与CDV标准阳性血清呈阳性反应,表明原核表达的CDV H 蛋白和F蛋白在反应原性上具有与天然H蛋白和F蛋白同样的特性,可作为CDV 诊断用抗原,为CDV的免疫预防研究奠定基础.【总页数】4页(P417-420)【作者】苏凤艳;温铁峰;宗颖;王全凯【作者单位】吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118;吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118;吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118;吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达 [J], 苏凤艳;宗春苗;王卓聪;丁庆东;王全凯2.犬瘟热病毒GZ2株的分离鉴定及 H 基因原核表达质粒构建 [J], 曾智勇;周莉;汤德元;刘志杰;梁海英3.犬瘟热病毒GZ-Z株H基因原核表达载体的构建 [J], 薛磊4.犬瘟热病毒水貂分离株F1基因的克隆表达 [J], 张蕾;柴秀丽;张大鹏;张海玲;赵建军;高晗;白雪;徐磊;闫喜军5.犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达 [J], 袁小远;单虎;王志亮;李俊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬瘟热病毒GZ2株的分离鉴定及 H 基因原核表达质粒构建

犬瘟热病毒GZ2株的分离鉴定及 H 基因原核表达质粒构建曾智勇;周莉;汤德元;刘志杰;梁海英【摘要】The canine distemper virus(CDV GZ2) was isolated from suspicious CD pathologic material (poodle) and preliminarily identified, then the viral H gene was cloned and the sequence was analyzed to explore the difference of H gene among different isolated strains. The results showed that a CDV GZ2 strain was isolated by synchronization inoculation, and the viral H gene was cloned taking the viral RNA as templates, thus the prokaryotic expression plasmid was constructed. The viral H gene ORF was 1 824 bp, encoding 607 amino acids, 97. 4%~98. 5% consistent with the strains in China, but 89. 6%~95. 6% with the strains abroad, and 89. 6% ~ 91. 6% with vaccine strain. CDV GZ2 and the strains isolated from northeast area in China had the same ancestor, but the genetic relationships between CDV GZ2 and the strains from abroad were far.%对疑似CD的贵宾犬病料进行了CDV的分离和初步鉴定以及H基因的克隆和序列分析,以探讨不同分离株之间H基因的差异.结果表明:采用同步接种的方法,分离到1株犬瘟热病毒(CDV GZ2),并以其RNA为模板,扩增克隆了该病毒血凝素(H)基因,进而构建原核表达质粒pET-H.该毒株H基因ORF大小为1 824 bp,可编码607个氨基酸;与国内分离株氨基酸一致性为97.4％～98.5％,与国外分离株为89.6％～95.6％,与疫苗株在89.6％～91.6％.进化分析表明:CDV的分布具有一定地域性,CDV GZ2与国内东北地区分离株亲缘关系近,而与国外分离株亲缘关系相对较远.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2012(040)008【总页数】4页(P165-168)【关键词】犬瘟热病毒;分离鉴定;H基因;原核表达;质粒构建【作者】曾智勇;周莉;汤德元;刘志杰;梁海英【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025 ;贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学教学实验场,贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S852.65+5犬瘟热（Canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一种严重危害犬类、毛皮动物的高度接触性传染病。

重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定

重组人ASCT2胞外结构域ECL2在大肠杆菌中的表达及其鉴定欧阳东云;徐丽慧;高琦;郭贺;陈清;何贤辉【摘要】中性氨基酸转运蛋白(ASCT2)是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,ECL2是该受体的其中一个较大的胞外结构域.通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的胞外区ECL2序列,与pET-41b连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白在N-和C-端分别融合谷胱甘肽转移酶(GST)和His6标签,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,具有结合合胞素的潜在活性,这些结果为进一步研究ASCT2与合胞素的相互作用奠定了基础.【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2010(014)003【总页数】6页(P213-218)【关键词】合胞素;中性氨基酸转运蛋白;胞外结构域;原核表达【作者】欧阳东云;徐丽慧;高琦;郭贺;陈清;何贤辉【作者单位】暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学生物工程研究所,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632;暨南大学组织移植与免疫实验中心,中国广东,广州,510632;暨南大学再生医学教育部重点实验室,中国广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q786人类内源性病毒（human endogenous retroviruses，HERV）是远古逆转录病毒在人类基因组中的遗迹，约占人类基因组总量的8%.与今天仍然活跃的逆转录病毒一样，一个典型的人类内源性病毒也有必需的gag，pol和env 3个基因.这3个基因的两端被长末端重复序列（LTRs）分隔［1］.合胞素（syncytin）是HERV-W家族的包膜蛋白，主要表达于滋养层和合胞滋养层界面，一般认为由它介导单核的滋养层细胞融合，形成合胞滋养层，因此与胎盘形成和维持有关［2，3］.但近年亦发现该基因表达于乳腺癌［4］和结肠直肠癌［5］等细胞表面.尽管合胞素的表达与肿瘤形成的关系尚不清楚，至少人们相信合胞素可能具有潜在的早期诊断价值.现推测其可能的作用为：1）协助肿瘤细胞免疫逃逸.人免疫缺陷病毒（HIV-1）的gp41存在一个17肽，与C型病毒和D型病毒中的一段保守序列有同源性，具有免疫抑制功能［6］.有意思的是，相似的序列也存在于合胞素中（氨基酸残基373-397）［3］.表达HERV-H包膜蛋白的转基因小鼠细胞，能够在同种异基因小鼠体内成瘤，逃避宿主的免疫排斥［7］；2）与相邻的正常细胞表面受体相互作用，有利于肿瘤细胞的迁移.现已发现，合胞素的受体为D型逆转录病毒受体，即中性氨基酸转运蛋白ASCT2和ASCT1［2］.合胞素包裹的假HIV病毒颗粒，可以通过其受体，进入CD4阴性细胞，可能是造成母婴传播的部分原因.此外，表达合胞素的癌变细胞，也可以通过其受体与相邻的正常细胞（如内皮细胞）［8］相互融合.但是，癌变细胞与正常细胞通过合胞素及其受体而相互融合，对于肿瘤发生的影响，也还存在争论.一种观点认为癌变细胞可以籍此获得p53和Rb等肿瘤抑制因子，抑制癌变细胞向恶性肿瘤发展，或走向凋亡；另一种观点则刚好相反，毕竟大家熟知的单克隆抗体的制备就是将产生抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，由此产生的杂交瘤细胞仍然具有永生能力.研究表明合胞素抗体、合胞素CHR肽段以及合胞素基因的反义核苷酸都可抑制细胞通过合胞素及其受体相互融合［9］.深入研究合胞素的表达及其与受体的相互作用，在临床上具有重要的意义.合胞素有可能成为抑制乳腺癌和结肠直肠癌的药物靶点，可能的途径包括通过受体或单克隆抗体封闭细胞表面合胞素，通过受体/抗体介导抗肿瘤药物或者通过受体/抗体介导细胞毒淋巴细胞对癌变细胞的杀伤作用.蛋白质分析表明，由541个氨基酸组成的合胞素受体ASCT2，有9个跨膜结构域.我们在大肠杆菌中表达和纯化了ASCT2其中一个主要的胞外结构域ECL2蛋白，为研究ASCT2与合胞素之间的相互作用奠定了基础.大肠肝菌DH5α、BL21（DE3）pLysS菌株和质粒pET-41b购自Novagen.小鼠抗His6抗体、TRIzol试剂购自Invitrogen公司.第一链cDNA的合成试剂盒（PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit，D6110）、蛋白质分子质量标准、DNA分子质量标准以及EcoRⅠ和XhoⅠ等内切酶为Takara公司（大连）产品.GSH-Agarose及二氨基联苯胺（DAB）为Sigma公司产品.辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠 IgG为 Jackson Immune Research产品（北京中山分装）.pEGFPN1为CLONTECH公司产品，本实验室保存.1.2.1 细胞培养及总RNA的提取人乳腺癌细胞MCF-7用RPMI-1640加10%胎牛血清常规培养，每周传代2次，至对数生长期时，收集1×107个细胞，按厂商说明书，用TRIzol试剂提取总RNA，电泳检测后，立即用于第一链cDNA的合成.1.2.2 pET-41b/ECL2表达载体的构建首先从MCF-7第一链cDNA中扩增包含ASCT2基因编码区全序列的DNA片段.上游引物为5′-GTG CTG TTA CTC AAC TCA GTC CT-3′，下游引物为5′-TCC ATT CCT CAT AAT CCA GTG T-3′.PCR反应条件为：94℃，1 min；98℃，10 s，68℃，2.5 min，35个循环；68℃，10 min；4℃保存.扩增产物理论大小为1 794 bp.然后用上游引物5′-T ATA CTC GAG GCC Acc ATG GTG GCC GAT CCT CCA CGA GAC TCC AAG GGG CTC G-3′，下游引物5′-G CCG AAT TCG CAT GAC TGA TTC CTT CTC AGA GG-3′，同样PCR条件扩增ASCT2基因全序列，扩增产物为1 649 bp.然后将扩增的DNA，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶，克隆至pEGFP-N1真核表达载体（pEGFP/ASCT2）.ASCT2胞外结构域ECL2，采用下列引物，直接从pEGFP/ASCT2中进行扩增，上游引物为5′-TAT GAA TTC TCT GCA GCC GGG CGC CGC CT-3′，下游引物为5′-TAT TCT CGA GGC TAC CCT CCA CCT CCT GCC CCA CGG GCA-3′，PCR反应条件为：94℃，1 min；98℃，10 s，68℃，1 min，35个循环；68℃，10 min；4℃保存.产物理论大小为251 bp.1.2.3 重组ECL2在大肠杆菌中表达PCR产物经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，与同样酶切的pET-41b连接（pET-41b/ECL2），转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定接入预期大小外源基因的转化子，送Invitrogen公司测序确认.测序正确的pET-41b/ECL2质粒，转化感受态BL21（DE3）pLysS细菌，挑取单菌落接种于LB液体培养基，37℃摇菌，并以0.2 mmol/L IPTG诱导外源基因表达.1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳参照文献［10］方法，收集处理菌液.超声破菌处理后得到的全菌、上清和沉淀样品（上样量为80 μg），经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（浓缩胶50 g/L，分离胶120 g/L SDS-PAGE），分别以考马斯亮蓝R-250染色和硝酸纤维素膜免疫印迹方法，分析目的蛋白条带.免疫印迹分析所用一抗为抗His6抗体（1∶3 300），二抗为羊抗鼠IgG（1∶3 000），二氨基联苯胺显色.1.2.5 蛋白质纯化融合表达GST标签的 ECL2蛋白以GSHAgarose柱（1 mL）进行纯化.超声破菌处理后得到的上清液，直接上PBS平衡的柱，以PBS-1% Triton X-100充分洗涤后，特异性结合的蛋白以3 mL含10 mmol/L还原型谷胱甘肽的PBS洗脱下来，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后超滤浓缩，并将缓冲液置换为PBS，快速冷冻后置-70℃保存备用.1.2.6 结合活性测定MCF-7细胞按每孔7 500个细胞接种于96孔板，培养48 h后，PBS-1%FCS洗2次，加入200 μL 0.1%NaN3的PBS孵育30 min，同上洗后加入50 μL不同浓度的ECL2或GST蛋白（带His6标签，每个浓度做3个复孔），于室温孵育3 h 后4℃过夜，洗后加入100 μL抗His6抗体（1∶3 000），二抗为HRP-羊抗鼠IgG（1∶3 000），邻苯二胺显色，以酶标仪（Bio-Rad Microplate Reader 680）读取490 nm光吸收值.数据以非配对t检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义.用RT-PCR的方法克隆ASCT2基因分两步进行.首先设计引物，分别对应ASCT2基因上游和下游的一段cDNA序列，并以从MCF-7细胞总RNA逆转录获得的第一链cDNA为模板，扩增出预计大小（1 794 bp）的DNA片段（图1，泳道1）.然后以此为模板，扩增ASCT2基因自起始密码子至终止密码子（不含）的DNA片段，电泳检测显示，扩增片段大小与预计大小相符（1 649 bp，含引物两端附加的酶切位点）.产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，与pEGFP-N1载体连接，转化DH5α大肠杆菌，卡那霉素筛选多个抗性单克隆，提取质粒后经双酶切鉴定，证明已插入预计大小的外源基因（图1，泳道2、3、4）.测序分析显示，这3个克隆插入的外源基因序列完全相同，表明已成功获得ASCT2基因的cDNA编码区全长序列，该序列已在GenBank登录，登录号为GQ919058.利用跨膜结构蛋白分析工具（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/，http：//phobius.sbc.su.se）分析表明，ASCT2为9次跨膜蛋白，其中153～227位氨基酸为其中一个较大的胞外结构域（ECL2）.以克隆的 ASCT2全长序列（pEGFP/ ASCT2）为模板，设计特异性引物，扩增ECL2序列.电泳分析表明，扩增片段大小与预期相符（251 bp）（图2，泳道1）.产物经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，与pET-41b载体（图2，泳道2）连接.筛选接入目的片段的阳性克隆（图2，泳道4），经测序验证插入序列为ECL2目的片段，其5′端融合谷胱甘肽-S-转移酶（GST）编码序列，3′端含编码甘氨酸-丝氨酸接头（引物来源）和编码6个组氨酸（质粒来源）序列，由此获得原核表达载体pET-41b/ECL2.将构建的pET-41b/ECL2原核表达载体转化E.coli BL21（DE3）pLysS，得到含重组质粒的基因工程菌.细菌在37℃条件下摇菌培养，至OD值约0.6时，加IPTG诱导5 h后，超声破菌，分别制备全菌、上清、沉淀样品.各样品经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色表明，未经IPTG诱导的工程菌不表达外源蛋白；经IPTG诱导后，分别在全菌、上清和沉淀样品中，均可检出分子质量约为45 kD的外源蛋白，与ECL2融合蛋白（含上游GST和下游His6标签）理论值相符（图3a）.对比诱导前后蛋白条带（全菌）的变化，并经法国VL公司PhotoCapt Ver11.01软件分析，外源蛋白表达仅占细菌总蛋白量的3.5%.免疫印迹分析进一步证明上述45 kD蛋白条带为带有His6标签的ECL2（图3b）.表达的外源蛋白同时存在于上清和沉淀样品中，说明该融合蛋白能可溶性表达，但有较大部分以包涵体的形式存在.将表达可溶性ECL2融合蛋白的上清液部分上GSH-Agarose柱，充分洗柱后，以10 mmol/L还原型谷胱甘肽将结合的蛋白从柱上洗脱下来，SDS-PAGE分析显示，获得的蛋白分子质量与ECL2融合蛋白相符，纯度为95%（图4，泳道1）.进一步以免疫印迹分析，显示蛋白含有His6标签（图4，泳道3）.利用表达合胞素的MCF-7细胞分析ECL2融合蛋白与合胞素的结合活性.文献报道［8］，合胞素蛋白表达于MCF-7细胞表面.我们通过RTPCR的方法也检出该细胞转录较高水平的mRNA（数据略）.ECL2蛋白与MCF-7结合活性见图5，结果显示ECL2能与MCF-7特异性结合，其活性明显高于GST蛋白.人类内源性病毒（HERV）是古代逆转录病毒感染，进入人类基因组，并通过生殖细胞遗传至今.由于突变产生的序列缺失或提前终止，大多数人类内源性病毒的基因已失去了翻译活性［11］.但是，也有些基因，如HERV-W家族的包膜蛋白基因（env），仍然保留了完整的开放读码框，其编码的蛋白，具有细胞融合功能，故称为合胞素（syncytin）.合胞素主要表达于胎盘组织，少量表达于睾丸，前者可能与合胞滋养层的形成有关，后者可能与精卵结合有关.通过体外诱导（如毛喉素（forskolin）刺激BeWo细胞）［12］或转染（如中国仓鼠细胞）［13］而表达合胞素基因的细胞，都可以与受体细胞融合.在缺氧环境下，合胞素基因的表达下降，细胞滋养层不能正常融合发育成合胞体滋养层，引起先兆子痫（pre-eclampsia）［14］.因此，人们推测合胞素的主要生理功能可能有两个，一是促使细胞滋养层融合，形成合胞滋养层，为胎儿提供一个发育的环境，二是抑制母体免疫系统的排斥，因为合胞素蛋白中含有一个具有免疫抑制功能的多肽片段.合胞素在人体中的表达受到严格的调控，是一个有高度组织特异性的表达基因.该基因十分保守.HERV-W家族作为内源性病毒固定于人类基因组的时间大概是2 500万年到4 000万年前，早于新大陆猴与旧大陆猴的分化［15］，但该基因的转录仅限于人类，而不在旧大陆猴体内表达［16］.我们分别从正常胎盘组织和乳腺癌MCF-7细胞中克隆的合胞素基因序列，均与GenBank报道的序列完全相同.目前也尚未见到有该基因序列突变的报道.人们有理由相信，该基因的异常表达，可能会引起灾难性的后果.现已发现，合胞素高表达于绒癌、乳腺癌、直肠癌等癌细胞［4，5］.转基因表达合胞素的仓鼠CHO-52细胞，可以抵御药物诱导的凋亡［13］.可以预见，合胞素基因在癌症发病机制中的作用，将成为研究的热点.我们以前的研究表明，CD40的胞外区即具有与其天然配体CD40L的结合活性［10］.有研究发现，在小鼠移植模型中，可溶性的CD40-Ig对移植物抗宿主病的发生具有明显的保护作用［17］，而转基因表达的CD40-Ig的胰岛异种移植物的存活时间大大延长［18］，说明可溶性CD40-Ig能有效阻断CD40-CD40L的相互作用而发挥抑制对移植物的排斥反应.利用膜蛋白的天然配体的胞外区，阻断配体的细胞信号传导，其突出优点是不会因为诱导抗体而削弱两者之间的相互结合. 合胞素介导细胞之间的相互融合，可能是与其受体ASCT2（以及ASCT1）之间相互作用的结果.通过膜蛋白分析，ECL2和C-末端是ASCT2的两个较大的胞外区.克隆这两个片段，可用于研究合胞素和受体之间的相互作用.由于ECL2仅有75个氨基酸，为尽量保持其天然构象，同时有利于分离纯化，我们将它的氨基端与谷胱甘肽转移酶偶联，在羧基端与6个组氨酸（His6）偶联.用His6抗体检测重组蛋白，分别在细菌裂解液上清和沉淀检出45 kD的清晰条带，说明重组蛋白在一定条件下可以可溶性表达.重组蛋白的可溶性表达，有利于保持蛋白的天然构象，也有利于后期重组蛋白的活性和功能检测.乳腺癌细胞MCF-7组成性表达合胞素［8］，因此可用于检测ECL2蛋白与合胞素的结合活性.我们的结果显示，ECL2蛋白与MCF-7具有明显的结合活性，提示ASCT2主要胞外区ECL2可能是与合胞素结合的主要部位.进一步的研究将通过定点突变等技术阐明ASCT2上参与结合的具体位点和氨基酸残基.总之，我们从人乳腺癌细胞中成功克隆了ASCT2的cDNA编码区全长序列，构建了该蛋白的ECL2胞外区原核表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，纯化产物具有与合胞素结合的潜在活性.这些结果为进一步研究该胞外区的活性和功能提供了条件.【相关文献】[1] BANNERT N，KURTH R.Retroelements and the human genome：new perspectives on an old relation[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（Suppl 2）：14572-14579.[2] BLOND J L，LAVILLETTE D，CHEYNET V，et al.An envelope glycoprotein of the human endogenous retrovirus HERV-W is expressed in the human placenta and fuses cells expressing the type D mammalian retrovirus receptor[J].J Virol，2000，74（7）：3321-3329.[3] MI S，LEE X，LI X，et al.Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis [J].Nature，2000，403（6771）：785-789.[4] LARSSON L I，HOLCK S，CHRISTENSEN I J.Prognostic role of syncytin expression in breast cancer[J].Hum Pathol，2007，38（5）：726-731.[5] LARSEN J M，CHRISTENSEN I J，NIELSEN H J，et al. Syncytin immunoreactivity in colorectal cancer：potential prognostic impact[J].Cancer Lett，2009，280（1）：44-49.[6]DENNER J，NORLEY S，KURTH R.The immunosuppressive peptide of HIV-1：functional domains and immune response in AIDS patients[J].AIDS，1994，8（8）：1063-1072.[7] MANGENEY M，de PARSEVAL N，THOMAS G，et al.The full-length envelopeofanHERV-H humanendogenous retrovirus has immunosuppressive properties[J].J Gen Virol，2001，82（Pt 10）：2515-2518.[8] BJERREGAARD B，HOLCK S，CHRISTENSEN I J，et al. Syncytin is involved in breast cancer-endothelial cell fusions [J].Cell Mol Life Sci，2006，63（16）：1906-1911.[9] LARSSON L I，BJERREGAARD B，TALTS J F.Cell fusions in mammals[J].Histochem Cell Biol，2008，129（5）：551-561.[10]何贤辉，徐丽慧，刘毅，等.重组人CD40胞外结构域在大肠杆菌中的表达和纯化鉴定[J].免疫学杂志（HE Xian-hui，XU Li-hui，Liu Yi，et al.Purification and identification of human CD40 extracellular domain expressed in Escherichia coli[J].Immunol J），2006，22（2）：195-198.[11]LÖWER R，LÖWER J，KURTH R.The viruses in all of us：characteristics and biologicalsignificance of human endogenous retrovirus sequences[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（11）：5177-5184.[12]KUDO Y，BOYD C A.Changes in expression and function of syncytin and its receptor，amino acid transport system B（0）（ASCT2），in human placental choriocarcinoma BeWo cells during syncytialization[J].Placenta，2002，23（7）：536-541.[13]KNERR I，SCHNARE M，HERMANN K，et al.Fusiogenic endogenous-retroviral syncytin-1 exerts anti-apoptotic functions in staurosporine-challenged CHOcells[J].Apoptosis，2007，12（1）：37-43.[14]LEE X，KEITH J C Jr，STUMM N，et al.Downregulation of placental syncytin expression and abnormal protein localization in pre-eclampsia[J].Placenta，2001，22（10）：808-812.[15]VOISSET C，BLANCHER A，PERRON H，et al.Phylogeny of a novel family of human endogenous retrovirus sequences，HERV-W，in humans and other primates[J].AIDS Res Hum Retroviruses，1999，15（17）：1529-1533.[16]CÁCERES M，NISC ComparativeSequencingProgram，THOMAS J W.The gene of retroviral origin Syncytin 1 is specific to hominoids and is inactive in Old World monkeys [J].J Hered，2006，97（2）：100-106.[17]LIU H，MAO N，HOU C，et al.Protective effect of human CD402Ig fusion protein in a murine model of acute graftversus-host disease[J].Chin Med J（Engl），2001，114（7）：685-689.[18]JIN Y Z，XIE S S.Bicistronic adenovirus-mediated gene transfer of CTLA4Ig gene and CD40Ig gene result in indefinite survival of islet xenograft[J].Transplant Proc，2003，35（8）：3165-3166.。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3[导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。

林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 )【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。

方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。

结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。

传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。

传至10代仍具有良好的增殖活性。

流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。

结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。

【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。

盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定

盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定作者：陈健康张伟刘楠楠刘利兵田菲铁茹【摘要】目的：盘状结构域受体2（discoidin domain receptor2, DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶，研究DDR2在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用. 方法：在毕赤酵母中表达DDR2胞外区片段（不含信号肽和跨膜区，命名为DR），并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定，以备将来用作DDR2的特异性阻断剂. 结果：获得了两株较高表达His DR融合蛋白的毕赤酵母克隆；其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的18%；经Ni NTA(nitric tri acetic acid)柱纯化后，获得了纯度约90%以上的可溶性His DR融合蛋白；竞争结合抑制实验显示，His DR具有阻断和细胞表面天然DDR2受体结合的功能. 结论：所表达的融合蛋白His DR具有抑制天然DDR2功能的作用.【关键词】盘状结构域受体2：胞外区；基因表达；阻断剂【Abstract】AIM: To investigate the role of discoidin domain receptor 2 (DDR2) in the destruction of cartilage in rheumatoid arthritis (RA) and tumor metastasis. METHODS: We expressed extracellular domain of DDR2 fused with a His tag to increase protein solubility and facilitate purification (without signal peptide and transmembrane domain, designated DR) in Pichia pastoris, purified the expressed protein, andcharacterized its function, for the purpose of future application as a specific DDR2 antagonist. RESULTS: Two clones with relatively high expression of HisDR were obtained. After purification by a Ni NTA (nitric tri acetic acid) chromatographic column, soluble fused His DR with over 90% purity was obtained. Competitive binding inhibition assay demonstrated that the expressed His DR could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors on synovial cell surface. CONCLUSION: Extracellular domain of DDR2 fused with a His tag could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors.【Keywords】discoidin domain receptor 2; extracellular domain; gene expression; blocker0引言盘状结构域受体(discoidin domain receptors，DDR2)是一类带有盘状结构域的受体型酪氨酸激酶，这类激酶在哺乳类动物体内有两种，分别为DDRl和DDR2［1］. 研究发现，这类激酶广泛分布，与某些肿瘤的转移相关，其中DDRl表达于肿瘤的组织细胞而DDR2表达于间质细胞［2-6］. 人关节滑膜组织也表达DDR2［7］. 对于DDR2，纤维性胶原，如I,Ⅱ和Ⅲ型胶原，是它的配体，胶原与DDR2的结合可上调细胞MMP1的表达［8］. 为了研究DR2在肿瘤转移和类风湿性关节炎中的作用，DDR2特异性阻断剂将是一个有力的工具. 但由于DDR2是一种比较新的分子，目前对它的研究又不多，所以尚无特异性的受体阻断剂. 可溶性受体作为特异性受体阻断剂已被广泛应用于多种受体的功能研究．甚至作为抑制剂进入临床治疗. 其机理是在细胞外，外源的模拟受体分子由于与天然受体结构相同而竞争性地与相应配体结合，从而阻断了配体与天然受体的结合，也就抑制了配体和受体相应的功能.我们采用此策略对DDR2胞外区用毕赤酵母系统进行了表达. 为了增加蛋白质的可溶性，选择了融合表达方式：采用pPIC3.5K载体，表达His融合蛋白. 融合蛋白经纯化后，通过竞争抑制实验验证其是否阻断配体II型胶原与细胞表面DDR2的结合，通过细胞实验验证其是否抑制II型胶原刺激下的细胞MMP l的分泌.1材料和方法1.1材料重组质粒pRset A ddrg2由本室构建；pPIC3.5K酵母表达载体、酵母GS115菌种、氨基酸混合物、大肠杆菌E.coli Top 10 F 购自invitrogen公司；酵母氮碱（YNB）、酵母消解酶、酸洗玻璃珠、Tween20为Sigema公司产品；山梨醇、胶回收和质粒提取试剂盒为上海华舜生物技术公司产品；鼠抗6His mAb, NTA亲合介质购于Qiagen公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology公司；Western发光底物为Pierce公司产品，NC膜购于Amersham公司.1.2方法1.2.1PCR引物设计pPIC3.5K的多克隆位点只有EcoRI和NotI 适合ddrg2插入，考虑到Kozak序列（ACC ATG G）有利于外源基因在酵母中的表达，在6 His翻译起始码ATG上游引入ACC，又将ATG 后的C碱基突变为G. 两条引物分别为：5′端为：5′CGGAATTCACCATGGGGGGTTCTCATCATCATCAT 3′和3′端为：5′CGGGCGGCCGCTTAAGTGTTGCTGTCATCAACTTTAAGCATTGG 3′.1.2.2PCR产物回收、克隆及序列鉴定将PCR产物回收后直接与pMDl8T载体连接，转化大肠杆菌后挑克隆酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送基康公司测序.1.2.3DR片段在pPIC3.5K载体中的亚克隆大量提取重组T载体质粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定.1.2.4重组载体的酵母电转化取10 μL（约5 μg）SalⅠ单酶切线性化的pPIC3.5K ddr2重组质粒与80 μL酵母电转化感受态细胞混匀，转移于预冷的0.2 cm电转化杯，冰浴5 min. 电转化后（参数为1500 V, 25 μF, 200 Ω）立即加入500 μL预冷的1 mol/L山梨醇，混匀，铺于RDB板，30℃培养3~4 d. 以上过程同时做空载体对照.1.2.5多拷贝整合重组酵母的筛选用2 mL的1 mol/L山梨醇收集所有酵母重组菌落后混匀，分别取100~200 μL铺于含G418分别为0,0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 5 mg/mL的YPD板上，30℃培养3~4 d.1.2.6重组酵母菌落的PCR鉴定挑含G418浓度较高的YPD 板上的单菌落于0.5 mL离心管中，加10 μL去离子水、5 μL 5 U/μL的酵母消解酶混匀，30℃温育10 min，再-70℃冻10 min. 冰融后作为PCR模板，PCR引物为pPIC3.5K载体多克隆位点两侧的引物：5′端为：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′；3′端为：5′GCAAATGGCATTCTGACATCC3′. PCR反应参数为：94℃30 s；56℃1 min；72℃90 s，30个循环.1.2.7DDR2DR 蛋白的酵母诱导表达及鉴定挑多拷贝重组酵母单菌落于30 mL的MGY培养液中，30℃, 250 r/min培养18 h. 室温2500 r/min离心5 min，菌体重悬于300 mL的MM培养基中. 30℃培养3 d（期间每隔24 h加甲醇至5 g/L）后离心收菌，菌体沉淀用10 mL裂解液重悬后，加入等体积的酸洗玻璃珠剧烈振荡30 s；冰浴30 s，重复8次. 4℃高速离心10 min，上清为裂菌液. 取15 μL裂菌液进行SDS PAGE和Western Blot鉴定表达.1.2.8DDR2DR蛋白的亲合纯化用10 mL洗涤液平衡NTANi2+柱，将裂菌液上样. 用5 mL Lysis缓冲液洗柱，再用15 mL Washing缓冲液洗柱，用3 mL Elution缓冲液洗脱DDRG2蛋白，收集洗脱液，0.5 mL/管.1.2.9竞争结合抑制实验包被RA细胞于96孔板上，在40 g/L 多聚甲醛中固定24 h：PBS洗涤5 min共3次. 加入倍比稀释的His DR溶液. 空白对照为His纯化蛋白质洗脱液（内无蛋白质），阴性对照为His纯化蛋白质(用pRSETA空载体转化大肠杆菌表达和纯化得到)，浓度为0.1 mg/L,各孔加入等量的II型胶原(不溶型，超声打散)的PBS液，37℃温育1 h：PBS洗涤5 min共3次：加入抗Ⅱ型胶原抗体，37℃温育1 h：PBS洗涤5 min共3次. 加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃温育0.5 h. PBS洗涤5 min共3次. 加入ABTS显色液显色. 在ELISA仪上检测A410的吸光度.2结果2.1DDR2胞外区片段DR的PCR扩增、克隆和序列分析10 g/L 琼脂糖电泳显示，PCR产物为约1.3 kb的特异性片段，将此条带回收，即与pMDl8T载体连接，酶切鉴定后，对其中一个阳性克隆进行测序，并将序列在GenBank中进行分析，结果显示，序列完全正确. 图1显示，PCR产物和重组pMDl8T载体酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果.2.2重组酵母表达载体pPIC3.5K DR的构建及鉴定大量提取重组pMDl8T载体质粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定. 图2显示，重组pPIC3.5K DR载体的琼脂糖凝胶电泳结果.2.3重组酵母菌的筛选和PCR鉴定酵母电转化后每个RBD板上约长出5×103个His阳性单菌落，G418浓度筛选最高为4.0 mg/mL，根据同源重组一个载体约抵抗0.25 mg/mL G418估算，同源重组入同一酵母菌的pPIC3.5K ddrg2串联拷贝数最高可达到15个以上. 图3显示，重组酵母菌的PCR鉴定结果.2.4DR蛋白的表达和鉴定对PCR鉴定后的3号和4号重组菌进行目的蛋白质的诱导表达，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，3, 4号阳性克隆细菌在约46 ku处均有一新生表达条带（His DR），与目的蛋白质大小相符（图4）. 根据薄层扫描结果分析，上清中的新生蛋白质约占融合蛋白质总量的18％. Western Blot验证结果显示：6 His DDRG2胞外区蛋白DR在毕赤酵母中可以表达，且为可溶性表达（图5). 2.5His DR蛋白的纯化利用Ni NTA agarose柱通过金属螯合亲合层析进行纯化，从酵母表达菌体的裂菌液上清中纯化出了天然可溶形式的6 His融合DR蛋白. 本实验中，洗脱液中含有目的蛋白质，薄层扫描分析显示，目的蛋白质纯度达90.5％（图6）. 通过蛋白质定量，计算可溶性目的产物的得量约为400 μg/L细菌(结果未列出).2.6His DR对II型胶原与DDR2结合的竞争抑制功能我们摸索了在不同Ⅱ型胶原浓度(2.5 mg/L，0.25 mg/L，0.025 mg/L)下，梯度浓度(0.4mg/L，1∶10；1∶100；1∶200；1∶400；1∶800；1∶1 600；1∶3200；1∶6 400；1∶12 800；1∶25 600)的His DR蛋白对胶原结合于细胞表面DDR2的影响. 这里II型胶原为不溶型的，反应时悬浮于PBS中. 结果显示(图7)，对于胶原0.025 mg/L组，加入His纯化的其他蛋白做对照的孔显色最深，说明His纯化的其他蛋白无封闭II 型胶原与细胞表面DDR2结合的功能；对于HisDR孔，从0.4 mg/L～l∶800范围内，基本无显色，说明His DR可以完全封闭II型胶原与DDR2的结合；从1∶1600开始有显色，1∶3 200~1∶25 600显色逐渐加深，说明His DR的存在可以竞争抑制II型胶原与细胞表面DDR2的结合. 表达的His DR融合蛋白在体外可以与II型胶原结合，起到竞争抑制DDR2受体的作用.3讨论DDRs是一类受体型蛋白酪氨酸激酶，由于其胞外区含有一个类似盘基网柄菌（discoidin）凝集素盘状结构I的DR结构，而被称为DDRs. DDR2广泛表达于多种组织，这种广泛又有选择性的分布提示，DDR2的功能是重要且特异的［1］.原位杂交显示，在肺癌和卵巢癌中，DDR2在癌细胞周围间质细胞高表达，提示DDR2在肿瘤发展中具有作用，可能肿瘤细胞转化后的侵袭和转移特性由DDR2介导，因为恶性细胞突破组织屏障需要破坏胞外基质［8］. 其他能降解基质的人类疾病如肺纤维化、肝硬化、骨硬化病和类风湿关节炎可能都存在DDR2的表达和信号转导过程，推测DDR2的一个重要功能可能是通过调节胶原的合成和降解来控制胶原性胞外基质水平. 若能找到阻断DDR2作用的分子，则可能有助于预防肿瘤细胞的转移和减轻类风湿性关节炎的软骨破坏［9］.由于目前尚不清楚DDR2胞外区与配体胶原结合的具体部位，我们选择了DDR2胞外区全长含399个氨基酸的片段来表达，作为阻断剂. 在以往研究DDR2胞外区功能的时候，我们也曾构建了几种GST和6 His融合的DDRG2胞外区原核表达载体（4T1Ddrg2和pRset A Ddrg2），但它们的表达形式无一例外均是包涵体. 利用包涵体的变性和复性进行纯化，效果都不理想. 又考虑到变性和复性会影响DDRG2胞外区的结构与活性，于是我们便尝试在毕赤酵母中表达DDRG2胞外区蛋白.毕赤酵母表达系统是比较新的酵母外源蛋白表达系统. 毕赤酵母表达质粒通过同源重组整合入酵母基因组而随同酵母染色体一起复制. 同源重组时，毕赤酵母表达质粒可以通过体内和体外两种方式多拷贝整合于毕赤酵母基因组中. 由于不同的基因具有不同的特性，在毕赤酵母中表达时，不同外源蛋白的表达水平可能会有很大的差异. 我们的实验表明，DDR2DR在毕赤酵母表达系统中获得了表达，表达产物经过纯化后得到了纯度约为90.5％的融合蛋白. 竞争结合实验表明，融合蛋白His DR在0.2 μg/L的浓度下能完全阻断II型胶原与细胞表面天然DDR2的结合. 虽然不能完全阻断，但仍可以说明两个问题：一是NIH 3T3细胞和RA滑膜细胞中的DDR2介导MMP 1的表达或过表达；二是可溶性DDR2受体胞外区作为阻断剂，可以在一定程度下抑制这种表达.【参考文献】［1］V ogel W. Discoidin domain receptors: Structural relations and functional implications［J］. FASEB J, 1999, 13(Suppl): S77-S82.［2］Alvcs F, V ogel W, Mossie K, Millauer B, et al. Distinct structural characteristics of discoidin I subfamily receptor tyrosine kinases and complementary expression in human cancer［J］. Oncogene, 1995, 10 (3): 609-618.［3］Nemoto T, Ohashi K, Akashi T, et al. Over expression of protein tyrosine kinases in human esophageal cancer［J］. Pathobiology, 1997, 65 (4):195-203.［4］Weiner H L, Rothman M, Miller D C, et al. Pediatric brain tumors express receptor tyrosine kinases including novel cell adhesion kinases［J］.Pediatr Neurosurg,1996, 25(2): 64-72.［5］Barker K T, Martindale J E, Mitchell P J, et al. Expression patterns of the novel receptor like tyrosine kinase, DDR, in human breast tumors［J］. Oncogene, 1995, 10(3): 569-575.［6］Iai C, Lemake G. Structure and expression of receptor tyrosine kinase［J］. Oncogene, 1994, 9(3): 877-883.［7］Wang JC, Yao LB, Lu HS, et al. Expression analysis of protein tyrosine kinase in fibroblast like synovial cells of rheumatoid arthritis［J］. Med J Chin PLA, 2001, 26(2): 82-84.［8］Wang J, LüH, Liu X, Deng Y, Yao L et al. Functional analysis of discoidin domain receptor 2 in synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis［J］. J Autoimmun, 2002,19:161-168.［9］Zhang W, Ding T, Zhang J, Yao L et al. Expression of discoidin domain receptor 2 (DDR2) extracellular domain in pichia pastoris and functional analysis in synovial fibroblasts and NIH3T3 cells［J］. Mol Cell Biochem, 2006,290(12):43-53.。

骨疏康干预Beagle犬磨牙压低过程中转化生长因子β1及β-连环蛋白的表达

骨疏康干预Beagle犬磨牙压低过程中转化生长因子β1及β-连环蛋白的表达万哲;杜军;胡杨【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2023(27)28【摘要】背景:骨疏康可以有效促进破骨细胞的凋亡、提高骨密度和骨矿含量、抑制骨吸收。

但骨疏康在牙根吸收方面作用的研究匮乏,其调控作用机制尚不清楚。

目的:探讨骨疏康在Beagle犬正畸牙根吸收过程中的治疗效果及其对转化生长因子β1、β-连环蛋白表达的影响。

方法:将16只Beagle犬随机分为正常对照组(n=4)、蒸馏水组(n=6)与骨疏康组(n=6),正常对照组不进行任何干预,蒸馏水组与骨疏康组建立上颌第一磨牙压低模型,造模后分别每天灌胃蒸馏水与骨疏康(2.1 g/kg)。

干预6,9,12周,收集上颌第一磨牙牙根和牙周组织,采用苏木精-伊红染色观察病理变化,免疫组化检测转化生长因子β1、β-连环蛋白的表达水平。

结果与结论:(1)第一磨牙随时间推移有明显压低现象出现,在第12周效果最为明显;(2)苏木精-伊红染色显示,蒸馏水组磨牙组织随着加力时间周期的不断延长,破骨细胞数量呈上升趋势,骨吸收现象不断加重;骨疏康组磨牙的根吸收程度轻于蒸馏水组,骨修复能力和牙周组织的改建能力优于蒸馏水组;(3)蒸馏水组磨牙组织转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达量显著低于正常对照组(P<0.05);骨疏康组磨牙组织中转化生长因子β1和β-连环蛋白的表达水平随时间推移呈上升趋势,在9周和12周的表达水平显著高于蒸馏水组(P<0.05);(4)结果表明,骨疏康可能通过激活调节转化生长因子β1和β-连环蛋白,促进Beagle犬磨牙骨组织的成骨分化。

【总页数】5页(P4502-4506)【作者】万哲;杜军;胡杨【作者单位】新疆医科大学附属中医医院口腔科;新疆医科大学第一附属医院口腔医院口腔种植修复科【正文语种】中文【中图分类】R459.9;R318;R783.5【相关文献】1.犬切牙压低移动过程中牙周组织骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达2.微型钛钉种植体支抗压低犬上前牙过程中牙周组织骨保护素的表达3.Beagle犬磨牙压低过程中牙根吸收与压低力值的关系4.Beagle犬磨牙压低过程中牙根吸收与压低力值的关系5.骨疏康干预Beagle犬正畸牙根吸收过程中的成骨分化及机制因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定周井祥;薛江东;刘晔;张守峰;朱霞;扈荣良【摘要】为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2),本研究将PRRSV GP5蛋白基因表达盒连接于E3区部分缺失的CAV-2全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2中,构建重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5.并采用Pme Ⅰ和Asc Ⅰ双酶切和脂质体介导法,将其转染MDCK细胞,获得重组病毒rCAV-2-GP5.经酶切鉴定显示该重组病毒含有目的基因.经RT-PCR检测表明,rCAV-2-GP5能够转录相应GP5蛋白基因mRNA;western blot检测证实GP5蛋白在MDCK细胞中得到表达.体外连续传30代检测表明,rCAV-2-GP5具有良好的遗传稳定性.本实验为PRRSV新型疫苗的研制奠定了基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)012【总页数】4页(P920-923)【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒;GP5蛋白;犬2型腺病毒;重组病毒【作者】周井祥;薛江东;刘晔;张守峰;朱霞;扈荣良【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;内蒙民族大学动物科技学院,内蒙古,通辽,028000;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130062【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的，以怀孕母猪发生严重繁殖障碍及仔猪与育肥猪出现呼吸道症状为主的传染病[1]。

该病的防控以免疫预防为主。

狂犬病病毒核衣壳蛋白的原核表达与鉴定

狂犬病病毒核衣壳蛋白的原核表达与鉴定谷志鹏;向梦玲;凌洪权;骆璐;吴胜昔;董春霞;冉皑;郭宇【期刊名称】《重庆理工大学学报:自然科学》【年(卷),期】2023(37)2【摘要】为实现狂犬病病毒核衣壳蛋白在原核系统中高效表达,参考GenBank中发布的RV N基因序列(登录号为1489853),在不改变RV N蛋白氨基酸序列的情况下,对该基因的密码子进行优化,化学合成N基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a(+)/RV N,将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用His-tag镍柱进行重组RV N蛋白的纯化,对纯化后的RV N蛋白进行SDS-PAGE鉴定及Western blot分析。

结果表明:重组质粒双酶切后在1359 bp处有目的条带,经测序后与其所对应的已知基因序列完全相符,当重组菌在IPTG浓度0.1mmol/L、30℃诱导6 h,RV N蛋白表达量最高;经过镍柱纯化获得了RV N重组蛋白;BCA法测得重组RV N蛋白浓度达1.783 mg/mL;在51KD处可见明显的蛋白印迹,与预期目的条带相符;使用该方法成功在大肠杆菌系统高效表达了RV N蛋白,为后续狂犬病的检测与新型疫苗的研制奠定了基础。

【总页数】6页(P344-349)【作者】谷志鹏;向梦玲;凌洪权;骆璐;吴胜昔;董春霞;冉皑;郭宇【作者单位】重庆理工大学药学与生物工程学院;重庆市动物疫病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】R373.9【相关文献】1.狂犬病病毒糖蛋白胞外区基因的原核表达、纯化及鉴定2.狂犬病病毒CVS株核蛋白基因的原核表达、纯化及鉴定3.伪狂犬病毒截短VP5蛋白原核表达与鉴定4.铁蛋白与法氏囊病毒核衣壳蛋白重组蛋白的原核表达及纳米颗粒胞外自组装5.牛冠状病毒核衣壳蛋白原核表达及鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

发挥重要作用的负调控因子。它也是核因子ＫＢ受
体活化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａ
Ｂｌｉｇａｎｄ，ＲＡＮＫＬ）的诱饵受体 … 。破骨细胞的增
ＯＰＧ多克隆抗体（ＢＡ１４７５，博士德公司）；ＳｕｐｅｒＳ — ｉｎｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＴｒｉａｌＫｉｔ试剂盒（Ｐｉｅｒｃｅ，美国）；
ＴＲＩＺＯＬ、逆转录试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ，上海）；Ｂｅｇｌａｅ犬
操小马，赵春晖，梅陵宣
摘要目的转染骨保护素（ＯＰＧ）基因至Ｂｅａｇｌｅ犬骨髓基
穿刺抽取成年Ｂｅａｇｌｅ犬骨
的吸收。本试验通过体外分离、培养Ｂｅａｇｌｅ犬骨髓
基质细胞，并对其进行基因改造，尝试通过建立
维普资讯
．
１４０．
安徽医科大学学报
ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ２００７ＡＰｒ；４２（２）
重组质粒ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｂ・ＯＰＧ在Ｂｅａｇｌｅ犬骨髓基质细胞中表达与鉴定
量质粒送大连宝生物公司，用通用引物１－７从上游及
下游同时进行测序，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的ＯＰＧ序列［ｇｉ：３３８７３０５６］进行比对。
１．３Ｂｅａｇｌｅ犬骨髓基质细胞的分离与培养戊巴
基质细胞瞬时基因表达体系。主题词自由词成骨细胞；骨髓细胞；克隆，分子；基因表达；牙周疾骨保护素；Ｂｅａｇｌｅ犬
Ｒ３９４．３；Ｒ３９２．１１；Ｒ３９４．２病／治疗中图分类号
（约１０月龄，清洁级，安徽医科大学试验动物中
心）；其他常规试剂为进口分装或国产分析纯。
１．２提取和鉴定重组质粒ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｂ－ｏＰＧ取
文献标识码Ａ文章编号１０００—１４９２（２００７）０２— ０１４０— ０４
冻存的重组质粒ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｂ — ＯＰＧ菌液２００Ｉｘｌ铺板，３７￣Ｃ温箱培养振摇１４ｈ，挑取单个白色菌落接种于３ｍｌ氨苄抗性的ＬＢ培养基中，３７ｏＣ，２４０ｒ／ｍｉｎ．培养１２ｈ。以碱裂解法小提质粒，分别用Ｈｉｎｄｍ单
１．１主要实验材料
ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｂ — ＯＰＧ（本课题组
保存）；Ｂ．巯基乙醇（Ｓｉｇｍａ，美国）；脂质体转染试剂
盒Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国）；兔抗人
切，电泳显示切下的片段均与预期大小相符，经测序证实此基因与ＧｅｎＢａｎｋ中提供的序列［ｇｉ：３３８７３０５６］一致；ＲＴ－
ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｎｒｂｌｏｔ结果显示：重组ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｂ－ＯＰＧ在骨髓基质细胞中有表达。结论成功建立了ＯＰＧ基因修饰的骨髓
脂质体瞬时转染经鉴定的重组ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｂ－ＯＰＧ，并用ＲＴ－
ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｎｒｂｌｏｔ检测ＯＰＧ的表达水平。结果重组质粒ｐＳｅｃＴａｇ２／Ｂ．ＯＰＧ经ＨｉｎｄＩＵ单酶切及ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶
殖、分化、成熟的信号传导主要途径是ＲＡＮＫ／
ＡＮＲＫＬ／ＮＦ．ＫＢ或ＪＮＫ通路。近期研究表明，牙周膜细胞可表达ＯＰＧ和ＲＡＮＫＬ，并证明牙周膜细胞通过ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ系统来调节牙槽骨代谢的＿３Ｊ。检测牙周病患者的龈沟液研究发现
Hale Waihona Puke 质细胞（ＢＭＳＣｓ）中，并检测其表达能力，为基因工程技术治
疗牙周病提供物质基础。方法
ＯＰＧ基因修饰的骨髓基质细胞瞬时基因表达体系，为下一步试验奠定了细胞基础。
１材料与方法
髓２～３ｍｌ，通过全骨髓贴壁法获取ＢＭＳＣｓ。传代至第３代，
酶切及ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ双酶切３７ ℃，２ｈ。并将少
骨保护素（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ，ＯＰＧ）是一个由成骨细胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ，ＯＢ）分泌的、在调节骨代谢过程中