分子标记技术
ssr标记原理
ssr标记原理
SSR标记，即简单重复序列标记，是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。
它利用了DNA序列中的简单重复序列，这些重复序列通常由1-6个碱基组成，形成长串重复。
由于这些重复序列在不同个体间的数量存在差异，因此能揭示比其他标记技术更高的多态性。
SSR标记的基本原理是，根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。
由于核心序列串联重复数目不同，能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物。
将这些产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
SSR 标记具有一些优点，如一般检测到的是一个单一的多等位基因位点、微卫星呈共显性遗传，可鉴别杂合子和纯合子、所需DNA量少等。
在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时，必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
ssr分子标记技术存在问题
ssr分子标记技术存在问题SSR（Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis）分子标记技术是一种常用的分子生物学工具，用于检测DNA或RNA的序列变异。
然而，虽然SSR分子标记技术在许多领域都有着广泛的应用，但它也存在一些问题需要解决。
本文将探讨SSR分子标记技术存在的问题，并提出一些解决方案。
第一部分：介绍SSR分子标记技术首先，让我们简单介绍一下SSR分子标记技术。
SSR是指简单重复序列（Simple Sequence Repeats），也被称为微卫星序列，它是DNA 或RNA分子中短序列的重复单元。
SSR分子标记技术可以通过PCR扩增和凝胶电泳等方法来分析样品中这些重复序列的长度变异，从而研究基因型和表型之间的关系。
第二部分：SSR分子标记技术存在的问题然而，尽管SSR分子标记技术在基因型鉴定、种群遗传结构分析和品种选育等方面表现出了良好的应用前景，但它也存在以下几个问题：1. 数据分析复杂：SSR分子标记技术获得的数据通常需要进行复杂的分析，包括基因频率、遗传多样性等统计学参数的计算。
这对于非专业人士来说可能是一个挑战。
2. 缺乏标准化操作流程：不同实验室或研究机构之间使用的SSR分子标记技术操作流程可能存在差异，导致结果的可比性不高。
3. 多态性程度低：由于SSR分子标记技术只能分析简单重复序列，因此它对于复杂基因组的分析有一定局限性。
在某些物种中，SSR位点的多态性程度较低，导致分辨率不高。
第三部分：解决方案尽管SSR分子标记技术存在问题，但我们可以通过以下途径来解决这些问题：1. 开发简化的数据分析工具：研究人员可以开发易于使用且功能强大的数据分析工具，以简化SSR分子标记技术数据的处理过程，并提供可视化和统计学参数计算等功能。
2. 建立标准化的操作流程：国际间的合作可以制定和推广SSR分子标记技术的标准化操作流程，确保不同实验室或研究机构之间获得的结果具有可比性。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
分子标记技术原理方法及应用
分子标记技术原理方法及应用分子标记技术是一种用于检测和定位特定分子的方法。
其原理是通过将一种特殊的化学物质（标记物）与目标分子结合，然后利用标记物的性质来对目标分子进行分析和检测。
分子标记技术被广泛应用于生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域。
常用的分子标记技术有荧光标记、酶标记和放射性标记等。
荧光标记是一种将目标分子与荧光染料结合的技术。
荧光标记的原理是通过荧光染料的特性，使得目标分子在荧光显微镜下显示出特定的荧光信号，从而对其进行定位和分析。
荧光标记可以在细胞、组织和体内进行，具有灵敏度高、分辨率高和实时监测的优点。
常见的荧光标记方法有间接免疫荧光标记、原位杂交荧光标记和荧光蛋白标记等。
荧光标记技术广泛应用于细胞定位、蛋白质相互作用研究、细胞分析和分子诊断等领域。
酶标记是一种利用酶与底物反应的方法进行分子标记。
通常，酶标记将目标分子与特定的酶（如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）结合，然后通过对底物的催化作用产生显色或荧光信号。
酶标记在生物学检测中得到广泛应用，特别是在酶联免疫吸附试验（ELISA）中。
酶标记具有灵敏度高、稳定性好的特点，可以用于检测蛋白质、核酸和小分子等生物分子。
放射性标记是利用放射性同位素与目标分子结合的技术。
放射性同位素具有高灵敏度和长时间半衰期的特点，可以用于追踪和测定目标分子的存在和分布。
放射性标记技术广泛应用于细胞和分子影像学、放射性定位和药物代谢等领域。
分子标记技术在生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域有着广泛的应用。
在生物医学研究中，分子标记技术可以用于研究细胞和分子的结构和功能，探索疾病的发生机制和药物的作用机理。
在生物学检测中，分子标记技术可以用于检测和定位特定的生物分子，如蛋白质、核酸和小分子等，从而实现对生物过程的观察和分析。
在药物研发中，分子标记技术可以用于筛选和评价药物的活性和毒性，以及研究药物的代谢和药理学特性。
总之，分子标记技术的发展和应用为生物医学研究和生物学检测提供了强大的工具，有助于我们深入理解生命的奥秘和开发有效的治疗手段。
分子标记技术
（4）电泳结束，观察、拍照。
ISSR分子标记技术
ISSR引物 U807对两种铁皮石斛的扩增结果
ISSR引物 U826对两种铁皮石斛的扩增结果
实验原理
ISSR (inter-simple sequence repeat)即简单序列重 复间区是在微卫星技术基础上发展起来的一种新的分子标记。 其基本原理是:真核生物广泛存在简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），如（AT）n （GAC）n等。利用SSR 设计引物，并在引物的的3‘端或5’端加上2-4个随机核甘酸， 以保证引物与基因组DNA中SSR的3‘端或5’端结合，在PCR反应 中，锚定引物可引起特定位点退火，用来检测两个SSR之间 的一段短DNA序列的差异。所扩增的两个SSR区域之间的多个 条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性 表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰 富，因而可以检测到高的多态性。
٭
PCR反应体系
ddH2 O 14.8μl 10×PCR Buffer 2μl dNTP (10mM) 0.4μl Primer (5μM) 1μl Taq 酶(2U/μl) 0.8μl DNA(20ng) 1μl TOTAL 20μl 最后加一滴石蜡油密封，防止体系蒸发
ISSR标记的主要特点
٭
优点：ISSR 标记结合了RAPD 和SSR 的优点, 可同时检测多 个SSR座位；所需DNA模板的量少、多态性丰富, 无需试剂盒、 结果记录方便、实验成本低、操作简单、稳定性较高、呈孟 德尔式遗传
缺点：是PCR 扩增时最适反应条件需要一定时间摸索, 其标 记大多为显性标记, 在解决交配系统、计算杂合度和父系分 析等问题时效果不佳
SSR分子标记技术简述
SSR标记
SSR 标记是当今流行的分子标记技术之 一。尽管 SSR 分布于基 因组的不同位置，但其两端多是保守 的单拷贝序列，因此可以根 据两端的序列设计一对特异引 物，通过 PCR 技术将其扩增出来， 利用电泳分析技术获得长 度多态性， 即 SSR 标记。
SSR分子标记的优势
SSR在真核生物基因组中分布广
SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应 扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩 增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决 定基因型并计算等位基因频率。
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多态性丰富
其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率 高、遗传信息量大
SSR通常为显性标记，呈孟德尔式遗传
具有很好的稳定性和多态性 DNA用量少 技术要求低，成本低廉 PCR扩增的可重复性高
SSR标记的劣势
开发和合成新的SSR引物投入高、难度大 现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功 能基因 SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR 扩增的效果 SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等
SSR标记的原理Байду номын сангаас
微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星 数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同， 因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就 能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这 一想法，人们发展起了SSR标记。
由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保 守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片 段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工 合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出 来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个 体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这 一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩 增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重 复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多 的多态性，这就是SSR标记的原理
SSR分子标记技术简述
SSR标识旳基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，经过PCR反应 扩增微卫星片段，因为关键序列串联反复数目不同，因而能够用PCR旳措施扩 增出不同长度旳PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段旳大小决
定基因型并计算等位基因频率。
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因而造成多种位甚至不同个体间旳多态性，基于这 一想法，人们发展起了SSR标识。
因为基因组中某一特定旳微卫星旳侧翼序列一般都是保 守性较强旳单一序列，因而能够将微卫星侧翼旳DNA片 段克隆、测序，然后根据微卫星旳侧翼序列就能够人工 合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出 来。因为单个微卫星位点反复单元在数量上旳变异，个 体旳扩增产物在长度上旳变化就产生长度旳多态性，这 一多态性称为简朴序列反复长度多态性(SSLP)，每一扩 增位点就代表了这一位点旳一对等位基因。因为SSR反 复数目变化很大，所以SSR标识能揭示比RFLP高得多 旳多态性，这就是SSR标识旳原理
SSR标识
SSR 标识是当今流行旳分子标识技术之 一。尽管 SSR 分布于基 因组旳不同位置，但其两端多是保守 旳单拷贝序列，所以能够根 据两端旳序列设计一对特异引 物，经过 PCR 技术将其扩增出来， 利用电泳分析技术取得长 度多态性， 即 SSR 标识。
SSR分子标识旳优势
✓SSR在真核生物基因组中分布广 ✓多态性丰富 ✓其产物进行测序胶电泳分离时单碱基辨别率 高、遗传信息量大 ✓SSR一般为显性标识，呈孟德尔式遗传 ✓具有很好旳稳定性和多态性 ✓DNA用量少 ✓技术要求低，成本低廉 ✓PCR扩增旳可反复性高
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分子标记技术（图）
2008-07-21 00:00 来源：互联网点击次数：1479 关键词：分子标记
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标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。
与育种有关的遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。
早在1923年，Sax
等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。
作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA 组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA 变异的新技术手段，即分子标记技术。
与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA 形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息
一、常用的分子标记技术
利用分子标记技术分析生物个体之间DNA 序列差别并用于作图的研究始于1980年。
经过十几年的发展，现在的DNA 标记技术已有十多种，主要有两大类。
（一）、基于Southern杂交的分子标记
这类标记利用限制性内切酶酶切不同生物体的DNA 分子，然后用特异探针进行Southern杂交，通
过放射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA 的多态性。
主要有（一）限制性片段长度多态性（Restrict ion Fragment Length Polymorphism）
限制性片段长度多态性，简称RFLP，是出现最早，应用最广泛的DNA 标记技术之一。
RFLP标记非常稳定，它是一种共显性标记，在分离群体中可区分纯合体与杂合体，提供标记位点完整的遗传信息。
多种农作物的RFLP分子遗传图谱已经建成。
但其分析所需DNA 量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素，尽管可用非放射性同位素标记方法代替，但成本高、成功率低，且实验检测步骤较多，依然影响其使用、推广。
图7-2 RFLP图谱
（二）小卫星DNA （Minisatellite DNA ）
小卫星DNA （Minisatellite DNA ）又称数目可变串联重复序列（Variable Number of Tandem R
epeat，VNTR）是一种重复DNA 小序列，为10-几百核苷酸，拷贝数10-10000不等。
多态性由于重复单位之间的不平衡交换，从而产生不同等位基因，可通过杂交检测出。
其缺点是多态性分布集中，合成探针困难，应用并不广泛。
二、基于PCR技术的分子标记
（一）随机扩增片段长度多态性DNA （Random Amplified Polymorphic DNA ）
随机扩增片段长度多态性DNA ，简称RAPD技术，是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的遗传标记技术。
RAPD以PCR为基础而又不同于经典的PCR，一般采用10个核苷酸的DNA 序列为引物，扩增时退火温度降至35℃左右。
与其它标记相比,RAPD具有以下优点：1）不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一套引物可用于不同生物的分析。
2）操作简单，可实现自动化，短期内可利用大量引物完成覆盖的分析。
3）不需制备探针、杂交等程序，成本较低。
4）DNA 用量少（10ngDNA 即可完成一次分析），允许快速、简单地分离DNA 。
已在遗传图谱构
建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用（惠东威，1992）。
RAPD是一种显性标记，分离群体中纯合体和杂合体通过后代才能区别，并且由于该技术采用的是随机引物扩增，扩增结果的稳定性较差，这在一定程度上限制了其发展。
图7-4 RAPD图谱
（二）特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Polymorphism，SAP）
RFLP技术成本高，实验步骤多，周期长；RAPD标记稳定性较差，不利于育种中应用。
在用RFLP 和RAPD分析找到多态性DNA 片段以后，将它们转化为特异性扩增子多态性（Specific Amplificon Poly morphism，SAP）或称序标位（Sequence Tagged Sites，STS）可以解决这些缺点。
主要包括以下两种：
1）酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）将RFLP探针的两端测序，合成22-mer引物进行PCR扩增，扩增产物往往无多态性，需用内切酶酶解产物，产生多态性。
2）序列特异性扩增区（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）和位点特异相关引物（Allele－Specific Associated Primers，ASAP），对RAPD、AFLP片段两端测序，根据DNA 序列，合成24-mer双引物进行PCR扩增。
SCAR、CAP可以降低了成本，操作简便，稳定性强，对仪器要求低，
可实现自动化分析，适合于大样本的快速分析。
（三）简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）
简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）或称微卫星DNA （Microsatellite Repeat）、简单串联重复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。
在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA ”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
（四）扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）
扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP），又称选择性限制片段扩增（Selective Restriction Fragment Amplification）。
先将DNA 用内切酶酶解，然后接上接头，根据接头的序列和酶切位点设计引物，即接头+酶切位点+2-3个核苷酸，然后进行特异性PCR扩增。
扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可产生数量丰富的带型标记，分辨率高，是一种十分理想和高效的遗传标记。
图7-5 AFLP的银染检测结果。