基因工程实验报告

基因工程

实

验

报

告

甘薯ADK基因反义载体的构建

（西南大学生命科学学院，重庆400715）

摘要：以甘薯为材料，提取甘薯的基因组DNA，以其基因组DNA为模板在体外克窿甘薯ADK基因核心片段并电泳检测基因的纯度。利用含有pHB载体质粒的大肠杆菌提取pHB质粒。将PHB质粒和ADK基因片段进行双酶切，构建ADK基因反义载体，检验是否构建成功，最后转入大肠杆菌中检验观察是否转入成功。

关键词：甘薯；腺苷酸激酶基因（adk）；反义载体；PCR

英文摘要：

1.综述

1.1甘薯

甘薯(Ipomoea batatas (L. ) Lam.)属旋花科(Convolvulaceae)甘薯属((Ipomoea)蔓生一年生草本植物，染色体数为2n=6x=90。在我国因各地语言差异，甘薯的中文俗名较多，又名番薯、白薯、地瓜、山芋、红芋、红苔、红薯等[u1，其英文一般写作sweet potato，在美国也有写为sweetpotato[27. 1989年美国甘薯合作者组织规定用Sweetpotato表示甘薯，以便更准确地表达甘薯的特性及与Potato(马铃薯)相区别[37。目前，此表达方式已在美国、澳大利亚等许多英语国家采用，并逐步被其他国家或地区的甘薯研究者所接受〔引。目前学术界一致公认甘薯起源于热带美洲，经“Kumara"路线、"Batata"路线、"Kamote"路线传播到世界各地〔.5J，由于甘薯具有耐旱、耐痔，繁殖力强、适应性广、栽培简便、产量高，用途广泛等特点，现已在全世界广泛栽培。我国的甘薯栽培己有400多年的历史。据史料记载，甘薯于16世纪的1563-1594年间，经陆海多种渠道传入我国。在我国，甘薯的栽培分布很广，南起海南诸岛，北至内蒙古，西北达陕西、陇南和新疆一带，东北经辽宁、吉林延展到黑龙江南部，西南抵藏南和云贵高原。‘四川盆地、黄淮海、长江流域和东南沿海各省是我国甘薯的主

产区

1．2 ADK基因

腺昔酸激酶(EC.2.7.4.3, adenylate kinase, ADK)催化ATP和AMP合成两分子ADP的可逆反应，是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶。IbADK全长1314bp，其编码区长度为855bp，编码长度为284个氨基酸残基的ADK蛋白(IbADK)；生物信息学预测IbADK分子量为30.86kDa，等电点为6.46。

1.3 反义载体

将目的基因与载体用相同限制性内切酶酶切后，将目的片段反向插入载体中，可以起到基因沉默的目了，构建过程主要是酶切，连接检测，最后测序确定。

1.4质粒（Plasmid）

是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，他具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

2．材料与方法

2.1材料

2.1.1大肠杆菌：含PHB载体质粒的大肠杆菌；含PMD-T-aIb ADK质粒的大肠杆菌；大肠杆菌DH5α菌株。

2.1.2仪器

PCR扩增仪，PCR用薄壁管，电泳仪，恒温水浴锅，THZ-C水平摇床1台，冷冻离心机1台，涡旋仪1台，超净工作台1台，移液枪1套，锥形瓶若干，培养皿2套，室内使用的大中型枪头各2盒，浮标1个，室内使用的1.5mL的EP管若干，涂棒1根，凝胶成像系统1台，恒温培养箱1台，一次性PE手套，计时器1个，药勺若干。

2.1.3试剂

氨苄青霉素，AP/Amp：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。

卡那霉素，km/Kan：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤。

TIANGEN质粒小提试剂盒（离心柱型）；BamHΙ、XbalΙ（Fermentas公司）；ddH2O；TIANGEN 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）；DNAligation连接试剂盒；CaCl21瓶；常规PCR试剂1套；上游引物FaADK；下游引物RaADK；TBE缓冲液；回收级琼脂糖；溴化乙锭；Taq DNA聚合酶；10×PCR buffer；MgCl2；dNTP；marker（DL2000、λDNA/HindⅢ

各1支）。

2.1.4培养基

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，灭菌后4℃保存。LB琼脂平板（400ml、800ml）：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH7.0，灭菌后冷至60℃左右铺平板，视具体需要加相应抗生素做成Amp（50mg/L）或Kan （50mg/L）等平板。

2.2方法

2.2.1常用试剂及培养基的配制

配制LB液体培养基和LB琼脂平板。

2.2.2 质粒DNA的提取、纯化、电泳检验及酶切

1、将含有pHB载体质粒的大肠杆菌和含有PMD-T-aIb ADK质粒的大肠杆菌接种在加相应抗生素（Kan、Amp）的L B液体培养基中摇菌培养至合适浓度后采用质粒提取（小量）试剂盒（TIANGEN）抽提质粒。

具体方法与步骤见试剂盒说明。

2、抽提的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳检测、并拍照。

3、对提取的PHB载体质粒和PMD-T-aIb ADK质粒进行BamHⅠ、XbalⅠ双酶切鉴定。

酶切反应体系为：

去离子水23µL

10×K buffer 5µL

质粒(PHB/ PMD-T-aIb ADK) 20µL

BamHⅠ1µL

XbalⅠ1µL

总体积50 µL

短暂离心混匀后，于37 C水浴过夜反应。反应结束后加入5µL的10×Loading Buffer 停止反应，再进行琼脂糖凝胶电泳检测、照相。

2.2.3酶切片段的回收与表达载体的连接反应

1．目的片段的回收纯化

将质粒pMD-T+aIb ADK进行BamH I＋Xba I完全双酶切后，电泳表明均切下一条0.85 kb 左右的目的条带(aIb ADK，为855-bp)。回收aIb ADK，同时对pHB进行BamH I+Xba I完全双酶切，酶切产生两个分子量差异极大的片段，小片段是多克隆位点，大约几十bp，电泳根本无法看到；大片段就是pHB载体骨架(约12 kb)。回收该大片段。

对酶切后目的基因片段aIb ADK（小片段）和pHB载体骨架(大片段)进行切胶回收。采用胶回收（小量）试剂盒（TIANGEN）进行。操作步骤见试剂盒说明。

2. 回收目的基因aIb ADK小片段与pHB大片段载体骨架的连接

连接体系：

在200 µL Eppendorf管中加入下列组分：

pHB大片段 1.5µl