共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser sea nning con focal microscope)，英文简写LSCM，俗称con focal。
LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。
我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。
使用流程1、登陆或5号楼606室公用电脑下载?激光共聚焦预约使用审核表?，打印并填写。
2、联系卢剑清(手机：)审核并签名。
3、持已签名的?激光共聚焦预约使用审核表? 至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞(手机：。
4、在熟练使用者的指导下，进行实验。
5、实验结束，及时归还钥匙。
仪器构造和原理LSCM的根本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。
激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源，普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度、相干性好等优点,可以防止普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar)、氪(Kr)、氦(He)、氖(Ne)。
illu min ati ng pin hole (照明针孔)：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后，通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描，Focal plane (焦平面)：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
激光扫描共聚焦显微镜名词解释
激光扫描共聚焦显微镜名词解释激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）这名字听起来是不是有点高大上？别急，让我用大白话给你解释一下。
这玩意儿就像是个微观世界的超级侦探，它能在细胞、组织甚至整个生物体内部进行“侦查”，帮我们找出那些隐藏的秘密。
咱们先来说说它的工作原理。
LSCM的“大脑”是一个小型的激光器，它能够发出一束非常细的光束，就像一根针一样。
然后，这根针会“嗖”的一声，穿过样本的表面，直达深处。
在这个过程中，光束会被样本中的不同物质吸收，就像侦探在追踪线索一样。
这束被吸收的光会再次被反射回来，就像侦探找到了线索的所在位置。
现在，想象一下你正站在一个神秘的森林里，你需要找到隐藏在树丛中的宝藏。
LSCM就是那个拿着放大镜的侦探，它通过观察光的反射情况，就能知道宝藏在哪里。
而这个宝藏，可能是一个细胞内的分子，也可能是一片叶子上的花粉，甚至是一颗沙粒里的微生物。
那么，这个神奇的工具是怎么工作的呢？其实很简单。
LSCM会发射一束光线，然后它会收集从样本中反射回来的光线。
接着，这些光线会被送到一个特殊的镜头里，镜头就像一个小窗户，让光线能够进入并照射到样本上。
这些光线会被收集起来，并通过一个透镜系统送到探测器上进行分析。
在这个过程中，LSCM就像是一个神奇的“魔术师”，它能够捕捉到那些肉眼无法看见的细节。
比如，科学家们可以通过LSCM观察到细胞内部的结构，就像看一场精彩的魔术表演一样。
他们可以看到细胞核、线粒体、内质网等等，这些结构就像是微观世界的“舞台”，而LSCM就像是那个最懂观众的导演。
但是，LSCM并不是万能的。
它也有一些局限性。
比如说，它只能观察那些对激光有反应的物质，也就是说，它只能在那些“喜欢”光的地方工作。
而且，它也不能像人眼那样看到色彩和形状，它只能看到光的强度和方向。
总的来说，LSCM就像是微观世界的“超级英雄”，它能够帮助我们揭开生命奥秘的面纱。
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光共聚焦显微镜操作指南说明书
激光共聚焦显微镜操作指南说明书激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率、高对比度的显微镜，广泛应用于生物医学研究、材料科学等领域。
本操作指南将详细介绍激光共聚焦显微镜的操作流程和基本操作技巧，帮助用户正确、高效地使用该设备。
一、设备准备在开始使用激光共聚焦显微镜前，需要进行以下设备准备：1. 检查电源线和数据线是否连接正常，确保设备供电和数据传输正常；2. 检查激光源是否正常工作，激光功率是否稳定；3. 检查镜头和滤光片是否清洁，清除灰尘和污渍，确保成像质量；4. 准备适当的标本样品，并将其固定在载玻片上。
二、系统启动1. 确保设备处于待机状态，按下电源按钮，等待系统启动；2. 检查系统软件是否正常运行，若出现异常情况，及时联系维修人员进行处理；3. 检查镜头和滤光片的安装是否正确，确保成像时的光路通畅；4. 开启激光源，根据需要选择合适的激光波长和功率；5. 调节扫描镜和物镜的位置，使光线准确聚焦在样品上。
三、图像获取1. 打开激光共聚焦显微镜软件，并根据需要选择合适的成像模式；2. 调节激光功率和增益，确保图像的亮度和对比度适宜；3. 调节扫描镜的扫描速度，根据样品的要求选择合适的扫描速度；4. 调节焦距和聚焦位置，通过手动或自动对焦功能获取清晰的图像；5. 点击图像捕捉按钮，记录当前图像或录制图像序列。
四、图像处理和分析1. 通过激光共聚焦显微镜软件提供的图像处理功能，对图像进行调整和增强，以获得更好的观察效果；2. 根据需要，利用软件提供的计算和分析功能对图像进行进一步处理，如三维重建、光学切片等；3. 对图像进行定量分析时，选择合适的工具和算法，并按照要求设定参数；4. 记录和保存处理后的图像数据，以备后续分析和报告撰写使用。
五、设备关闭1. 停止图像采集和处理工作；2. 降低激光功率，关闭激光源；3. 将扫描镜和物镜返回初始位置，关闭设备；4. 断开电源和数据线，保持设备清洁干燥。
共聚焦细胞膜和细胞质荧光的区别
共聚焦细胞膜和细胞质荧光的区别
共聚焦显微镜是一种高分辨率显微技术，它能够对细胞内的不同区域进行同时成像。
在共聚焦显微镜中，细胞膜和细胞质的荧光成像是两种不同的成像方式。
细胞膜荧光成像通常使用绿色荧光蛋白（GFP）标记细胞膜上的蛋白质，然后通过激光扫描来观察细胞膜的形态和结构。
这种成像方式可以提供关于细胞膜厚度、流动性和组成成分的信息。
而细胞质荧光成像则使用红色或蓝色荧光蛋白标记细胞内的蛋白质，然后通过激光扫描来观察细胞质中的蛋白质分布和动态变化。
这种成像方式可以提供关于细胞内蛋白质相互作用、信号传导和代谢活动的信息。
共聚焦显微镜能够通过不同的荧光标记和激光扫描技术，实现对细胞膜和细胞质的精确成像。
这些成像结果有助于我们更好地理解细胞生物学的基本过程，并为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
激光共聚焦扫描显微镜检测ros的原理
激光共聚焦扫描显微镜检测ros的原理
激光共聚焦扫描显微镜检测ROS（活性氧簇）的原理如下：
1. 共聚焦显微镜采用单色激光扫描束形成点光源，对标本内焦平面上每一点进行扫描。
2. 标本上被照射点在检测器检测针孔处成像，由检测针孔后光电倍增管逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。
3. 照明针孔与检测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，即焦平面点同步聚焦于照明针孔和检测针孔，焦平面以外点不会在检测针孔处成像。
这样得到的共聚焦图像是标本的光学横切面，克服了普通荧光显微镜图像模糊的缺陷。
4. 通过显微镜载物台上加装的微量步进马达，可以使载物台沿着Z轴上下移动，将样品各个层面移到照明针孔和检测针孔的共焦面上，使样品不同层面的图像都能清晰地显示，成为持续光切图像。
通过以上步骤，可以有效地利用激光共聚焦扫描显微镜检测ROS，获得更准确的结果。
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用共聚焦原理观察样品的表面形貌和结构。
共聚焦显微镜具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
首先，共聚焦显微镜的工作原理是基于共焦原理。
共焦原理是指在焦平面上同时聚焦激光束和检测信号，通过这种方式可以获得高分辨率的图像。
共聚焦显微镜利用激光光源照射在样品表面，样品表面反射的光信号被激光束收集，然后经过光学系统聚焦到探测器上，最终形成样品的高分辨率图像。
其次，共聚焦显微镜的成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号。
然后通过信号处理系统对这些电信号进行处理，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜的成像原理保证了其在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率和高对比度的特点。
另外，共聚焦显微镜在成像过程中还可以实现三维表面重建。
通过对样品表面反射的光信号进行处理，可以获取样品表面的高度信息，从而实现对样品表面的三维重建。
这种特点使得共聚焦显微镜在观察微纳米结构和纳米材料时具有独特的优势。
总的来说，共聚焦显微镜是一种基于共焦原理的高分辨率显微镜，其工作原理是利用激光束和检测信号在焦平面上同时聚焦，成像原理是通过探测器接收样品表面反射的光信号，并将这些信号转换成电信号，最终形成样品的图像。
共聚焦显微镜在观察样品表面形貌和结构时具有高分辨率、高对比度和三维表面重建的优点，因此在材料科学、生物医学和纳米技术等领域得到了广泛的应用。
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共聚焦显微镜
从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体
恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓
的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜[Confocal Laser Scanning
Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜
(dichroic mirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其
焦点上有一个带有针孔(Pinhole)，小孔就位于焦点处，挡板后面是
一个 光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)。可以想像，探测光
焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被
挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：
通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。
激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划
时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装
置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%-
-40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微
细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位
等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科
学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦
成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞
等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内
物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究
（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光
的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的
时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振
能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基
因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），
胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像
分析和三维重建等分析。
一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：
涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织
胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科
学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。
二.基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受
到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束
经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照
射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷
电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成
荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面
上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测
针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普
通显微镜图像模糊的缺点。
三.应用范围：
细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线
粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结
构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定
位研究及三维重建分析。
1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受
体、细胞器结构和分布变化
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学
4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态
5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、
递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布
6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构
7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾
病诊断、HIV等
8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结
构、染色体分析、基因表达、基因诊断
四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用
A.在细胞及分子生物学中的应用
1. 细胞、组织的三维观察和定量测量
2. 活细胞生理信号的动态监测
3. 粘附细胞的分选
4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能
5. 光漂白后的荧光恢复
6. 在细胞凋亡研究中的应用
B.在神经科学中的应用
1. 定量荧光测定
2. 细胞内离子的测定
3. 神经细胞的形态观察
C.在耳鼻喉科学中的应用
1. 在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用
2. 激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中
的应用
3. 激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用
4. 激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用
D.在肿瘤研究中的应用
1. 定量免疫荧光测定
2. 细胞内离子分析
3. 图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析
4. 三维重建
E.激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用
1. 细胞内钙离子的测定
2. 免疫荧光定位及免疫细胞化学研究
3. 细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜
F.在血液病研究中的应用
1. 在血细胞形态及功能研究方面的应用
2. 在细胞凋亡研究中的应用
G.在眼科研究中的应用
1. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构
2. 集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行
及成纤维细胞的出现
3. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布
以及神经原的树枝状形态
4. 三维重建
H. 激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用
可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立体
影像水平，使图像更加清晰，从计算机分析系统可从外观到内在结
构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能几个方面对系膜细
胞的认识得到提高。