激光共聚焦显微镜技术1讲解
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
简述激光共聚焦显微镜的工作原理激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜，它具有优异的成像能力和深度探测能力。
它的工作原理基于激光光源和共聚焦技术，可以对样品进行非破坏性的三维成像和表面拓扑分析。
本文将简要介绍激光共聚焦显微镜的工作原理。
1. 激光光源激光共聚焦显微镜使用一束强度稳定、单色、相干性好的激光光源。
常用的激光光源包括氩离子激光器、氦氖激光器和二极管激光器等。
激光光源通过准直器和聚焦镜系统聚焦成一束准直的、直径极小的激光光斑。
2. 共聚焦技术激光共聚焦显微镜采用共聚焦技术，即通过聚焦光斑和探测光斑的重叠来实现高分辨率成像。
聚焦光斑从样品的一个点与探测光斑重叠之后，仅有从这个点散射回来的光能够通过探测光斑，其他来自样品其他区域的光则被阻隔掉。
这样可以消除样品其他区域的散射光对图像质量的影响。
3. 共焦平面激光共聚焦显微镜通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度的共焦平面。
共焦平面是指光路中聚焦光斑和探测光斑达到最小的位置。
在共焦平面之上和之下，成像出的图像将会出现模糊和散焦现象。
调节聚焦镜的位置，可以实现在样品不同深度层面进行三维成像。
4. 探测和成像聚焦光斑扫描样品上的一个区域，样品上的荧光探针或反射光信号通过物镜收集到探测器上。
激光共聚焦显微镜常用荧光探针来标记样品的特定结构或分子，使其发出荧光信号，进而获得一幅高对比度的荧光图像。
探测器接收到的信号经过放大、滤波和转换等处理后，最终形成图像。
5. 高分辨率成像激光共聚焦显微镜具有高分辨率的成像能力。
其分辨率可以达到光学显微镜的两倍，约为200纳米级别。
激光光源的单色性和相干性，以及共聚焦技术的应用，使得激光共聚焦显微镜能够获得更清晰、更准确的显微图像。
总结起来，激光共聚焦显微镜利用激光光源以及共聚焦技术，能够实现高分辨率的三维显微成像。
通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度层面的图像，更好地观察样品的内部结构。
激光共聚焦显微镜要点解析(一)
激光共聚焦显微镜要点解析（一）激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察例如Ca2+，pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
一、基本原理和功能1.1 基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
1.2 激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能1）“细胞CT”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平,使图像更加清晰,从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
2）三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能激光共聚焦显微成像仪可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来,不但能揭示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数,而且可以给人以三维立体的概念。
例如:可以使细胞旋转起来从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。
3）将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化,而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。
如细胞内游离Ca2+、pH值及其它细胞内离子的实时测定。
荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。
同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。
可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
激光共聚焦扫描显微镜使用原理讲解
1．激光共聚焦扫描显微镜的基本原理？与普通显微镜的区别？1.原理：激光共聚焦扫描显微镜利用激光束经光源前方的照明针孔（激发针孔）形成点光源，在物镜焦平面上形成一个轮廓分明的小点，激发出的荧光经原来的入射光路直接反向回到分光镜，并将荧光直接送到探测器前方的探测针孔（共聚焦针孔），通过探测针孔时先聚焦，由探测针孔后的光电倍增管逐点接收，在计算机屏幕上形成清晰的荧光图像。
照明针孔和探测针孔相对于物镜焦平面是共轭（共焦）的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时焦聚于照明针孔和探测针孔。
这样，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡。
2.区别：共聚焦显微镜与普通显微镜相比有许多独特的优点，包括：可以控制焦深、照明强度、降低非焦平面光线的噪音干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，即显微CT。
最核心的优点是降低噪音干扰：对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好地会聚，可以全部通过针孔探测器接收，而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。
而随着距离物镜焦平面的的距离越大，杂散光在探测针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少，探测器上产生的信号就越小，这样就能有效防止杂质信号。
2．钙指示剂的类别和优缺点：1. 生物发光蛋白优点：不需要荧光激发系统，光毒性小。
缺点：不能通透细胞膜，对技术要求高，效率较低，需要较多的指示剂。
2. 荧光蛋白指示剂优点:比值测定，荧光信号强。
缺点：染料的信号可变度小，对PH值变化敏感。
3. Fura2（比值型）优点：避免实验设备、细胞类型、实验个体的差异，数据具有高度可比性。
缺点：紫外激发，一定的自发荧光，损害细胞的能量代谢。
4. Fluo3（非比值型）优点：激发，自发荧光小，对细胞的损害较小。
缺点：数据直接为荧光强度值，容易受染料浓度、细胞动态变化等因素的影响。
激光共聚焦荧光显微镜原理(一)
激光共聚焦荧光显微镜原理(一)激光共聚焦荧光显微镜介绍•激光共聚焦荧光显微镜是一种高分辨率、高灵敏度、非接触式的三维显微成像技术。
•它通过聚焦激光束扫描样品，利用荧光标记来获得样品内部的高分辨率三维图像。
原理解释•激光共聚焦荧光显微镜的主要组成部分包括激光源、物镜、探测器和扫描镜等。
•激光源向物镜聚焦光束，然后通过扫描镜快速扫描，即可在样品中聚焦出一个非常小的点，称为焦斑。
•接着，利用荧光标记，样品发出荧光信号，荧光信号被探测器接收，并转换为电信号。
•然后，将探测到的信号与扫描镜的位置信息对应起来，就可以获得高分辨率而具有三维信息的样品图像。
应用领域•激光共聚焦荧光显微镜广泛应用于生物学、材料学、纳米技术等领域。
•生物学领域中，可用于观察细胞、组织等生物标本的三维结构。
•材料学领域中，可用于研究材料的三维结构和成分。
•纳米技术领域中，可用于研究纳米材料的结构和制备过程。
总结•激光共聚焦荧光显微镜是一种非常重要的高分辨率三维成像技术，可用于生物学、材料学、纳米技术等领域的研究。
•它利用聚焦激光光束和荧光标记，通过快速扫描样品，获得高分辨率的三维结构信息。
•随着技术的不断发展，相信激光共聚焦荧光显微镜在更多领域的研究中将大有作为。
激光共聚焦荧光显微镜的优点•高分辨率：激光共聚焦荧光显微镜的空间分辨率可达到几十纳米级别，比传统显微镜高出数倍。
•高灵敏度：通过荧光标记，激光共聚焦荧光显微镜可实现单个分子级别的检测。
•非接触式：激光光束非常细，采用非接触式聚焦，对样品不会造成破坏。
•可观察内部结构：激光共聚焦荧光显微镜可观察到样品的内部三维结构，而传统显微镜只能看到表面结构。
激光共聚焦荧光显微镜的发展历程•激光共聚焦荧光显微镜是由德国物理学家斯特凡·海克尔（Stefan Hell）于1994年发明的。
•他通过解决光学限制的方法，将光束在空间局部化，从而实现超分辨率成像。
•2006年，海克尔因发明激光共聚焦荧光显微镜被授予诺贝尔化学奖。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
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激光共聚焦显微镜技术The techniques and applications of Confocal Laser Scanning Microscopy激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1978年，阿姆斯特丹大学的G.J.Brakenhoff首次展示了改善了分辨率的共焦显微镜。
1985年，Wijnaendtsvan Resandt推出了第一台对荧光标记的材料进行光切的共焦显微镜激光共聚焦显微镜(LSCM)的发展简史☐80年代末，各家公司都推出了商品化的共焦显微镜,英国的Bio-Rad公司的MRC系列，德国Leica公司的TCS系列，Zeiss公司的LSM系列等。
☐近二十年来，从滤片型到光谱型，人们对共焦高分辨率，采集图像快速，技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多新的技术。
如双光子，FCS,FLIM ,STED等。
共焦显微镜的优点人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25μm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：μm共焦显微镜的优点☐电子显微镜的缺陷：1.只能观察固定样品2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象☐荧光显微镜的缺陷:1.可以观察活细胞或组织，但细胞或组织内结构高度重叠。
2.荧光具有强散射性，造成图像实际清晰度的大大下降。
3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。
4.如果荧光滤片选配不当，多荧光标记样品图像的采集很困难，且很难抑制光谱交叉。
共焦显微镜的优点☐共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术☐共焦显微镜与传统显微镜的区别2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3. 增加侧向分辨率激光扫描共焦显微镜技术Fluorescent Microscope vs confocal激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术扫描方式激光扫描共焦显微镜技术原理小结:Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。
照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。
计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的2al convention confocal d d扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。
激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明。
2.具有照明pinhole和探测pinhole。
3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。
4.具有扫描系统——逐点扫描成像。
5.具有多个（五个）荧光通道，可同时探测多个被标记物。
6.使用AOTF(Acousto-Optical Tunable Filter )进行激光波长和强度的选择，并以极超快速控制激光开和关，从而实现任意形状感兴趣区域扫描的功能,实现了实时快速检测。
7. AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter)：更好的减少了激发光对发射荧光的干扰。
8.光谱检测器：任意选择接受光谱的波长和带宽。
AOBS(Acousto-Optical Beam Splitter)AOBS的作用☐特定波长的激发光经过AOBS后发生偏转进入光路☐样品产生的荧光直接通过AOBS到达检测器，而反射回来的激发光经过AOBS后发生偏转不能到达检测器。
☐优点：与传统的二色光分光镜相比，增大了荧光的接受率。
☐更好的阻止了激发光对发射荧光的干扰。
光谱检测器棱镜分光，光谱检测激光扫描共焦显微镜技术☐分辨率1. 光学分辨率只与物镜的数值孔径NA和检测波长有关xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜: Rxy=0.61λ/NA （0.25 μm )Confocal: Rxy=0.4λ/NA（0.18 μm )2. 采样分辨率固定物镜倍率下，Zoom相同时，无论采样密度大小，采样面积是固定的。
理论上，固定面积下，采样密度越高，即采样点越多，图像越细腻。
但是，采样密度越高，扫描一幅图像的速度越慢，荧光强度越低，样品也越容易被淬灭。
激光扫描共焦显微镜技术☐图像亮度1.与物镜NA有关。
物镜镜像亮度与数值孔径的平方呈正比，与总放大率的平方呈反比。
L = NA 2/ M 2 , NA 大小相同，倍率越高，镜像亮度越低2. 与pinhole 大小有关。
M 2 = ( M 1 × M 2) 2Pinhole 大小的选择理论上，最佳Pinhole ＝Airy Disk ＝1实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Pinhole 的大小3. 与激发光强度有关。
4. 与接受发射荧光波长的带宽有关激光扫描共焦显微镜技术☐光切厚度和光切步距光学切片厚度取决于: 物镜的NA 、针孔大小、发射波长等光学切片厚度＝光切步距(Step Size)☐dz=Z 轴的最小移动步距: 40nm ，15 nm ，3 nm理论Z 轴分辨率：dz=0.35μm激光扫描共焦显微镜技术☐样品的最大厚度:大约1- 2mm(10X/0.4物镜)取决于: 物镜的NA 、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z 轴的最大移动范围(SP2 166μm 、Z-wide,8mm)(sp5 500/1500 μm, -11mm/2mm,15nm stepsize ）在观察较厚的样品，如脑片时，应该选用怎样的物镜？激光扫描共焦显微镜技术☐技术指标（Leica TCS ) :1. xy 分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜: Rxy=0.61λ/NA （0.25 μm )Confocal: Rxy=0.4λ/NA （0.18 μm )2. 样品的最大厚度:大约1- 2mm(10X/0.4物镜)取决于: 物镜的NA 、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z 轴的最大移动范围(166μm 、Z-wide 8mm sp2)(500um/1500um/3nm , Z-wide 13mm Sp5) ( 0.88λem)2 ( n ⨯√2 Ph )2 NA n -(n 2-NA 2)1/2 +3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm,SP2）取决于: 物镜的NA、针孔大小、发射波长等Z轴的最小移动步距: 40nmZ轴的分辨率: 0.35 μm激光扫描共焦显微镜技术☐Pinhole（探测针孔）大小影响:1) 图像的亮度2) 光学切片的厚度☐Pinhole大小的选择理论上，最佳Pinhole＝Airy Disk＝1实际上，应根据样品标记的实际情况来选择Ph的大小。
激光扫描共焦显微镜技术4. 激光器Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nmGreNe : 543nm; HeNe: 633nmAr激光器(UV): 351nm, 361nm固体激光器：561nm,405nm☐激光器的特点:1) 方向性好: 激光基本延直线传播2) 单色性好:∆λ=10-8nm3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度集中的。
4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合。
5)光谱的不连续性。
激光扫描共焦显微镜技术5. 五个荧光通道, 一个透射光通道即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像，但透射光图像为非共焦图像。
注：对未标记的标本，可采集反射光图像。
激光扫描共焦显微镜技术☐扫描速度:CONVENTIONAL 2800 lines/s 512⨯512 5/S Resonant 16000 lines/s 512⨯512 25/S ☐扫描密度:64⨯64128⨯128512⨯512，512⨯64，512⨯321024⨯10242048⨯2048 SP5 8192 ⨯8192 4096 ⨯4096☐扫描方式：xyz, xyt, xzt, xt，xyzt, xyλ, xλ,xzλ, xzy, xyzλ,激光扫描共焦显微镜技术☐共焦显微镜的类型：1.点(慢)扫描共焦显微镜:分辨率高, 图像清晰; 噪音低; 采集图像速度慢;目镜中观察不到共焦图像2.线(狭缝)扫描共焦显微镜(video rate)分辨率低; 噪音高; 扫描速度快240幅/秒; 目镜中可观察到共焦图像3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜性能介于上述两者之间Spinning disk confocalSpinning disk confocalSpinning disk confocal☐•每个视场约1000个激光点，总计约20000个针孔☐•针孔尺寸固定在50μm，适合100x/1.4 油镜☐•针孔间的空隙可避免信号相互干扰☐•约有70%的激发光到达样品☐• 盘转速1500到10000转/秒，成像速度300到2000帧/ 秒☐• 激发光谱400-650nm 检测光谱420-750nmSpinning disk confocal☐采用双转盘,微透镜☐EM CCD 作为探测器☐采样速度快，300－2000/s☐适合于记录活细胞样品的快速变化☐没有电子放大，不适合观察细胞内的微细结构。
☐发射波长使用滤片选择。
激光扫描共焦显微镜技术的应用☐The application of Confocal Laser Scanning Microscopy激光扫描共焦显微镜技术的应用☐Confocal基本应用☐FRET、FRAP 和FLIP应用☐与Confocal相关技术的进展激光扫描共焦显微镜技术的应用功能.1.多重荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.时间序列扫描: xyt 、xyzt 和xt 扫描8.图像处理9. 旋转扫描10.感兴趣区域扫描11.光谱扫描－光谱拆分☐荧光强度的测量荧光强度＝荧光效率×激发光强度☐测量原理(Boehm 1861)☐I=I0Q(1-10-kcd )＝I0Q(1-1/10kcd )☐I0: 激发光强度；I: 发射光强度☐Q: 荧光量子产率，对于特定荧光物质，该值为常数。