激光扫描共聚焦显微镜技术-0429剖析
激光扫描共聚焦
激光扫描共聚焦显微镜在医学研究中的应用随着科学技术的发展，实验技术已经成为实现实验目的的重要手段，对实验技术的了解和掌握是科技工作者应具备的技能。
激光扫描共聚焦显微镜简称共聚焦显微镜，20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，同时也是目前生物医学领域中最先进的荧光成像和细胞分析工具之一，它由激光，电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段与传统的光学显微镜结合而产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，并在生物及医学等领域的应用越来越广泛，现在已经成为生物医学实验研究的必备工具。
1.激光扫描共聚焦显微镜的结构和原理激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope）是在荧光成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像集中处理，由于该仪器使用紫外光或者可见光激发荧光探针，从而可以清晰观察细胞或者组织内部微细结构，并可反映出亚细胞水平上生理信号的变化在结构配置上，激光扫描共聚焦显微镜出包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源，扫描装置，检测器，计算机系统（包括数据采集，处理，转换及应用软件），图像输出设备，光学装置和共聚焦系统等部分。
由于该仪器具有高分辨率，高灵敏度，光学切片，三维重建，动态分析等优点，因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。
2.日常管理共聚焦显微镜是一种集激光技术、显微镜技术、光度技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等多种高技术于一身的大型仪器。
其价格昂贵，在使用过程中要特别注意做好保养和管理工作。
通常要做到以下几点：（1）严格按照操作规则使用，避免因使用不当造成损坏。
（2）为保持良好工作状态，延长使用寿命，工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。
每次使用后，要做好清洁工作，及时清洁目镜、物镜等容易污染的光学部件。
（3）系统应设立专门房间，安装在防震台上，工作间内要安装空调，抽湿及防尘装置。
无论仪器是否工作，最好使其环境始终保持在22 ℃± 1 ℃的恒温。
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。
它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。
它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。
激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。
通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。
1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。
由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。
2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。
这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。
3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。
这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。
4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。
这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。
在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。
它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。
在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。
它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。
在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。
它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。
总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。
它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光共聚焦扫描显微镜原理功能
激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜，通过激光光源和共聚焦扫描技术可以实现对样品的三维成像。
该显微镜原理独特，功能丰富，下面将详细介绍。
首先，让我们了解一下激光共聚焦扫描显微镜的工作原理。
激光共聚焦扫描显微镜的激光光源可以产生高能量、单色和高单频的激光束，然后通过一系列光学元件将激光聚焦到一个微细尖端，形成一个极小的焦点。
这个焦点可以对样品进行扫描，通过激光与样品之间的相互作用，得到一系列的反射或荧光信号。
这些信号经过光学系统的分光探测器进行收集与分析，可以获得高分辨率的图像。
1.高分辨率成像：激光共聚焦扫描显微镜的光学系统可以聚焦到亚米级尺寸的焦点，并收集样品表面或内部的成像信号。
相比传统的荧光显微镜具有更高的分辨率。
2.三维成像：激光共聚焦扫描显微镜可以通过扫描激光焦点在样品内部的位置，获取样品的三维信息。
可以使用自动扫描系统，将激光在X、Y、Z三个方向的位置进行扫描，实现高质量的三维成像。
3.荧光探测：激光共聚焦扫描显微镜常用于生物医学等领域的研究，可以通过荧光标记的样品来观察样品的分子组成和生物过程。
荧光探测技术可以提供对细胞和组织结构的高分辨率成像。
4.实时观察：由于激光共聚焦扫描显微镜可以实现高速扫描和数据采集，可以实时观察样品的动态变化。
这使得该技术在生物学和材料科学研究中非常有用。
5.光谱分析：激光共聚焦扫描显微镜可以使用多种光谱探测器来进行荧光信号的分析。
可以通过收集不同波长的荧光信号，获得样品中的各种分子或物质的信息。
6.激光刺激：激光共聚焦扫描显微镜也可以进行激光刺激实验。
通过选择合适的激光波长和功率，可以在细胞或样品的特定区域进行局部刺激。
这对于研究细胞生理和功能是非常重要的。
总之，激光共聚焦扫描显微镜具有高分辨率成像、三维成像、荧光探测、实时观察、光谱分析和激光刺激等功能。
激光共聚焦显微镜分析技术
狭分缝光谱扫描
光谱扫描带宽 精度 2 纳米
滤光片系统 OTE
灵敏度较光谱式差
光学能量转移效率
94%
98% 88.5% 86.7% 90.3% 88.5% 100%
光谱式探头
棱镜分光,狭缝扫描,全无滤片
• 第一优势:提高灵敏度 • 光谱式与滤光片比较： 88% 对 61% • 为了达到相同样品质量 (相同探测发射 能量), 较低OTE 的仪器需要较高激光能 量作为激发以致更大机会做成样品漂白 ，干 扰 PSF, 因此降低图象质量
• Seamless recording of full spectrum
• Up to 4 PMT´s with individual gain adjustments to compensate for emission properties of stains
(PMT=Photomultiplier tube)
激光光源扫描器内装有针孔光栏分光镜发射荧光单色器及检测器荧光显微镜装有微米步进马达系统光学装置计算机图像存储与处理及控制系统
激光共聚焦显微镜技术 第2章
激光扫描共聚焦显微镜的基本结构、 工作原理及基本功能
一 、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构和工作 原理 激光扫描共聚焦显微镜是一种用于图像采集 和分析的大型精密仪器。其主要由以下几部分组 成:激光光源、扫描器（内装有针孔光栏、分光 镜、发射荧光单色器及检测器)荧光显微镜（装 有微米步进马达）系统、光学装置、计算机图像 存储与处理及控制系统。
Emission Filter Emission Pinhole
Principle of a standard Confocal
Detector
Barrier Filter Fixed characteristics Pinholes
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
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Basics of conventional fluorescence microscope
1 水银弧光灯 2 中密度滤片 3 光镧 4 场镧 5 激发滤片 6 分光镜（BSP) 7 物镜 8 样品 9,10 发射滤片 11 目镜
Fluorescent Microscope
Arc Lamp
Excitation Diaphragm-光圈 Excitation Filter
2）、球差： 是由于透镜不能把近轴光线和远轴光
线在光轴上共聚焦，以至透过标本一点 的光线，在通过透镜时不能聚焦成一点 ,而是形成一个光斑,从而使成像模糊不 清。
3）、色差： 是由于显微镜透镜类似于三棱镜,对不同颜
色的光线具有不同的折射率。所以光线透过透 镜后,不同色的光聚焦在不同点上,从而使成像 模糊,而且像的边缘尚带有色晕。
3、显微镜成像清晰度的决定因素: 1）.分辨率 2）.球差 3）.色差
1）、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个质 点分辨清楚的能力,通眼及各类显微镜的分辨率
人眼分辨率： 光学显微镜分辨率： 共焦显微镜分辨率： 电子显微镜分辨率：
0.20 mm 0.25 mm 0.18 mm 0.20 nm
2、共焦显微镜发展历史
• 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微 镜技术的某些基本原理，获得了美国的专 利
• 1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦 显微镜产生了一个光学横断面
• 1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光 与被照明物体的原子之间的非线性关系和 激光扫描器的拉曼光谱学
• 激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜 大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特 点：需与扫描器连接，使激光能进入显微 镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到 达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与 激光转换，同时汞灯光线强度可调
（3）常用激光器
• 激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有 单激光和多激光系统，常用的激光器包括 以下三种类型 :
1
2
2
观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平 面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图 像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生 物学标本是层次区别的重叠结构）。
共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域 被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区 域被照明。
（2）荧光显微镜系统
• 显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统 的成像质量。显微镜光路以无限远光学系 统可方便地在其中插人光学选件而不影响 成像质量和测量精度。物镜应选取大数值 孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采 集和成像的清晰。物镜组的转换，滤色片 组的选取，载物台的移动调节，焦平面的 记忆锁定都应由计算机自动控制
• 半导体激光器：405nm（近紫外谱线 • 氩离子激光器：457nm、477nm、488nm
、514nm（蓝绿光 ) • 氦氖激光器：543nm（绿光-氦氖绿激光器
）633nm （红光—氦氖红激光器 )
• UV激光器（紫外激光器）：351 nm、364 nm（紫外光 )
4）辅助设备
•风冷、水冷冷却系统及稳压电源
Ocular-目镜
Objective
Emission Filter
Confocal Principle
Objective
Laser Excitation Pinhole
Excitation Filter PMT
Emission Filter Emission Pinhole
Differences between conventional and confocal microscope 1
从某种意义上讲，共聚焦显微
镜是一种现代化的光学显微镜，它 对传统的光镜从以下几方面作了改 进
• 1984年，Biorad为公司推出了世界第一台 商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100 ，扫描方式为台阶式扫描
• 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作 生物荧光显微镜的共聚焦系统
• 1987年White和Amos在英国《自然》杂志 发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文 ，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要 工具
4、激光扫描共聚焦显微镜基本结构
• 激光扫描共聚焦显微镜系统主要包括扫描 模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号 处理器、计算机以及图像输出设备等
激光共聚焦显微镜构成
显微镜 步进器
激光器 光电倍增管 检测器
计算机 电子图像 软件
（1）扫描模块
• 扫描模块主要由针孔光栏（控制光学切片 的厚度）、分光镜（按波长改变光线传播 方向）、发射荧光分色器（选择一定波长 范围的光进行检测）、检测器（光电倍增 管）组成。荧光样品中的混合荧光进入扫 描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色 器选择后，被分成各单色荧光，分别在不 同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦 图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个 并列的单色荧光图象及其合成图象
Laser Scanning Confocal Microscope
1、普通荧光显微镜的不足
使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅 图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使 用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微 镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下 方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧 光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以 外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是 层次区别的重叠结构）。
基本工作原理
• 激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是 首先由激光器发射的一定波长的激发光， 光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光 栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平 面上，样品上相应的被照射点受激发而发 射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检 测器，并成像于计算机监视屏上。这样由 焦平面上样品的的每一点的荧光图像组成 了一幅完整的共焦图像，称为光切片