荧光蛋白研究进展
肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究
第45卷 增刊2006年5月 厦门大学学报(自然科学版)Journal of Xia men University (Natural Science )Vol .45 Sup.M ay 2006 收稿日期:2005212227 基金项目:福建省发展和改革委员会重大产业技术开发专项(20042427)资助 作者简介:朱红梅(1981-),女,硕士研究生. 3通讯作者:fzliubo@ ;htzhou@jingxian .x mu .edu .cn肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究朱红梅1,周涵韬1,23,张赛群1,2,曹 宜2,刘 波23(1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.福建省农业科学院生物技术中心,福建福州350003)摘要:通过电击转化法,将带有gfp 标记基因的pG LO 质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 88、K 99中,经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光,表明gfp 基因得到稳定、高效的表达.进一步通过PCR 分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明,转化菌株与原始菌株是一致的.该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段.关键词:肠毒性大肠杆菌;绿色荧光蛋白;遗传转化中图分类号:Q 943.2 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)S 20043204 肠毒素性大肠杆菌(Enter ot oxigenic Escherichia co 2li .,ETEC )是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌,初生幼畜被ETEC 感染后,常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,发病率和死亡率均很高,是目前的研究热点之一[1].猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有K 88,K 99,987P .来自多管水母(A equoreavitoria )的绿色荧光蛋白(green fluorescence p r otein,GFP )基因是目前应用广泛的一种报告基因[2].在各种不同的系统中表达后,重组GFP 均可吸收蓝光,发出明亮的绿色荧光.与其它生物标记基因比较,它的最大优点是不需要任何底物或额外的辅助因子,利用其发出的荧光就可以实现对生物的活体监测[3],为重组子的筛选及诸多生物学、免疫学试验提供了一个直观手段.本研究利用gfp 基因标记ETEC,希望获得gfp 基因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株,为进一步研究ETEC 侵染途径及治病机理奠定基础,同时也方便益生素的筛选及效果评价.1 材料与方法1.1 材 料肠毒性大肠杆菌菌株C83905(K 88ac ),C83529(K 99)由福建省农科院畜牧兽医研究所提供.质粒pG 2LO 购自B i o 2Rad 公司,有Amp (氨卞青霉素)抗性和阿拉伯糖调控蛋白和gfp 基因.蛋白胨为上海生工BB I 公司产品,酵母抽提物为OXO I D 公司.d NTPs 、TaqDNA 聚合酶、购自上海生工;100bp DNA Ladder 购自B i olabs .BECK MAN 冷冻离心机,B i o 2Rad Gene Pulser Ⅱ电穿孔仪,B i o 2Rad 电泳仪,OLY MP US 荧光显微镜.1.2 实验方法(1)质粒提取方法挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH 5α的单菌落,于10mL 含100μg ・mL -1Amp 的LB 液体培养基中,37℃振荡培养过夜.碱裂解法提取质粒[4].提取的质粒用0.8%琼脂糖电泳检测纯度.(2)感受态细胞的制备在NA 液体中摇床震荡培养ETEC 至OD 600为0.6,取菌液冰浴10m in,8000r/m in 4℃离心收集菌体.冰预冷的无菌水洗菌体4次,最后将菌体重悬于10%甘油中,-70℃冰箱保存备用.(3)电击转化2mm 电转化杯冰上预冷后,分别加入100μL 感受态细胞和50ng 质粒,冰浴10m in 后进行电击转化,电击条件为2.5kV ,200Ω,25μF .电击结束立即加入900μL 的NA 培养基,混匀并转入1.5mL 的Eppen 2dorf 管中,于37℃、120r/m in 的摇床上振荡培养2h,取100μL 菌液涂布在NA +100μg ・mL -1Amp +6mg・mL -1阿拉伯糖(ara )筛选培养基上,并置于37℃培养箱培养16h .(4)转化子的荧光检测将筛选培养基上长出的菌落,紫外灯照射检测绿色荧光.用接种环挑取稀释后的菌液置于载波片上,常规压片,荧光显微镜观察.(5)标记菌株的PCR 鉴定细菌基因组DNA 的提取方法参照少量制备・44 ・ 厦门大学学报(自然科学版) 2006年DNA [5]的操作步骤,0.8%琼脂糖电泳鉴定基因组DNA.参考李鹏[6]的研究,根据发表的K 88及K 99菌毛结构基因序列,分别合成2对特异性引物.K 88上游引物序列:5′2CAT CTGCTGCAT CTGGT AT 2GG 23′K 88下游引物序列:5′2AATTGCT ACGTT CAGCG 2G AGC 23′K 99上游引物序列:5′2AAAAACACTGCT AGC 23′K 99下游引物序列:5′2AGT AGT AAAT ACGCC 23′50μL PCR 反应体系中包含10×PCR buffer;200μmol/L d NTP;50p mol 引物P1和P2;5U 的Taq DNA 聚合酶,Mg 2+浓度为2mmol/L.K 88PCR 循环参数为:96℃预变性4m in;然后进入94℃60s,57℃60s,72℃60s,共30个循环;最后72℃延伸8m in .K 99PCR 循环参数与K 88相比,除了复性的温度由57℃改为55℃外,其余均相同.1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物.(6)标记菌株的血清型鉴定将转化3代的菌落和原始菌株与标准K 88、K 99因子血清做玻片凝集试验,鉴定其血清型.(7)转化前菌株和未转化菌株的生长曲线测定取过夜培养物,按1%接菌量置于新鲜的LB 液体培养基,于37℃,150r/m in 振荡培养.每隔1h 取样,用紫外分光光度计测OD 600吸收值,重复2次.以时间为横坐标,OD 600值为纵坐标做图,绘制生长曲线.2 结果与分析2.1 转化菌株荧光检测电击转化后筛选培养基上长出的菌落,肉眼直接观察呈绿色,用紫外光照射则发出强烈绿色荧光(图1).用荧光显微镜观察,可看到清晰的绿色发光的杆状细菌.标记菌落分别命名为K 882pG LO 、K 992pG LO (图2).2.2 转化菌株分子鉴定提取转化菌株及原始菌株基因组DNA,进行菌毛结构基因的PCR 扩增.K 88、K 882pG LO 基因组DNA 上都扩增得到大小约为800bp 的预期片段(图3);K 99、K 992pG LO 基因组DNA 上都扩增到大小约为500bp 的预期片段(图4).PCR 鉴定结果表明转化后的宿主菌与原始菌具有基因背景上的一致性.2.3 转化子的血清型鉴定血清学鉴定结果(见表1)表明,所转化菌株K 882pG LO 、K 992pG LO 与未转化的宿主菌K 88、K 99血清型一致.2.4 未转化菌株和转化菌株的生长曲线比较 转化菌株与原始菌株的对照生长曲线如图5、6所示.未转化菌株和转化菌株的生长状况一致.显著性分析表明转化菌株与原始菌株的差异不显著(p >0.05).3 讨 论近年来,国内外对ETEC 的分子结构、致病机理及免疫防治研究进展迅速,取得了一些结果.一般认为表1 菌株血清鉴定结果Tab .1 The ser ol ogical identificati on results of strainsK 88K 882pG LO K 99K 992pG LO O 抗原O 138O 138O 101O 101K 抗原K 88K 88K 99K 99增刊 朱红梅等:肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 ・45 ・图3 K 88、K 882pG LO PCR 产物电泳分析图谱Fig .3 Electr ophoresis analysis f or the PCR a mp lificati onp r oducts of K 88and K 882pG LO M.Marker (100bp ladder );1.the a mp lificati on strand of K 88;2.the a mp lificati on strand of K 882pG LO 图4 K 99、K 992pG LO PCR 产物电泳分析图谱Fig .4 Electr ophoresis analysisfor the PCR a mp lificati onp r oducts of K 99and K 992pG LO ,M.Marker (100bp ladder );1.the a mp lificati on strand of K 99;2.the a mp lificati on strand of K 992pGLO 图5 K 88、K 882pG LO 生长曲线图 Fig .5 The gr owth graph of K 88and K 882pG LO 图6 K 99、K 99pG LO 生长曲线图 Fig .6 The gr owth graph of K 99and K 992pG LO ETEC 属非侵袭性细菌[7],细菌进肠道后,借助位于细菌表面的菌毛上的定居因子(CF Aa )粘附在宿主小肠上皮细胞表面,细菌繁殖并分泌毒素(耐热肠毒素LT(heat stable enter ot oxin )和/或不耐热肠毒素ST (heat labile enter ot oxin ),毒素进入细胞导致水钠代谢混乱,造成分泌性腹泻;但也有研究表明,ETEC 的致病机理可能更复杂,仍有许多不明之处[8],例如该菌是否具有侵袭性,毒素能否进入或影响肠道其它部位组织或细胞,对LT 与ST 的作用部位问题一直未解决[9].陈清等[10]通过切片观察到主要在空肠和回肠组织病变,有明显的炎症反应.用免疫组织化学技术对毒素的定位进行了观察,表明LT 和ST 除分布于粘膜上皮细胞表层外,也分布于肌层细胞,甚至浆膜层,分布弥漫.提出一个假设,LT 和ST 能够通过细胞间隙进入上皮下的粘肌层及肌层,作用于肌细胞.LT 或ST 甚至可进入血流,导致毒血症发生.GFP 检测时具有不需要外源底物或辅助因子而发光的特性,为验证上诉假设提供了一种可能性.有研究发现,用gfp 基因编码绿色荧光蛋白GFP,可以监测基因表达和在活细胞里定位蛋白质,实现在消化道内实时监测GFP 菌株的代谢情况[11,12].Valdivia 等[13]利用GFP 研究了鼠伤寒沙门氏菌(Sal m onella typhi m uri 2um ,St ),结果证明GFP 的表达并不影响菌的侵入宿主过程或在宿主中的繁殖;用落射荧光显微镜可在活的哺乳动物细胞中看到表达的GFP 荧光,从而精确观察到活菌与活宿主细胞之间的相互作用.将带有gfp 标记基因的肠毒性大肠杆菌建立动物感染模型,在体外筛选特定的发光菌株,从而可以分析定植情况,进而为研究其致病机制提供一种手段.目前肠毒性大肠杆菌的gfp 转化及其应用,尚未见报道.同时这种带有荧光标记的肠毒性大肠杆菌在疾病预防治疗上也可以得到应用.添加抗生素是预防和治疗肠毒性大肠杆菌的主要措施之一,但近年来,抗生素的大量使用,引起的高残留,遭到了广泛的置疑和反对,而利用调整肠道正常菌群的微生物活菌剂-益生素[14]作为饲料添加剂的研究和应用已逐渐成为国内外的热点.益生素作用机制中有一种微生物学说,益生素参与消化道有益菌群与致病菌之间生存和繁殖的空间竞争、时间竞争、定居部位竞争以及营养竞争,限制致病菌的生存、繁殖.那如何准确检查治病菌的细菌易・46 ・ 厦门大学学报(自然科学版) 2006年位率是评价益生素有效性的一个标准.而带有GFP标记的肠毒性大肠杆菌,通过带有荧光这样的特殊标记,则可以准确、简单、快速的反应细菌易位率[15]的变化,为益生素筛选、评价提供有效的依据.致谢:感谢扬州大学生物药品研究室帮助完成菌株的血清型鉴定.参考文献:[1] 周凯,郑海州,边艳青,等.肠产毒性大肠杆菌分子生物学及基因工程疫苗的研究进展[J].微生物学杂志,2003,23(5):44-47.[2] Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,et al.Green fluorescentp r otein as a marker of gene exp ressi on[J].Science,1994,263:802-805.[3] Cody C W,Prasher D C,W ester W M,et al.Che m icalstructure of the hexapep tide chr omophore on Aequorea greenfluorescent p r otein[J].B i ochem istry,1993,32:1212-1218.[4] 萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂,王嘉玺,朱厚础,等译.3版.北京:科学出版社,2002:27-30.[5] 奥斯伯F,布伦特R,金斯顿RE,等.精编分子生物学实验指南[M].3版.北京:科学出版社,1999:39. 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肠屏障相关紧密连接蛋白免疫荧光
肠屏障相关紧密连接蛋白免疫荧光1. 引言1.1 背景介绍肠道是人体最大的外界环境与内部环境接触的部位，它既需要充分吸收养分，又需要有效阻止有害物质的进入。
肠屏障是肠道内的保护屏障，它由肠上皮细胞和相关蛋白结合而成，起着防止有害物质侵入体内、维持内环境稳定的重要作用。
肠屏障相关紧密连接蛋白是一类位于肠上皮细胞之间的蛋白质，其主要作用是通过连接细胞与细胞之间的紧密连接，形成一个完整的屏障，防止细菌、毒素和其他有害物质通过间隙进入体内。
近年来，研究人员对肠屏障相关紧密连接蛋白进行了深入的研究，以揭示其在肠道健康和疾病发生中的作用机制。
本文将介绍肠屏障的功能及重要性，以及肠屏障相关紧密连接蛋白的研究进展。
还将探讨免疫荧光技术在肠屏障相关紧密连接蛋白研究中的应用，并展示相关研究结果。
通过深入分析肠屏障相关紧密连接蛋白的分子机制，我们可以更好地理解肠道屏障功能的调节机制，为相关疾病的防治提供新的思路和策略。
1.2 研究目的研究目的是对肠屏障相关紧密连接蛋白进行深入探讨，了解其在维持肠道屏障功能和免疫调节中的作用机制。
通过分析这些紧密连接蛋白在肠道屏障维持和破坏过程中的表达和功能变化，可以揭示肠道疾病发生发展的机制，并为相关疾病的预防和治疗提供理论依据。
研究还旨在探索免疫荧光技术在肠屏障相关紧密连接蛋白研究中的应用价值，为肠屏障研究提供新的技术手段和方法。
通过本次研究，我们希望能够深入了解肠屏障相关紧密连接蛋白的功能和作用机制，为肠道健康提供新的治疗策略和研究方向。
1.3 研究方法研究方法是指在进行肠屏障相关紧密连接蛋白免疫荧光研究时所采用的方法和技术。
在本研究中，我们将主要采用以下几种方法：1.标本采集：我们将从实验动物或人体肠道组织中采集样本进行研究。
在进行标本采集过程中，需要严格遵循相关伦理要求，确保样本的来源合法和道德。
2.免疫荧光染色：免疫荧光技术是本研究的核心技术之一。
通过使用特异性的抗体标记肠屏障相关紧密连接蛋白，我们可以在细胞或组织中准确地识别和定位这些蛋白质的表达情况。
蛋白质聚集的表征方法与技术进展
蛋白质聚集的表征方法与技术进展蛋白质聚集是许多生物学和医学研究中的重要课题，因为它与多种疾病的发生和发展有关，如阿尔茨海默病、帕金森病和2型糖尿病等。
了解蛋白质聚集的表征方法和技术进展对于疾病的早期诊断、治疗和药物开发具有重要意义。
本文将介绍蛋白质聚集的表征方法及其在科研和临床应用中的技术进展。
一、荧光染料法荧光染料法是一种常用的蛋白质聚集表征方法。
其中，Thioflavin T (ThT) 是一种常见的荧光染料，它可以选择性地与β折叠的聚集体相互作用并发出荧光信号。
通过测量荧光信号的强度和形态，可以确定蛋白质聚集的形成和数量。
此外，还有其他一些荧光染料，如Amylo-Glo、Molecular Probes等，也可以用于蛋白质聚集的表征。
二、核磁共振 (NMR)核磁共振是一种非常强大的技术，可以提供蛋白质聚集的结构信息。
通过分析聚集状态下蛋白质的NMR谱图，可以确定聚集体的构成以及构象的变化。
NMR技术在研究蛋白质聚集的动力学和机制方面发挥了重要作用。
然而，由于NMR仪器的高昂成本和技术要求，它在一些实验室或临床环境中的应用仍然有限。
三、质谱法质谱法是一种基于蛋白质分子质量的表征方法。
通过质谱仪分析蛋白质样品，可以确定其分子质量，并与已知的蛋白质聚集产物进行比较。
蛋白质聚集的形成通常会导致分子质量的增加，因此质谱法可以用于检测和鉴定蛋白质聚集的存在和程度。
质谱法具有高灵敏度和高分辨率的优势，适用于复杂样品的分析。
四、透射电子显微镜 (TEM)透射电子显微镜是一种直接观察蛋白质聚集的结构和形态的方法。
通过将样品置于电子束下，观察其透射电子图像，可以获得蛋白质聚集体的高分辨率影像。
TEM技术能够提供关于蛋白质聚集形态、尺寸和形成机制的重要信息。
然而，由于其操作复杂、样品制备困难以及昂贵的仪器成本，TEM在实际应用中存在一定的限制。
五、免疫荧光技术免疫荧光技术是一种利用特异性抗体识别和标记蛋白质聚集的方法。
慢病毒介导的绿色荧光蛋白报告基因对人多能干细胞的生物风险评估研究
工 作 液 、Blebbistatin购 自 安 徽 中 盛 溯 源 生 物 科 技 有 限 公 司 ； 2 m M 谷氨酸盐,0.18 pM p- 巯 基 乙 醇 和 10 mM Y-27632)培养
Matrige丨 购 自 美 国 Coming 公 司 ；Ubi-MCS-EGFP] RES- 8 天 ，形成拟胚体( embryonic body,E B ),将 这 些 E B 铺 到 0.1%
A 通 讯 作 者 ：聂 魏 ，主 要 研 究 方 向 ：干 细 胞 与 组 织 重 建 ，E - m a i l :dr.xinnie@
( 收稿丨J 期 ：2020-丨2 - 2 3 接 受 日 期 :202丨-01-1 8 )
现 物 医 学 Progress in Modern Biomedicine VoL21 NO.12 JUN^021
GFP)报 告 基 因 在 研 究 中 的 应 用 十 分 普 遍 ，且具有其独特的优 势161其 中 慢 病 毒 载 体 由 于 其 整 合 基 因 组 的 特 性 ，其在感染时可 以 有 效 地 将 其 遗 传 物 质 引 入 靶 细 胞 ，可 在 细 胞 或 组 织 中 长 期 稳 定 表 达 目 标 蛋 丨 广 泛 应 用 于 基 W转染m 。但对于慢病毒的安全 性一直存在疑虑，是 否 对 0 标细胞的生物学特性产生不良影响 也较少报道。本 研 究 的 目 的 是 通 过 慢 病 毒 构 建 稳 定 表 达GFP 的 hiPSC,并 验 证 G F P 是否影响细胞的多能性和分化能力。
Green Fluorescence Protein Reporter Gene Labeled Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Lentivirus*
绿色荧光蛋白(GFP)
1994年起，钱永健开始研究GFP， 改进GFP的发光强度，发光颜色（发 明变种，多种不同颜色），发明更多 应用方法，阐明发光原理。世界上应 用的FP，多半是他发明的变种。他的 专利有很多人用，有公司销售。
2008年诺贝尔化学奖获得者
大 家 好
了不起的绿色荧光蛋白（GFP）
By: 药剂121
前言
2008年10月8日，诺贝尔化学奖揭晓。日本科学家 下村修、美国科学家马丁•查尔非和钱永健因发现和改 造绿色荧光蛋白（GFP）而获奖。GFP大家都不陌生， 细胞中散发着点点绿光，煞是好看。1962年被发现， 1992年被克隆，中间隔了30年。而在最近十几年它才 在生物界中被广泛应用。
3.作为荧光靶使用方便,可直接用于活体测定
绿色荧光蛋白的应用前景
骨架和细胞分 动力学裂和泡囊运输 发育生物学 生物技术中的应用研究 肿瘤发病机制的应用 在信号转导中的应用
光伏发电 神经生物学
绿色荧光蛋白的应用前景
将绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中
绿色荧光蛋白的应用前景
1．分子标记
将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），利 用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合 基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显 微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。
1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
绿色荧光蛋白GFP基因的克隆表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (5)3 实验设备 (5)4 材料及试剂 (6)5 实验操作步骤 (6)5.1操作流程 (6)5.2质粒DNA的分离与纯化 (7)5.2.1 质粒的培养 (7)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (7)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (8)5.3酶切及连接 (9)5.3.1 双酶切 (9)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (10)5.3.3 连接 (11)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (11)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (11)5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (11)5.4.3 转化涂板 (12)5.5GFP蛋白的诱导表达 (13)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (13)参考文献 (14)附录 (15)1LB培养基的配制： (15)2.溶液Ⅰ (15)3.溶液Ⅱ (15)4.溶液Ⅲ（100ML） (15)5.DN ASE-FREE RN ASE A (15)6.TE缓冲液（P H8.0） (15)7.20×TBE (16)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (16)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (16)10．P ET-28A质粒全图谱 (17)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
bifc实验原理
bifc实验原理BIFC实验原理。
BIFC（Bimolecular Fluorescence Complementation）是一种用于研究蛋白质相互作用的技术。
它利用了融合蛋白质与荧光蛋白的原理，通过观察它们的相互作用来揭示蛋白质间的相互作用关系。
本文将介绍BIFC实验的原理及其应用。
BIFC实验的原理是基于蛋白质相互作用导致的荧光蛋白重组。
在BIFC实验中，需要将FeYFP（Fragment of Enhanced Yellow Fluorescent Protein）和NeCFP（N-terminal fragment of Cyan Fluorescent Protein）分别融合到待研究的两个蛋白质上。
当这两个融合蛋白质发生相互作用时，FeYFP和NeCFP会重新组合形成完整的荧光蛋白，从而产生荧光信号。
通过观察这种荧光信号的强度和位置，可以判断待研究蛋白质间的相互作用情况。
BIFC实验的应用非常广泛，特别是在研究蛋白质相互作用网络和信号转导通路方面。
通过BIFC实验，可以快速、直观地筛选出潜在的蛋白质相互作用关系，有助于揭示细胞内复杂的生物学过程。
此外，BIFC实验还可以用于筛选药物靶点和研究疾病发生机制，对于生命科学领域具有重要意义。
在进行BIFC实验时，需要注意一些实验细节。
首先，选择合适的融合标签和荧光蛋白是非常重要的，不同的蛋白质对其结构和功能可能有不同的要求。
其次，实验条件的控制也是至关重要的，包括温度、pH值、离子强度等因素都可能影响到实验结果。
最后，对实验结果的分析和解读也需要谨慎，应该综合考虑荧光信号的强度、位置和稳定性等因素。
总的来说，BIFC实验是一种非常有价值的蛋白质相互作用研究技术，它的原理简单直观，应用广泛灵活。
通过BIFC实验，我们可以更好地理解蛋白质相互作用的机制，为生命科学领域的研究提供重要的技术支持。
希望本文的介绍能够帮助读者更好地理解BIFC实验的原理和应用，促进相关领域的科研工作取得更多的进展。
gcamp荧光蛋白的激发和发射光谱
一、gcamp荧光蛋白的概念gcamp是一种常用的荧光探针，用于监测细胞内钙离子浓度的变化。
它由荧光蛋白和钙结合蛋白组成，当靶向细胞内钙离子浓度增加时，gcamp荧光蛋白会发生构象改变，从而产生荧光信号。
gcamp荧光蛋白的激发和发射光谱是评价其性能和应用的重要指标。
二、gcamp荧光蛋白的激发光谱激发光谱是指在不同波长的激发光照射下，荧光蛋白所发出的荧光光谱。
gcamp荧光蛋白的激发光谱范围通常在450nm至500nm之间，具体波峰位置和相对强度取决于该种gcamp的具体构型和化学结构。
通过对gcamp荧光蛋白进行激发光谱分析，可以确定最佳的激发波长，从而在实际应用中更好地激发其荧光信号。
三、gcamp荧光蛋白的发射光谱发射光谱是指在激发光的照射下，荧光蛋白所产生的荧光光谱。
gcamp荧光蛋白的发射光谱范围通常在510nm至550nm之间，具体波峰位置和相对强度也取决于其构型和化学结构。
发射光谱的分析可以帮助确定最佳的检测波长范围，从而提高检测的灵敏度和准确性。
四、gcamp荧光蛋白的激发和发射光谱特点gcamp荧光蛋白的激发和发射光谱具有以下特点：1. 宽波长范围：gcamp荧光蛋白的激发和发射光谱覆盖了较宽的波长范围，这使得它可以适用于不同波长激发光源的激活和检测。
2. 高荧光强度：gcamp荧光蛋白在适当的激发光波长下，具有较高的荧光强度，可以在低浓度下进行高灵敏度的检测。
3. 稳定性：gcamp荧光蛋白在不同环境条件下具有较好的稳定性，能够在细胞内部稳定地发出荧光信号，对于长时间持续监测具有优势。
五、gcamp荧光蛋白的应用由于gcamp荧光蛋白具有优良的激发和发射光谱特性，因此被广泛应用于生物医学研究领域，如神经科学、细胞生物学等领域：1. 神经元活动成像：gcamp荧光蛋白可以被用来标记神经元，并通过检测钙离子在神经元内的动态变化来研究神经元的活动情况。
2. 药物筛选：gcamp荧光蛋白可以被用来研究药物对细胞内钙离子浓度的影响，进行药物筛选和药理学研究。
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荧光蛋白研究进展赵嫚学院：理学院班级：应化0803班学号：2008310203907摘要：凭借在绿色荧光蛋白质(GFP)研究领域取得的重要成就，3 位科学家获得了今年的诺贝尔化学奖，他们分别是马丁·查尔菲、钱永健和下村修。
绿色荧光蛋白质可以帮助科学家了解细胞机制如何工作。
利用转基因技术，所有细胞和动物都可以产生荧光蛋白质。
康涅狄格学院化学家、《发光基因》作者马克·齐默将绿色荧光蛋白质称之为“21 世纪的显微镜”。
通过让基因携带绿色荧光蛋白质——与瘤转移或大脑功能有关的基因——科学家只需通过寻找荧光便可知道基因何时以及为什么“开启”。
本文就GFP的发现历程、生化特性、及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。
关键词:荧光蛋白质 GFP 诺贝尔化学奖研究前景1、荧光蛋白质简介荧光蛋白质为从发光生物中分离出的发光性蛋白质。
它不是虫荧光素、虫荧光酶那种酶蛋白质催化所引起的发光，而是通过低分子物质催化而发光的蛋白质。
水母的发光蛋白质（aequorin）是通过Ca2+而发光的。
海仙人掌类的Renilla也含有同样的发光蛋白质。
这种物质包含在细胞内颗粒中，这种颗粒称发光小体（lumisome），发光蛋白质所包含的发光物体是与海荧虫荧光素极为相近的物质，因而推测，发光蛋白质的发光与虫荧光素、虫荧光素酶反应有着密切的关系。
自1992 年绿色荧光蛋白基因从水母体内克隆以来，现在已经从很多的海洋生物物种中克隆到了新的荧光蛋白，它们能特异地“点亮”生物分子或细胞，并显示出生物分子的活动情况，从而能更有助于我们揭示这些分子或细胞的活动规律及本质。
已报道的荧光蛋白光谱分布于整个可见光区，它们被广泛应用于基因的表达调控、蛋白质空间定位与转运、蛋白折叠、信号传导、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用等研究领域，荧光蛋白的发现与应用为现代生物学的研究提供了强有力的研究手段。
日籍科学家下村修（Osamu Shimomura）首次从水母(Aequorea victoria) 中分离出绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，美籍教授查尔菲（Martin Chalfie）首次将GFP 的cDNA 转到新的物种中表达。
美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）率先阐述了GFP 发光的化学机制，并于1995 年通过单点突变(S65T) 技术获得了荧光强度和光稳定性大大增强的GFP 突变体(GFP-S65T)。
Tsien 研究组基于GFP，进一步突变出了蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein，BFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP) 和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)。
后来，研究人员又从珊瑚和海葵等物种中克隆出光谱红移的荧光蛋白，极大地扩展了荧光蛋白的多色成像应用。
近几年来，科学家巧妙地将光活化与光转换荧光蛋白应用于高分辨成像，突破光学衍射极限，分辨率达到几十纳米，这是显微成像技术史上的一次革命性的飞跃。
这三位科学家因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖。
他们的工作不但在科学上对化学、生物学、医学等领域具有重要的意义，而且也与人们的日常生活密切相关，对于提高人类的生活品质以及进一步改善人类的健康有十分重要的意义。
2、研究GFP的时间线索GFP从最初被发现到今天广为应用，经历了半个多世纪的时间。
首先简单回顾一下这半个多世纪内和GFP相关的主要事件。
1955年人们首次注意到水母体内的绿色荧光物质。
1962年下村修从维多利亚多管水母中提取并分离了GFP，证实了绿色荧光物质是一种蛋白质。
它的溶液在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。
1969年之前称为绿色蛋白质（green protein）得名“绿色荧光蛋白”。
1974年研究发现光蛋白和GFP两种分子之间会发生能量转移。
1979 年下村修找到了GFP 中的生色基团（Chromophore）1985年普腊石（Douglas Prasher）根据蛋白质的氨基酸顺序拿到了光蛋白（水母素）的基因。
1992年普腊石拿到了GFP的基因。
1993年GFP中生色基团的结构被确认。
1994年沙尔菲通过大肠杆菌和线虫研究获得了GFP的生色机理；是年，第一种蓝色荧光蛋白被报道，并提到了它可用于荧光共振能量转移（FRET）实验中。
1995 年研制出了增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它的转录速度比野生GFP 快四倍。
1996年得到了野生GFP和EGFP的晶体结构，钱永健在EGFP的基础上，利用突变技术，设计并研制出黄色荧光蛋白。
1997年光蛋白和GFP被用于Ca2+的敏感指示剂。
1999年后各种各样的荧光蛋白被发明、改造并用于科学研究。
在研究GFP的50多年间， 2008年诺贝尔化学奖的三位得主做出了至关重要的贡献。
3、GFP的生化性质1962年，Shimomura O等首次从多管水母属(Aequorea victoria)中分离纯化出了GFP，随后人们对GFP进行了广泛研究，目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Renilla)的荧光蛋白，即A—GFP和R—GFP。
A—GFP 是分子质量为27 ku～30 ku的蛋白单体，R—GFP是分子质量为54 ku的同型二聚体，二者都是酸性球状蛋白质，氨基酸组成相似，发射光谱基本相同，但激发光谱不同。
A—GFP在395 nm和470 nm具有吸收高峰，R—GFP在498 nm具有强烈的光吸收。
只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，但与荧光的产生直接有关的是GFP 分子中一小段被称为色基(Chromophore)的部位。
GFP用作标记蛋白，具有以下优点：①荧光稳定。
GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；GFP在pH 7～12范围内也能正常发光；对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶Pronase除外)都有较强抗性。
②检测方便。
用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可进行活体观察，不会损伤正在生长的细胞和组织；③无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制，Chalfie M等用PCR方法扩增GFP cDNA后，克隆到原核表达载体上，转化大肠埃希菌，经IPTG诱导后，在紫外光照射下转化细菌能发出绿色荧光；④GFP对受体细胞基本无毒害；⑤不受假阳性干扰。
由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料避免由于染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠；⑥不需任何反应底物和辅助因子；⑦可制成永久标本。
GFP的荧光可以耐受光漂白，也可耐受福尔马林的固定，因而可制成长期保存的标本；⑧灵敏度高。
GFP标记方法比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率。
尽管GFP基因作为报告基因或分子探针有许多优点，但野生型GFP发光较弱，其次荧光反应不是酶反应，不能通过添加某些物质来加强信号，且不易对荧光进行定量检测。
另一方面，GFP基因在植物细胞内的表达频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表达。
4、GFP的应用前景GFP分子质量小，能够在异源细胞中稳定表达并发射荧光，不需要任何辅助因子参加，对细胞没有毒性，因而得到广泛应用。
3．1 作为报告基因构建基因工程载体常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ，是利用酶促催化反应，需要加人外源底物和诱导物(如IPTG，X—gal)，不仅操作繁琐且价格昂贵。
现已构建了以GFP S65T基因作为筛选标记的新型克隆载体，建立了以绿白斑筛选法筛选阳性重组子的新方法，替代LacZ蓝白斑筛选，不需X—gal，经济，简单可行。
3．2 目的基因的功能研究将目的基因与GFP基因连接后，通过观测融合蛋白的荧光特性研究其表达和功能。
哺乳动物细胞表达两种DNA拓扑酶，该酶的N末端和中部结构域序列高度保守，而其C末端结构域(C—terminal-domain，CTD)具有种属特异性。
为了确定体内核定位是否仅有CTD参与就可完成，将C末端基因与GFP基因连接，并在GALl启动子驱使下在酵母细胞中表达。
通过检测GFP信号，发现两种拓扑酶的CTD均得到表达，而且拓扑酶Ⅱ-GFP仅在细胞的有丝分裂期发现，拓扑酶Ⅱ-GFP主要出现于细胞分裂间期，结果说明拓扑酶的CTD即足以充当核定位的信号。
3．3蛋白质缔合作用研究Hale C A等利用GFP标记，研究了可溶性微管蛋白FtsZ与其内膜受体ZipA问的缔合作用，他们将GFP与ZipA融合，并用FtsZ与之直接结合，通过荧光检测发现，ZipA—GFP融合蛋白在细胞壁缢缩前和缢缩过程中均位于FtsZ与膜相关的特殊环中，说明ZipA—FtsZ的相互缔合是细胞分裂必需的。
ZipA可能直接参与FtsZ 环的形成和功能。
3．4 病原体与宿主关系的研究将病原体用GFP活体标记，可以在全真条件而不是模拟条件下实时研究病原体与宿主的关系。
将GFP基因插人基因组，体外转录获得感染性RNA，并以之接种烟叶，观察发现在接种点和整个植株均可表达GFP。
持续观察GFP的出现情况，发现整株感染时TMV以两种方式运动：①细胞间慢的传播，伴随病毒复制的GFP表达；②维管介导的快速转运，病毒不复制，GFP不表达。
3．5 GFP在生态学中的应用将GFP基因直接导入目标生物或将GFP基因克隆到病毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标生物，进行生态学规律研究。
用GFP基因标记遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去向。
朱应等构建了带GFP基因的重组棉铃虫病毒。
该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染，室内饲养3代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫，表明病毒可以介导GFP标记其宿主，预计将为研究棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段。
3．6 GFP在生物防治中的应用目前生物农药的杀虫效果往往得不到准确评估。
利用GFP标记，通过荧光观察可以避免评估杀虫剂杀虫效果时仅仅记录有典型感染症状的害虫个体，而忽视无明显感染症状但确实已经感染或正在感染的害虫个体，同时无需进行分子生物学鉴定即可方便地区分杀虫剂致死和天然病原致死，从而客观准确地评价杀虫剂的毒力。
3．7 GFP作为一种新型免疫标记物的探索利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。
现已将GFP基因与猪圆环病毒的特定基因相连，进行核酸定位，也成功地实现了GFP基因与HBVe Ag基因融合后在大肠埃希菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。