酶原的共价修饰
《酶分子的修饰》课件
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
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第三章 酶的化学修饰
第三章酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
酶工程 第五章酶分子修饰 第二节大分子结合修饰
第二节 大分子结合修饰
超氧物歧化酶SOD，属氧化还原酶类。SOD广泛存在于 生物体内。它可以催化超氧负离子(O2-)进行氧化还原反 应。反应时，一个超氧负离子被还原为双氧水，同时另一 个超氧负离子氧化为氧气。其反应方于SOD能消除体内的超重负离子，所以受到医药界 的极大关注。实验证明，外源SOD具有保护DNA、蛋白质和 细胞膜的作用，使它们免遭超氧负离子的破坏。对治疗类 风湿性关节炎、白内障、膀胱炎、皮肤炎、红斑狼疮等疾 病疗效较好，对辐射有防护作用。同时，不管用何种给药 方式，均没有发现任何副作用。由此可见，SOD是一种很 有前途的药用酶。然而，超氧物歧化酶在体内稳定性差， 当采用静脉注射方式给药时，SOD在体内的半衰期只有6～ 30min，这大大影响其使用效果。
酶工程
第五章 酶分子修饰
第二节 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某 些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分 子结合修饰法。简称为大分子结合法。
通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙 二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大 分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分 子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先 经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。
用水溶性大分子结合法修饰超氧物歧化酶，可使其在 体内的稳定性显著提高，半衰期可延长70～300多倍。并 可明显抑制注射时出现的局部刺激反应。
第二节 大分子结合修饰
此外，修饰酶的热稳定性可显著提高，并具有较强的 抗蛋白酶水解、抗酸碱以及抗氧化的能力。例如：L-天门 冬酰胺酶用聚丙氨酸结合修饰后，其对热的稳定性大大提 高；木瓜蛋白酶与右旋糖酐结合，显著增强其抗酸碱和抗 氧化能力。
酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生
非共价修饰
使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。
第五章 酶分子修饰
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通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 包括物理修饰、化学修饰，分子改造等
第一节 概述
酶修饰的作用 稳定酶的天然构象与增强耐热性 保护酶活性部位与抗抑制剂 维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 降低酶的抗原性及稳定酶的微环境 改变酶学性质
利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变
利用上述原理，可以通过重叠延伸PCR技术对基因的中心区段进行取代、插入和缺失突变。
PART ONE
2．盒式突变法
基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。
常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。
寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素
DNA模板的制备；
寡核苷酸突变引物的设计和选择；
突变引物与模板DNA的退火和延伸条件；
DNA聚合酶的选择；
底物对离体DNA合成反应的影响；
受体细胞对突变体的产率的影响。
几种寡核苷酸介导的基因突变方法
Kunkel 突变法 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变
第五章酶分子的化学修饰：
第五章酶分⼦的化学修饰：第五章酶分⼦的化学修饰：⾃然界本⾝就存在着酶分⼦改造修饰过程,如酶原激活、可逆共价调节等。
⾮共价修饰：添加剂；⽢油、多糖、聚⼄⼆醇等多羟基化合物表⾯活性剂，⽜乳过氧化物酶活⼒在3-4天完全丧失，添加表⾯活性剂B2，维持获利10天上；蛋⽩质间的⾮共价连接α-淀粉酶70℃半衰期5民，抗体保护，16h.从⼴义上说，凡通过化学基团的引⼊或除去．⽽使蛋⽩质共价结构发⽣改变，都可称为酶的化学修饰。
从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的⽅式使⼀种蛋⽩质同某些化学试剂起特异反应，从⽽引起单个氨基酸残基或其功能基团发⽣共价的化学改变。
50年代，化学修饰⽤于研究蛋⽩质结构和功能的关系。
为了考察蛋⽩质中氨基酸残基的各种不同状态和确定哪些残基处于活性部位并为蛋⽩质的特定功能所必需。
20世纪70年代末以来,有关⽤合成⾼分⼦如聚⼄⼆醇(ＰＥＧ)及其衍⽣物进⾏蛋⽩质化学修饰，⽬的是⽤于⽣物医学和⽣物技术⽅⾯。
意义：1．基础酶学的研究；活性部位的研究氨基酸顺序分析中，胰酶对精氨酸和赖氨酸具有⾼度特异性,故常⽤此酶⽔解蛋⽩质,以制备肽碎⽚.为防⽌精氨酸和赖氨酸相互⼲扰的问题,可利⽤选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸,使⽔解局限在其中⼀个残基的肽键上；测定酶分⼦中某种氨基酸的数量。
探索酶的作⽤机理和催化反应历程2．提⾼⽣物活性(包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变)；3．增强在不良环境中的稳定性；4．针对特异性反应降低⽣物识别能⼒．解除免疫原性；5．产⽣新的催化能⼒。
第⼀节酶分⼦的修饰⽅法⼀、酶的表⾯修饰（⼀）⼩分⼦修饰：利⽤⼩分⼦化合物对酶的侧链基团进⾏化学反应在蛋⽩质结构与稳定性的关系的研究中发现蛋⽩质结构对稳定性⽽⾔并⾮最合适的，蛋⽩质表⾯的⼀半基团由⾮极性氨基酸组成,蛋⽩球体的⾮极性表⾯原⼦簇与⽔接触不利于酶的稳定.因此,利⽤⼩分⼦化合物使蛋⽩球表⾯亲⽔化以提⾼酶的稳定性。
酶分⼦表⾯的功能基：羧基、氨基、巯基、羟基、咪唑基等⼄酰咪唑、卤代⼄酸、N-⼄基马来酰亚胺、碳化⼆亚胺、焦碳酸⼆⼄酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺等酶分⼦表⾯的亲⽔化提⾼稳定性。
酶作用机制
酶活性中心示意图
S- S
活性中心外 必需基团 活 性 中 心 必 需 基 团
底物
结合基团
催化基团 肽链
活性中心
多肽链 底物分子 活性 中心 以外 必需 基团 酶活性中心 活性 催化基团 中心 必需 结合基团 基团
有的酶的必需基团 兼有两者的功能
胰凝乳蛋白酶活性部位示意图
一些酶活性中心的氨基酸残基
酶
糖原磷酸化酶 磷酸化酶b激酶 糖原合成酶 丙酮酸脱羧酶 磷酸果糖激酶 丙酮酸脱氢酶 HMG-CoA还原酶 HMG-CoA还原酶激酶 乙酰CoA羧化酶 脂肪细胞甘油三脂脂肪酶 黄嘌呤氧化酶
化学修饰类型
磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 -SH/-S-S-
1
（接近过渡 CH 2 CH 2 态） 108
O
三）酸碱催化
酸碱催化是通过瞬间的向反应物提供质子或 从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应 的一类催化机制。
狭义的酸碱催化 H+、OH-
酸碱催化
广义的酸碱催化，质子受体和供体
酶蛋白中具有广义的酸碱催化的功能基：氨 基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基等。
His存在于许多酶的活性中心；咪唑基是催化中很活泼的一个催化 功能基，它既能供出质子又能接受质子，且速度十分迅速，所 以，His在Pr的含量虽小，往往位于活性中心。
研究酶活性部位的方法
1．分子侧链基团的化学修饰法 2、动力学参数测定法 3、射线晶体结构分析法 4、定点诱变法
二、酶反应的独特性质
• 酶反应；一类反应仅涉及电子转移，另一类 反应涉及电子和质子两者或其他基团的转移 • 酶催化作用以残基上的功能基团和辅酶为媒 介，如His, Ser, Cys, Lys, Glu, Asp • 酶催化反应的最适pH范围狭小 • 酶活性部位比底物稍大 • 酶除进行催化反应所必需的活性基团外，还 有其他因素，如使底物产生张力等作用因素
共价修饰的主要方式
共价修饰的主要方式1. 引言共价修饰指的是利用酶催化的共价键形成或断裂的化学修饰方式，由于共价键具有非常稳定的化学性质，因此共价修饰在细胞内能够发挥长效调控作用。
在生物学研究中，共价修饰是研究蛋白质功能和调控机制的重要途径之一。
2. 磷酸化修饰磷酸化修饰是最为常见和重要的共价修饰方式之一，它能够对蛋白质的结构、功能、定位和相互作用等方面产生重要影响。
蛋白激酶和蛋白磷酸酶是磷酸化修饰的主要调节因子，它们能够在细胞内感应各种内外环境的信号，并将这些信号转化为相应的蛋白质磷酸化或去磷酸化。
3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是一种在赖氨酸残基上引入乙酰化基团的修饰方式，它能够影响蛋白质的稳定性、亲水性、局部构象和功能性。
对于某些蛋白质，乙酰化修饰还能够促进其核糖体识别和转录因子结合，从而影响基因表达的调控。
4. 糖基化修饰糖基化修饰是在蛋白质上引入糖基团的一种修饰方式，它是细胞表面分子的重要组成部分，还能够影响蛋白质的稳定性、保护性和细胞信号传递能力。
在糖基化修饰中，N-糖基化和O-糖基化是两种最为常见的方式，它们能够通过不同的酶系统和底物参与到细胞内的各种代谢和信号通路中。
5. 甲基化修饰甲基化修饰是在蛋白质上引入甲基基团的修饰方式，它能够影响某些特异性的蛋白质结构、功能和稳定性，还能够参与到基因转录、DNA复制和DNA修复等过程中。
甲基化通常发生在赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸等氨基酸残基上，它需要依赖特定的酶系统和底物参与到细胞内的代谢和调控中。
6. 结论共价修饰是细胞内一种广泛存在的蛋白质化学修饰方式，它广泛参与到细胞代谢和信号通路调控中，并且对生物学的许多领域具有重要的启示意义。
因此，对于共价修饰的深入研究，将有利于我们更好地理解生命的机制、疾病的发生和治疗以及生物资源的合理利用。
酶分子的修饰
1.1.5 脂质体包裹
酶脂质体包埋，能使一些被包埋的大分子的酶进入 细胞内。
许多医药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大， 不易进入细胞内，且在体内半衰期短，产生免疫原 性反应。为此，可通过酶的表面化学修饰来解决， 如SOD用聚乙二醇(PEG)修饰，修饰后其在体内的 稳定件及免疫原性都大大改善。但如何让修饰后的 SOD进入细胞内？可以采用脂质体包裹的方法。
如将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys 残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力， 但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。这种方 法由于受到专一试剂、有机化学工业水平的限制，没 有蛋白质工程技术普遍，但它通过产生非蛋白质氨基 酸的能力，可以有力地补充蛋白质工程技术。
1.2 酶分子内部的修饰
半衰期 6 min
7h 14 h 24 h 35 h
相对稳定性 1
70 140 240 350
此外，还有脂质体包裹、反相胶团微囊化等 修饰方法
1.2 酶分子内部的修饰
1.2.1非催化活性基团的修饰
3 反应用体系中化酶与学修饰试剂的比剂例 与酶蛋白上的非催化活性基团部位的一 些氨基酸残基进行共价连接进行修饰的方法。 通过有目的、选择性修饰侧链成分来实现催化活性基团部位内的氨基酸的取代，这种将氨基酸侧链转化为另一种新的氨基酸侧链的方
另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用 时，其表面区域内排除了水分子，降低了介电常数，因而 增加了相互作用力，其稳定性也就增加。因此酶的多聚体 或酶聚合体的活力和稳定性比单体高
（2）大分子共价修饰
利用水溶性大分子与酶结合使酶的空间结构发生 某些精细改变，从而改变酶的特性与功能的方法 称为大分子结合修饰法，简称大分子结合法。
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酶原的共价修饰
酶是一种生物催化剂，例如胰岛素酶、乳酸脱氢酶等，它们能够加速
生物化学反应的进行。酶原是酶的未成熟形态，需要通过一系列的修
饰才能转化为活性酶。其中，共价修饰是一种重要的修饰方式。
共价修饰是指在酶原分子内部的氨基酸残基上发生的化学反应，从而
改变其活性的修饰。这种修饰方式包括磷酸化、甲基化、乙酰化、酰
化等。
以下是酶原的共价修饰及其作用的列表：
1. 磷酸化：是一种通过加入磷酸基团进行的共价修饰。磷酸化能够改
变酶原的构象和空间结构，从而激活或抑制酶的活性。例如，蛋白激
酶的磷酸化能够使其成为活性酶，促进细胞信号传递的进行。
2. 甲基化：是一种通过加入甲基基团进行的共价修饰。甲基化能够改
变酶原的电荷分布和空间结构，从而影响其活性和稳定性。例如，
DNA甲基化能够影响基因的表达，调节细胞的生长和分化。
3. 乙酰化：是一种通过加入乙酰基团进行的共价修饰。乙酰化能够改
变酶原的电荷分布和空间结构，从而影响其活性和稳定性。例如，组
蛋白的乙酰化能够激活基因的表达，促进细胞分化和增殖。
4. 酰化：是一种通过加入酰基团进行的共价修饰。酰化能够改变酶原
的电荷分布和空间结构，从而影响其活性和稳定性。例如，醋酸酰化
能够激活脂肪酸的代谢，促进能量的产生。
共价修饰是酶原转化为活性酶必不可少的过程之一。通过磷酸化、甲
基化、乙酰化、酰化等修饰方式的作用，酶原能够在细胞内达到合适
的表达水平，并确保其活性能够被准确地调节和调控。