实验报告--western

摘要

我们试验中对目的基因AKP进行了克隆和表达，并分析了表达产物的活性。我们利用PCR方法扩增目的基因并提取大肠杆菌质粒，对扩增产物和质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析，琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物和质粒纯度符合实验要求；对质粒DNA和目的基因AKP进行双酶切后用琼脂糖凝胶电泳分析结果，并回收酶切产物以及连接载体和AKP，Ca2+诱导法将连接产物转化到感受态细胞；利用菌落特征和琼脂糖凝胶电泳分析结果筛选重组子；对确定正确的重组子用Ca2+诱导法转化，提取表达产物；对表达产物（AKP）进行酶活性检测，结果显示表达产物活性显著高于对照组；SDS-PAGE检测和蛋白印迹显示目的基因AKP成功表达。

关键词：目的基因AKP，表达产物

In our test, we cloned and expressed the gene of AKP, and analysis the activity of the product of expression, We make use of the polymerase chain reaction (PCR) to product purpose gene and extract the E·coli of plasmid, using agarose gel electrophoresis analysis the product of PCR and plasmid, the results show that the purity of the product of PCR and plasmid comply with the requirements; using enzyme cut the plasmid DNA and purpose gene(AKP),then, analysis the results of enzyme cut with agarose gel electrophoresis and recycling enzyme products, after that ,we connect the carrier and the AKP, using Ca2+put the products of connect into the feeling state cells; we screening recon with the features of colonies and the results of agarose gel electrophoresis; we transform the right recon into the feeling state cells with Ca2+, then, we collect the products of expression; we test the AKP on the activity enzyme, the results show us that the activity of enzyme is significantly higher than the control group; the test of SDS-PAGE and Western-blot show that the gene of AKP express successes.

KEY WOEDS: purpose gene of AKP, the products of expression

一、引言

1 PCR技术原理

1.1 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）：简称PCR技术，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR 原理示意图如图一。

图一：PCR原理示意图

1.2 PCR反应参数

1)变性：94℃下预变性2-10min，一般变性温度与时间为94℃1min。对于

富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

2)退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的

长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。

3)延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.

实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围

可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

4)循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般

而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加, 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。

1.3 扩增条件的优化

1)优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间

2)优化Mg2+浓度

3)模板的纯度，优化模板浓度（含有污染物等）

4)优化dNTP的浓度

5)优化引物浓度（一般是10pmol/L）

6)PCR仪：热盖、升降温速度、精度

7)PCR管的质量等

2 核酸的凝胶电泳

1)电泳：带电粒子在电场中的涌动现象

a)丙烯酰胺凝胶电泳，5bp—500bp（分辨率高，1 bp)

b)琼脂糖凝胶电泳，200bp—50kb（分离范围广、方便）

2)琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改

变孔径的大小，起到分子筛的作用。

3)空隙大小决定其分辨分子大小的能力。

a)空隙小，分辨率高：小分子较易通过，大分子难通过

b)空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过