动物实验大鼠软骨、滑膜的切取方法
不同强度的主动运动对大鼠膝关节软骨的影响
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实验性关节炎大鼠滑膜组织HGFc-Met信号通路基因表达研究
Strait Phdrmaceuticol JoumaJ Vol33No.1222124759/81•42巨红叶,杨宁梅，焦莹，等•基于响应面优化的穿山龙薯蓣皂苷吸入粉雾剂的制备工艺研究4〕.中华中医药杂志,2518,35(11)：5279184〔2〕江荣高，刘衡，王立青，等•喷雾冷冻干燥法制备供吸入的超轻干扰素粉末4J〕•中国药学杂志,2027,(25)：364964•45〕黄立新，周瑞君,A.S.Mujumdpa近年来喷雾干燥技术研究进展和展望4〕干燥技术与设备,2508,(21),〔2〕许莹，王嘉新,栾瀚森，等.喷雾冷冻干燥法制备布地奈德富马酸福莫特罗干粉吸入颗粒及其特性评价中国医药工业杂志,2519,32(24)：424929.〔2〕毕茹.胰岛素固体脂质纳米粒粉雾剂的制备〔〕•西北药学杂志,2511,25(25)：024-256.46〕国家食品药品监督管理总局药品审评中心.吸入制剂质量控制研究技术指导原则〔S〕.2027•47〕申海燕，朱家璧.多肽和蛋白质及疫苗类药物干粉吸入给药的研究进展〔〕•国外医学药学分册,2575,34(4)：8296.48〕倪晨明，高静，高申.布地奈德粉雾剂的制备及质量控制4〕实用医药杂志,2508472)：185986.〔2〕贺锐锐，李丽，杨进波.FDA对吸入粉雾剂的体内外生物等效性研究介绍〔〕•中国食品药品监管472406)：2499•.药理.实验性关节炎大鼠滑膜组织HGF/c-Mct信号通路基因表达研究黄燕愉1,张南文2,魏桂财5,罗鸿斌5,陈晓乐2,林彬生5*(4厦门医学院附属第二医院，福建厦门36202；2.福建医科大学药学院，福建福州彳厶222；2.厦门大学附属福州第二医院骨科，福建福州350021；4.福建医科大学附属第一医院骨科，福建福州350095；5:福州市第一医院，福建福州377071)摘要：目的筛选实验性关节炎大鼠滑膜组织中HGF/oMet信号通路基因表达，探讨实验性关节炎可能的发病机制。
独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research 文章编号:2095-4344(2019)19-02965-07 2965
www.CRTER.org ·研究原著·
吴广文，男，1982年生，福建省泉州市人，汉族，2014年福建中医药大学毕业，博士，副研究员，主要从事中西医结合防治骨关节炎研究。
通讯作者：叶锦霞，高级实验师，硕士生导师，福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122
文献标识码:A 稿件接受：2019-02-28
Wu Guangwen, MD, Associate researcher, Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Corresponding author: Ye Jinxia, Senior experimentalist, Master’s supervisor, Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
独活寄生汤治疗膝骨关节炎的作用机制 吴广文1，刘淑如2，陈 俊3，林 洁1，赵忠胜1，叶锦霞1 (1福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122；2福建中医药大学附属第二人民医院，福建省福州市 350003；3福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建省福州市 350122 ) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1241 ORCID: 0000-0002-2961-8280(吴广文)
动物实验的基本操作方法
（一）皮下注射 （二）皮内注射 （三）肌肉注射 （四）腹腔注射 （五）静脉注射 （六）淋巴囊注射 （七）经口给药 （八）其它途径给药
如呼吸道给药、皮肤给药、脊髓腔内给药、小脑延 髓池给药、脑内给药、直肠内给药、关节腔内给药等。
六、实验动物的Байду номын сангаас醉
（一）常用的麻醉剂 1、挥发性麻醉剂；2、非挥发性麻醉剂； 3、中药麻醉剂。
（五）兔的抓取固定方法
1、抓取：一般以右手抓住兔颈部的毛皮提起，然后左手托其 臀部或腹部，让其体重重量的大部分集中在左手上。
2、 固定：一般将家兔的固定分为盒式、台式和马蹄形三种。 盒式固定，适用于兔耳采血、耳血管注射等情况；若做血压
测量、呼吸等实验和手术时，则需将兔固定在兔台上;马蹄形 固定多用于腰背部，用马蹄形固定器可使兔取用背卧位和腹卧 位，所以是研究中常采用的固定方法。
（二）动物的麻醉方法 1、全身麻醉 （1）吸入法；（2）腹腔和静脉给药麻醉法 2、局部麻醉 3、麻醉注意事项 （1）静脉注射必须缓慢 （2）麻醉时需注意保温
七、实验动物采血方法
（一）小鼠、大鼠采血法 1、割（剪）尾采血 2、鼠尾刺血法 3、眼眶静脉丛采血 4、断头取血 5、心脏采血 6、颈动静脉采血 7、腹主动脉采血 8、股动（静）脉采血
（一）小鼠抓取固定方法 小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提
起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇 指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中， 把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。
尾静脉注射时，可用小鼠尾静脉注射架固定，先根据动物 大小选择好合适的固定架，并打开鼠筒盖，手提鼠尾巴，让动 物头对准鼠筒口并送入筒内，调节鼠筒长短合适后，露出尾巴，
动物的实验技术和方法
实验一动物的实验技术和方法动物实验的方法是各种各样的，如常用模型复制法、切开和分离法、切除和注入法、离体组织器官法等，在不同的研究领域有其不同的目的和应用，但是一些基本的操作技术方法是一样的，如动物的抓取、固定、标号、脱毛、麻醉、给药、采血、采尿、处死等，对于实验研究者来说无论从事哪一类研究项目，都会不同程度的应用这些技术。
下面以大鼠为例，介绍相关的动物实验技术。
一、动物的抓取和固定方法抓大鼠时，最好戴上防护手套。
如果是灌胃、腹腔注射、肌肉和皮下注射时，可用拇指、食指捏住大鼠的耳朵及头颈皮肤，余下的三指紧捏住背部皮肤，置于掌心中，调整大鼠在手中的姿势后即可操作。
另一种方法是张开左手虎口，迅速将拇指、食指插入大鼠的腋下，虎口向前，其余三指及掌心握住大鼠身体中段，并将其保持卧位，之后调整左手拇指位置，紧压在下颌骨上（不可过紧，否则会造成窒息），即可进行实验操作。
若对大鼠进行采血和手术操作，需对大鼠进行麻醉后，将四肢用棉线固定在实验板上，为防止苏醒时伤人或便于颈、胸部实验操作，应用棉线将大鼠两上门齿固定于实验板上。
二、动物的编号、标记、分组和被毛方法1、和标记方法在动物实验中，为了观察每个实验动物的反映情况，必须对实验动物进行编号、标记。
标记的方法应该保证号码清楚、耐久、简便、易认和使用。
比如：染色法、挂牌法、烙印法、耳孔法。
一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用挂牌法和烙印法。
大鼠常常选用染色法，即用化学剂在动物身体明显的部位如被毛、四肢等处进行涂染或用不同颜色等来区别各组动物，是最常用、最容易掌握的方法。
这种方法多用于实验周期较短，动物数量不多的情况。
动物无疼痛和损伤，但由于动物之间相互摩擦、舔毛、尿、水浸渍被毛或脱毛，或因日久颜色自行消退，应及时发现，及时补染。
常用编号标记溶液有：①3%-5%苦味酸溶液，涂然橙黄色；②2%硝酸银溶液，涂染成咖啡色（涂后需光照10min）；③0.5%中性红或品红溶液，涂染成红色；④煤焦油酒精溶液，涂染成黑色；⑤龙胆紫溶液，涂染成紫色。
大鼠软骨细胞 免疫荧光鉴定
大鼠软骨细胞免疫荧光鉴定
大鼠软骨细胞免疫荧光鉴定是一种常用的实验技术，用于检测细胞中特定蛋白质的存在和定位。
在进行免疫荧光鉴定时，首先需要制备大鼠软骨组织切片或培养出的软骨细胞。
然后，通过特定的抗体结合荧光染料，可以标记出目标蛋白质的位置和分布情况。
在进行免疫荧光鉴定时，需要注意以下几个方面：
1. 样本制备，对于软骨组织切片，需要进行固定、脱水和包埋等处理；对于培养的软骨细胞，需要进行固定和渗透处理。
2. 抗体选择，选择特异性较好的一抗和二抗，确保对目标蛋白的识别和结合。
3. 染色处理，将标记有荧光染料的二抗加入样本中，使其与一抗结合，形成复合物。
4. 显微镜观察，使用荧光显微镜观察标记后的样本，观察目标蛋白在细胞内的分布情况和定位。
免疫荧光鉴定可以帮助研究人员了解大鼠软骨细胞中特定蛋白
质的表达和分布情况，从而深入研究细胞的功能和生物学过程。
这
项技术在生物医学研究、药物研发和疾病诊断中具有重要的应用意义。
通过免疫荧光鉴定，可以为研究人员提供关于大鼠软骨细胞的
重要信息，有助于揭示细胞内蛋白质的功能及相关疾病的发病机制。
因此，免疫荧光鉴定在生命科学领域中具有重要的研究意义和应用
前景。
一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法
一种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法小鼠滑膜细胞的分离及培养方法是研究小鼠滑膜细胞功能和生物学特性的重要步骤。
在本方法中，我们将展示一种经典的小鼠滑膜细胞分离和培养方法，旨在为研究者提供操作指南。
首先，我们需要准备所需材料和试剂，包括小鼠、PBS（磷酸盐缓冲液）、酶消化液（例如，胰酶和胰蛋白酶）、培养基（例如，DMEM/F12）和培养皿。
1. 小鼠的选择和准备:选择适龄、健康的小鼠，注意其性别和品系。
提前准备好所需的操作平台和相关仪器。
2. 小鼠滑膜细胞的分离:将小鼠以适当的方式进行麻醉和消毒。
在细菌培养箱中，通过剖腹取出小鼠的关节滑膜组织，尽量保持其完整性，并将其置于含有PBS的培养皿中。
3. 组织消化:将滑膜组织切碎并置于含有胰酶和胰蛋白酶的酶消化液中，在37°C的恒温振荡器中进行消化。
消化时间和酶的浓度应根据滑膜样本的大小和类型进行调整，通常需要2-4小时的消化时间。
4. 细胞分离:经过消化的滑膜组织将被过滤，以除去组织残渣和大颗粒物。
将过滤液收集到离心管中，进行离心，去除上清液。
沉淀的细胞可以通过重新悬浮和离心的方法进行重复洗涤，以进一步净化细胞。
5. 细胞培养:将净化后的小鼠滑膜细胞重新悬浮于预先准备好的培养基（例如DMEM/F12），添加适量的血清和生长因子。
将细胞转移至培养皿中，并放置在37°C的恒温培养箱中进行培养。
通过定期观察和更换培养基，维持适当的温度和湿度，小鼠滑膜细胞将逐渐形成单层，并开始增殖和扩增。
总结起来，这种小鼠滑膜细胞的分离及培养方法提供了一种简单有效的操作指南，可用于研究小鼠滑膜细胞的功能和特性。
它为进一步探究滑膜相关疾病的发生机制以及治疗方法的开发提供了基础。
大鼠前扣带回皮层吻侧部精确取样的方法
大鼠前扣带回皮层吻侧部精确取样的方法目的：自制大鼠脑组织取样模具，精确切取双侧大鼠前扣带皮层吻侧部。
方法：（1）自制动物脑组织精确取样模具；（2）在低温下将大鼠脑组织冠状切为脑组织片；（3）按照自制取材模具上的定位标识将已切好的大鼠脑片摆放好，逐步对组织段切割，最终可得到样本量较精确的大鼠前扣带皮层吻侧部样品。
之后即可进行该脑区的蛋白、核酸等其他方面的研究。
结果：实验中切取不同个体大鼠脑组织的部位和体积基本一致，不同动物个体取样差异小，实验结果可比性更强，且切取的组织大小不因操作者不同而异。
结论：自制大鼠前扣带皮层吻侧部精确取样模具的使用简便易行，取样部位、大小一致性好，方法经济可靠，使后续实验结果更准确；该方法可推广应用于大鼠其他脑区的取样或其他小动物脑组织的取样。
在神经系统相关的基础医学和临床医学研究实验中，用分子生物学方法检测目标脑区或核团的核酸水平或蛋白表达时，需要对该部位进行定位准确、取样大小一致地快速局部取材。
由于这些区域体积较小且在肉眼上不与周围组织有明显区分，实验者常规使用的估计取材的方法常常导致实际切取的组织大小、形状偏差较大，且易受受主观判断影响；不同动物个体间因操作者不同或取材时间不同而使样本之间取样的一致性较差，导致后续实验的结果误差偏大。
目前国内外已有可购买的取材模具大多是切取冠状或矢状切片模具，并不能精确到某一层面上具体核团或脑区切取，使上述问题不能得到很好解决。
本实验室近几年的工作主要集中在大鼠前扣带回皮层吻侧部（rostral anterior cingulate cortex，rACC）神经元参与痛情绪反应的相关研究[1-5]，需要在大鼠上进行脑rACC区手术置管局部给药、行为学实验，之后切取rACC区组织进行western blot实验[6-13]，研究该部位相关蛋白表达情况，因此准确切取大鼠rACC 区组织是研究的关键步骤。
结合笔者在实验中的使用经验，在不影响实验规范性的前提下，自制了用于rACC区精确取材的模具，并设计了针对使用该模具的取材步骤，使实验更加简便、容易操作，取材范围更加精确且大小统一，在不增加大量实验成本的前提下就能提高实验结果准确性。
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大鼠软骨切取方法：
脱颈处死，用碘酒消毒四肢皮肤，在无菌操作下，于股骨髁上
5cm处截取股骨，于胫骨平台下3mm截取胫骨，小心取下膝关节，去
除周围软组织：附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜，离断髌韧带、
内外侧副韧带及前后交叉韧带，剪开髌骨两侧键膜，将髌骨向下翻转，
打开膝关节，手术刀削取关节软骨组织，用15#解剖刀片充分利用软
骨的弹性，削下每个关节表面的软骨，不要误带软骨下骨和骨膜。
大鼠滑膜切取方法：
将大鼠浸泡于10 %强力消毒冷溶液中10 分钟, 在超净工作台,
仰位固定,常规碘酒、酒精消毒术野。沿膝关节正中纵行切开皮肤直
至暴露出以膝关节为中心约3cm ×3cm 的区域, 以有齿镊提起髌骨。
沿髌骨上缘约013 ～014cm 处向下切割直至股骨, 再分别沿髌骨两
侧向下分离至胫骨, 此时即打开了膝关节腔, 可见由髌骨下缘向上
延缓有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织。完整剥离滑膜组织, 最后
以眼科镊轻轻夹住其游离端, 用刀片完整切下, 用福尔马林固定,
包埋, 切片, 留待病理检测。
大鼠称重,腹腔注射10%氯胺酮0. 1 ml/100 g麻醉,仰位固定,沿左侧
后腿膝关节正中纵行切开皮肤,直至暴露出以膝关节为中心约3cm ×
3 cm的区域,沿膑骨上沿约0. 3～0. 4 cm处向下切割直至膑骨,再分
别沿膑骨两侧向下分离至胫骨,此时即打开了膝关节腔,可见由膑骨
下极向下延续有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。用眼科直镊钝
性分离关节囊的滑膜层和纤维层,完整剥离滑膜组织,最后以眼科镊
轻轻夹住其中央,用眼科剪完整剪下,置10%的中性甲醛中固定[ 2 ] 。
固定24 h
后,石蜡包埋,苏木精- 伊红染色。