尖峰岭抗逆性根瘤菌的筛选及其16S rDNA序列的测定

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森林根际土壤细菌的分离、鉴定及生物活性筛选

森林根际土壤细菌的分离、鉴定及生物活性筛选冯路遥;赵江源;施竹凤;莫艳芳;杨童雨;申云鑫;何飞飞;李铭刚;杨佩文【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2024(40)1【摘要】【目的】从无量山国家级自然保护区森林根际土壤发掘具有多种生物活性的功能菌株,探究其开发应用潜力。

【方法】采集无量山地区25个区域植物的根际土壤,采用选择培养基,分离鉴定磷酸盐溶解、固氮、溶锌和拮抗等活性菌株,进一步测定菌株分泌铁载体、ACC脱氨酶和吲哚乙酸等生物活性,并验证促番茄种子发芽和生长效果。

【结果】分离鉴定得到解磷菌70株,固氮菌27株,解钾菌8株,拮抗镰刀菌的菌株51株。

其中,YIM B08401和YIM B08402形态学结合生理生化特性和16S rDNA序列测序,鉴定为白色伯克霍尔德氏菌(Burkholderia alba)和青岛假单胞菌(Pseudomonas qingdaonensis),两个菌株均具有磷酸盐溶解、固氮、溶锌和分泌铁载体的活性,最大可溶性磷含量为(455.63±59.65)mg/L和(878.95±64.78)mg/L;两株菌的促种子发2芽试验结果接近,施加稀释10倍、10倍和310倍的发酵上清液后,发芽率都维持在82%-93%,明显高于对照组的56%和49%,施加菌株发酵液的处理组相较于空白对照组的长度都有显著增加。

盆栽实验证明,两株菌株促生效果最明显的处理组在地上部长度、鲜重、干重、茎粗、根长、根鲜重、根干重方面的数据都显著优于对照组,YIM B08401的上述指标相对于对照组分别显著增加了89%、495%、268%、62%、53%、385%和469%,YIMB08402的上述指标相对于对照组分别显著增加了118%、528%、477%、55%、37%、413%和747%。

此外,菌株YIM B08401还具有拮抗病原菌和分泌ACC脱氨酶活性,YIM B08402则还具有分泌吲哚乙酸的活性。

一株高效解钾菌的筛选鉴定及其对烟草吸收钾磷的影响

一株高效解钾菌的筛选鉴定及其对烟草吸收钾磷的影响钾是植物生长发育过程中必需的微量元素之一，对于植物的生长和发育具有重要的作用。

土壤中有效的钾资源有限，且大多存在于难以被植物吸收的形态，因此需要通过钾肥的施用来满足植物对钾的需求。

钾肥的施用不仅增加了农业生产的成本，还造成了环境污染和资源浪费。

寻找一株高效解钾的细菌，并利用该菌株来促进烟草吸收钾磷是非常有意义的研究方向。

高效解钾菌的筛选与鉴定是一个关键的步骤。

可以从钾贫瘠土壤中采集土样，然后通过稀释平板法、固体培养基筛选法和液体培养基筛选法等方法进行菌株的筛选。

对于菌株的鉴定，可以通过形态特征观察、生理生化特性检测和分子生物学方法等手段来进行。

形态特征观察包括菌落形态、形状、颜色等方面的观察；生理生化特性检测包括对碳源、氮源和抗生素的利用情况等的检测；分子生物学方法主要是利用16S rDNA序列分析来确定菌株的分类地位。

高效解钾菌可通过多种机制促进植物对钾的吸收。

菌株可以分泌有机酸、酶和可溶性物质，降低土壤pH值，溶解土壤中难溶性的矿物质，使其中的钾离子释放出来，增加了植物根系对钾的吸收。

菌株还可以合成植物生长激素，如吲哚-3-乙酸、赤霉素等，促进植物生长和根系发育，进一步增强了植物对钾的吸收。

菌株还能够形成菌根共生关系，与植物根系形成共生菌根，在菌根附近形成一个较低的氧浓度区域，促进根系吸收的效果。

对于烟草来说，高效解钾菌的应用可以提高其吸收钾磷的效果。

烟草是一种常见的经济作物，对钾的需求较大。

通过施用高效解钾菌，可以提高土壤中钾的有效性，增加烟草根系对钾的吸收。

高效解钾菌能够促进烟草生长，增加其产量和品质。

烟草在吸收钾的对磷的吸收也有促进作用。

研究表明，高效解钾菌能够分解土壤中的有机磷，将其转化为可供植物吸收的无机磷，提高磷素的利用效率。

高效解钾菌的筛选鉴定以及其对烟草吸收钾磷的影响具有重要的研究价值。

通过寻找高效解钾菌并应用于农业生产中可以提高植物对钾的吸收效果，减少钾肥的施用量，降低环境污染，达到可持续发展的目标。

根际细菌分离纯化及鉴定实验方案

根际土壤细菌分离纯化及鉴定实验方案一、方法：稀释涂布分离法二、培养基：1、GPM 培养基(Glucose Peptone Meat extract Agar)2、牛肉膏蛋白胨培养基（NB ）3、金氏培养基B （King ）4、CSEA 培养基(Cold extracted soil extract agar)5、YG6、NA7、无氮培养基8、分解纤维素菌筛选培养基9、TSA 培养基三、实验流程梯度稀释涂板分离挑取不同的单菌落于斜面培养液体培养及液体保种提取DNAPCR 扩增酶切带型分型确定操作单元连接转化克隆子挑选及PCR 鉴定测序序列拼接建树采集根际土壤样品四、具体实验方案1、采集根际土壤样品：将植株根系及附着的根际土壤一同装入无菌袋带回实验室。

2、土壤样品稀释及选择合适浓度梯度进行涂板分离：梯度稀释土壤样品，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六个梯度涂板，每个浓度梯度涂3个平行，过后放于37℃培养箱中培养1-2d观察菌落生长情况。

选择合适的浓度平板，根据形态、大小、颜色，挑取不同菌株的典型单个菌落，达到分离纯化的目的。

3、挑取不同单菌落于斜面保种：通过上述的分离纯化步骤，可筛选得到不同的菌株，对筛选到的菌株接种于斜面放于37℃培养箱中培养。

最后斜面放于4℃冰箱保存，备用。

4、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于相应的液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min，37℃）培养。

过后吸取菌液与灭过菌的甘油按7:3的比例于1.5ml灭过菌的EP管中放于-20℃保种。

剩下的菌液用于以下实验。

5、提取DNA（CTAB法）：（1）取1.5ml菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。

（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。

（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），混匀，于55℃温育1h。

（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl溶液，混合后再65℃温育30min。

花生根际产IAA菌的筛选鉴定及其效应研究

花生根际产IAA菌的筛选鉴定及其效应研究张东艳;刘晔;吴越;王国文;万兵兵;姜瑛【摘要】植物根际产IAA菌能够分泌吲哚乙酸(IAA)促进生长,提高作物产量.为从砂质潮土中的花生根际筛选高产IAA的根际促生菌,本研究首先从长势较好的花生根际筛选出单株菌落,对其分泌IAA能力进行定性和定量分析,并通过16S rDNA基因序列配合生理生化特征鉴定所筛选的高产IAA菌株,然后设置单因素试验,探究适宜菌株生长和发酵的条件,最后通过花生盆栽试验验证其促生能力.结果表明,共筛选出5株产IAA的促生菌菌株,其中菌株HS10的IAA产量最高,被鉴定为特基拉芽孢杆菌.单因素试验表明,HS10最适培养条件是培养温度30℃,时间20 h,初始pH 8,装液量25 mL/250 mL,碳源为果糖,氮源为硝酸钾.盆栽试验表明,接菌花生植株长势明显优于对照,HS10对花生具有良好的促生效应.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2016(038)001【总页数】7页(P104-110)【关键词】花生;根际产IAA菌;吲哚乙酸;砂质潮土;盆栽试验;特基拉芽孢杆菌【作者】张东艳;刘晔;吴越;王国文;万兵兵;姜瑛【作者单位】河南农业大学资源与环境学院,河南郑州,450002;西南大学资源环境学院,重庆,400715;河南农业大学资源与环境学院,河南郑州,450002;山东省土壤肥料总站,山东济南,250100;河南农业大学资源与环境学院,河南郑州,450002;河南农业大学资源与环境学院,河南郑州,450002;河南农业大学资源与环境学院,河南郑州,450002【正文语种】中文【中图分类】S154.39现代农业大量使用农药和化肥来提高农作物产量，不仅增加了成本，也对环境造成了极大的危害，这促使了更多的科学工作者积极探索应用微生物来替代或部分替代农药和化肥的增产效应。

植物根际促生菌[1](plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)具有固氮、溶磷、溶铁、产生植物激素，以及提高植物抗逆性等多种促生效应。

2021人参根际土壤拮抗性放线菌的筛选、分离和鉴定范文1

2021人参根际土壤拮抗性放线菌的筛选、分离和鉴定范文人参为五加科人参属多年生宿根性植物，是我国传统名贵中草药，有“百草之王”的美誉。

人参主要分布于东三省，其中，吉林省长白山区是人参的主产区，产量达全国总产量的70%-80%。

人参病害是影响人参产量与质量的一个重要因素。

目前，在人参中发现的侵染性和非侵染性病害有 50 余种，我国已报道的有 30 余种。

其中，立枯病、黑斑病、锈腐病、根腐病、疫病、菌核病及灰霉病是人参 7种主要真菌性病害。

常年发病率在 10%-30%，严重时达到 60%-70%，甚至绝收。

目前，对人参病害防控主要依靠化学农药。

化学农药防治人参病害虽然是很有效的方法，但是，长期使用化学农药不仅导致农药残留和环境污染，并且易诱导病原微生物产生抗药性。

开发环境友好的生防制剂成为替代化学农药的重要措施。

生物防治是以生态学原理为基础，利用生物物种间的相互作用，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物。

生物防治最大的优点是不污染环境，无农药残留，这是化学农药等非生物防治措施无法比拟的。

利用拮抗微生物防治病原微生物是生物防治技术的重要组成部分。

放线菌因其来源广泛，代谢产物活性较高等引起广泛关注，其拮抗机制和作用主要有抗生作用、竞争作用和重寄生作用。

放线菌能够产生抗生素、有机酸、甾体化合物及酶的抑制剂等多种生物活性物质，对植物病害产生抑制或杀灭作用。

目前，在人参生产中，使用的放线菌生防制剂还较少，而且均来源于农作物，无人参专用生防制剂。

为此，本研究对人参进行根际土壤拮抗性放线菌的筛选、分离和鉴定研究，旨在为开发人参专用放线菌制剂提供科学依据。

1、材料与方法 1.1材料 1.1.1供试病原菌引起人参的根腐病、锈腐病、疫病、菌核病、灰霉病、黑斑病和立枯病的主要病原真菌，分别是腐皮镰孢菌（Fusarium solani）、毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、恶疫霉菌（Phytophthora cactorum）、人参核盘菌（Sclerotiniaginseng）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）人参链格孢菌（Alternaria panax）、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani），均由吉林农业大学农学院植物病理教研室提供。

巨菌草根部促生菌的筛选及其促生效应

巨菌草根部促生菌的筛选及其促生效应作者：邓振山陈凯凯李静刘显春张宝宝张宝成来源：《广西植物》2020年第09期摘要：为进一步开发植物促生菌，该研究以巨菌草根部为主要材料进行巨菌草促生菌的筛选，采用解磷、固氮和产IAA等筛选标准对初筛菌株分别进行多项促生能力的测定。

通过形态观察、生理生化特性和 16S rDNA序列同源性分析对促生效果最好的菌株YB-07进行分类和鉴定，分别测定其促生能力后从中筛选出促生效应强的11个菌株进行盆栽试验，并通过对这些菌株单独回接和多菌混接的小麦盆栽试验测定其对小麦的促生效应。

结果表明：从巨菌草根部分离得到了101株促生菌株，分类鉴定结果显示菌株YB-07归属于根瘤菌属（Rhizobium），其溶磷量为20.1 mg·L-1、产IAA量为23.7 mg·L-1，同时具有产氨能力。

盆栽试验测定结果显示，多菌混合接种对小麦的促生效应在株高、干重、鲜重和叶绿素含量上，分别较对照组增加了24.49%、31.84%、28.06%和34.14%。

单菌接种对小麦的促生表现在株高、干重、鲜重和叶绿素含量上，分别较对照组增加了13.54%、20.45%、16.84%和35.19%。

所筛选到的菌株具有良好的促生长作用，能为进一步构建巨菌草促生菌菌群提供良好的种质资源。

关键词：巨菌草，促生菌，筛选，促生效应，盆栽试验中图分类号：Q939.95文献标识码：A文章编号：1000-3142（2020）09-1323-09Abstract：In this study，the root of the Pennisetum sinese was used as the main research material，screening of growth-promoting strains from P. sinese，and explore the growth-promoting effects of growth-promoting strains. We used the following screening criteria for the determination of multiple growth-promoting capacities of primary strains：the ability to solubilize phosphorus，the ability to fix nitrogen，the ability to produce IAA. The strain YB-07 with the best growth-promoting effect was classified and identified through physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence homology analysis. Eleven strains with better overall performance were screened out and used for a pot experiment with a single inoculation and multi-microbe mixed inoculation to determine its growth-promoting effect. A total of 101 strains were isolated from the roots of the P. sinese，and the growth-promoting ability was measured. Among them，the strain with excellent overall performance was YB-07，which had a phosphorus content of 20.1 mg·L-1，an IAA yield of 23.7mg·L-1，and an ability to produce ammonia at the same time. The results of pot experiment showed that the effect of multi-microbe mixed inoculation on wheat growth increased by 24.49%，31.84%，28.06% and 34.14% in the height，dry weight，fresh weight and chlorophyll content，respectively. Single bacterium inoculation increased the plant height，dry weight，fresh weight，and chlorophyll content by 13.54%，20.45%，16.84% and 35.19%，respectively，compared with the control group. The selected strain has good growth-promoting effect，can provide a good seed resources for the further construction of the P. sinese flora promoting bacteria.Key words：Pennisetum sinese，promoting bacteria，screening，growth-promoting effect，pot experiment巨菌草（Pennisetum sinese）隸属于禾本科狼尾草属，多年生，适宜在热带、亚热带、温带生长和人工栽培。

从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌DNA的方法_cropped

为TIR 区的自由能绝对值每增加114kcal/ m ol , 基因的翻译起始率即会下降10 %6 。

但是TIR 的范围尚无明确定义, G anoz a 认为应包括起始密码子上下游70 个核苷酸的范围7, 考虑到本研究中起始密码子上游的序列为载体序列, 已经过优化, 我们将重点放在ATG 下游的序列, 并将调整范围延长到60 (即20 个氨基酸) 个核苷酸。

同时我们也考虑到密码子的偏好性, 大肠杆菌稀有密码子的存在会造成很多严重后果: mRNA 的半衰期降低, 翻译提前终止, 和移框突变等8 。

综上所述, 我们在降低G C 含量的同时, 尽量采用大肠杆菌偏好的密码子。

本研究中菌株N o16 的自由能与原始序列相同且较前5 种序列为低, 但表达量在所有序列中位居第二, 与计算机的预测结果并不完全一致, 可能是由于TIR 内部的碱基有因可能与外部的碱基发生配对, 形成更大范围的二级结构, 超出了计算机的分析范围,此人为地适当延长TIR 范围可以增加预测的可靠性。

参考文献1 Rex G , S urin B , Besse G , et al1 J Biol Chem , 1994 , 269 (27) : 8118～812712 Fujita M S , N om ura K C , H ong K G , et al1 Biochem Biophys Res C ommun , 1993 , 197 (3) : 1340～134713 刘北域, 官孝群, 宋后燕1 上海医科大学学报, 1999 , 26 (6) : 401～40414 张淑梅, 张云湖, 赵晓祥, 等1 中国生物化学与分子生物学报, 1999 , 15 (6) : 912～91515 Barrick D , V illanueba K , Childs J , et al1 Nucleic Acids Research , 1994 , 22 (7) : 1287～129516 de Smit M H ,van Duin J 1 Pr oc N atl A cad Sci , 1990 , 87 (19) : 7668～767217 G anoz a M C , K of o id E C , Marliere P ,et al1 Nucleic A cids Res , 1987 , 15 (1) : 345～3601Andersson S G , K urland C G1 Micr obiol Rev , 1990 , 54 (2) : 198～21018从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌D N A 的方法3强1 ,2张小平1 3 3李登煜1陈文新2K1Lindstrm3 Z1Terefework3陈( 四川农业大学农学院微生物学系雅安625000) 1( 中国农业大学生物学院微生物学系北京100094) 2( Department of Applied Chemistry and Microbiology , University o f Helsinki , Finland 00014) 3摘要: 豆科植物的新鲜根瘤经表面灭菌、破碎后直接加入200μL 4m ol/ L 异硫氰酸胍( G UTC)裂解液混匀, 离心去掉根瘤残留物, 再加入适量R NA 酶, 37 ℃温育30min 后, 加入20μL 硅藻土吸附液, 室温处理15min 离心去掉上清, 沉淀经G UTC 裂解液二次处理, 再分别用洗涤液、70 %酒精洗涤。

人参根际拮抗细菌RS—3的鉴定及其对人参常见病原菌的抑制作用

人参根际拮抗细菌RS—3的鉴定及其对人参常见病原菌的抑制作用从吉林健康人参根中筛选到一株广谱根际菌RS-3。

经形态学特征及16SrDNA 序列同源性分析，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。

平板对峙实验及带毒平板法鉴定，该菌株对常见的5种人参病原菌有一定的拮抗作用，对灰霉病菌的抑菌率达54.4%。

说明根际细菌RS-3可作为人参常见病害的潜在广谱生防菌进一步开发利用。

标签：人参；根际细菌；抑菌活性[Abstract] A rhizobacteria strain named RS-3 exhibited inhibitory activity against all five Panax ginseng pathogens was isolated from the root of P. ginseng. This strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on its morphological character and 16S rDNA sequence. Antagonistic activity experiments indicated that the strain could strongly suppress Botrytis cinerea Pers with an inhibitory rate of 54.4%，suggesting the potentialities of biocontrol agent against diseases that frequently happen on ginseng.[Key words] Panax ginseng；rhizobacteria；antibacterial activitydoi：10.4268/cjcmm20162413人参Panax ginseng C. A. Mey为五加科人参属多年生草本植物，主要分布于东北吉林、辽宁、黑龙江等地区。

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ｆｒａｌｔｅ９ｉｏａｅ０ｌｈｓｌｔｓ．ｂｔｔｅｔｍｐｅａｕｅｒａｉｄ，ｔｅｏｔｌｇｏｈｔｍｐｒｔｒｒＣＡＦ２Ｓ３ｏ，ｆｒｕｈｅｒｔｒｓａｅｖｒｅｈｐｉｒｗｔｅｅａｕｅｆｍａｏ ’ ４ｉ７Ｃ２ｏ
ｉｉｎｅｇｉｇＲｅｅｖｎｈ６ＤＮＡｔｒｎｔｏｎＪａｆｎｌｓｒｅａｄｔｅ１ｒｎＳＤｅｅｍｉａｉｎ
ＰＥＮＧｕｈｎＹ — ｏｇ，ＪＡＯ－ｈｎ，ＭＯＵｎｔｏＩＲｕｚｅＸｉ—ａ
关键词：尖峰岭；耐盐性试验；Ｈ范围；ｐ抗逆性；６Ｎ１ＳｒＡ序列；Ｄ热带根瘤菌
中图分类号：７１ｓ１文献标识码：Ａ
ＡｅｉｉｒｕｄｎＳｒｅｎｖｒｉｙＲｅｉｔｎｃｆＲｈｚｂｕＳｒｉｓＰｒｌｎａｙＳｔｙｏｃｅｎｉｇＡｄｅｓｔｓｓａｅｏｉｏｉｍｔａｎｍ
彭玉红焦如珍，牟新涛，一
（．１中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，北京
２．中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究 Байду номын сангаас ，京北
１０９；００１
１０９）００１
摘要：了探讨木本豆科植物根瘤菌对不良环境的抵抗能力，为对分离白海南尖峰岭国家自然保护区的９株根瘤菌进
行了初步研究。结果发现：根瘤菌最适生长ｐ９株Ｈ值均为７，适ＮＣ含量均为１．ｋ～；株ＣＦ２最ａ１００ｇ・ｇ菌Ａ２４的最
适生长温度为３７℃ ，菌株ＣＦ１、Ａ４８和ＣＦ７Ａ４６ＣＦ３Ａ２９的最适温度为２０～２８℃ ，其余５株为２８℃。９株根瘤菌均可在ｐＨ值４～１、ａ１００ｇ・ｇ３１ＮＣ．ｋ～、７℃条件下生长，中ＣＦ２２其Ａ２４和ＣＦ７Ａ２６菌株耐受ｐＨ值３Ａ２６可以；ＣＦ２在４．ｋＮＣ培养基中生长；Ａ２６可耐受２ｎ５００ｇ・ｇａ１ＣＦ７０ｍｉ０℃、０ｍｎ６１ｉ０℃高温。不同宿主、不同生态条件下的
根瘤菌株具有不同的抗逆性，过综合分析，选出４株高抗菌株（Ａ２６ＣＦ７、Ａ２４ＣＦ１）１ＳｒＮ通筛ＣＦ２、Ａ２６ＣＦ２、Ａ４４。６ＤＡ
序列系统发育分析表明：９菌株在系统进化树上与Ｇｎａｋ中序列号为Ｅ０４８ｅＢｎＦ５８９的Ｒｉｂｕｏｉｌｎ２热ｈｚｉｍｔｐｃＣｏｅＨ１（ｏｒｉ带根瘤菌）聚为一族，相似度为９．％，９４初步确定９株根瘤菌为热带根瘤菌。
ｎｄｌｓｏｉｅｅｔｌｇｍｅｐａｔｉｈｉｎｅｇｉｇＮｔｎｌＮａｕｅＲｅｅｖ，ＨａｎｎＰｏｉｃｏｕｅｆｄｆｒｎｅｆｕｌｎｓｎｔｅＪａｆｎｌａｉａｔｒｓｒｅｎｏｉａｒｖｎｅ，ｗｒｒｌｎｒｅｅｐｅｉａｙｍｉ
ｓｕｉｄＲｅｕｔｈｗｈｔｔｐｉｌｐＨｎＣ１ｃｎｅｔａｉｎｆｒｇｏｈａｅｒｓｅｔｖｌｎ０． ‘ｋｔｄｅ．ｓｌｓｏｔａｈｅｏｔｍａｓａｄＮａｏｃｎｒｔｏｒｗｔｒｅｐｃｉｅｙ７ａｄ１０ｇｏｇ一
Ａｂｓｒｃ：ｎｒｅｏｄｎｉｙｔｅｒｓｓａｃｂｌｉｓｏｏｙｅｕｔａｔＩｏｄｒｔｉｅｔｆｈｅｉｔｎｅａｉｉｅｆｗｏｄＬｇｍｅＲｈｉｏｉｍ，９ｔａｎｓｌｔｄｆｏｔｚｂｕｓｒｉｓｉｏａｅｒｍｒｏｓｏｔ
林业科学研究
ＦｏｅｔＲｅｅｃｒｓｓａｒｈ
２１２（）５０～５６００，３４：３３
文章编号：０１１９（０００－５０７１０ — ８２１）４０３－４０
尖峰岭抗逆性根瘤菌的筛选及其１ｒＮＤＡ序列的测定６Ｓ
（．Ｒｓａｃｓｔｔｆｏｅｔ，Ｃｉｓｃｄｍｆｏｅｔ；ＫｙＬｂｒｔｒｏｒｅＢｅｄｎｎｕｔａｉ，１ｅｅｒｈＩｔｕｅｏｒｓｙｈｎｅＡａｅｙｏｒｓｙｅａｏａｙｆｅｒｅｉｇａｄＣｌｖｔｎｎｉＦｒｅＦｒｏＴｉｏＳｔＦｒｓｙＡｍｉｉｒｔｎ，ｅｉ１０９，Ｃｉａ２ｅｅｒｈＩｓｔｔｏｏｓＥｏｇ，ｎｉｎｎｄＰｏｃｉｔｅｏｅｔｄｎｓａｉＢｉｎａｒｔｏｊｇ００１ｈｎ；．ＲｓａｎｔｕｅｆｒｔｃｌｙＥｖｒｍｅｔｒｔｔｎｃｉＦｅｏｏｎａｅｏＣｉｓＡａｅｙｏｏｓｙｅｉｇ１０９，Ｃｉａｈｎｅｃｄｍｆｒｔ，Ｂｉｎ００１ｈ）ｅＦｅｒｊｎ