固定化窖泥功能微生物电镜表征观察及连续产酸性能的研究

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基于新老窖泥的微生物菌群结构判定浓香型白酒生产中的主体己酸菌

基于新老窖泥的微生物菌群结构判定浓香型白酒生产中的主体己酸菌任聪;辜杨;杜海;徐岩【摘要】对新、老窖泥的微生物菌群结构和进化关系,及其与酒醅发酵过程中己酸、丁酸产生的相关性进行了分析,发现窖泥中主体己酸菌为梭菌纲下的己酸菌属微生物,该属下的3种己酸菌在窖泥中均有发现,且以乳酸利用型己酸菌为主体;而通常被认为是窖泥中主体己酸菌的梭菌纲梭菌属微生物克氏梭菌在新老窖泥中的丰度均较低.该研究对浓香型白酒酿造窖泥中的己酸菌类型进行了初步的解析,相关分析方法与结果将为研究窖泥中己酸菌的酿造功能及应用价值奠定基础.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)012【总页数】7页(P8-14)【关键词】己酸菌;窖泥;浓香型白酒【作者】任聪;辜杨;杜海;徐岩【作者单位】江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,酿酒科学与酶技术研究中心,江苏无锡,214112;江南大学,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡,214112;江南大学,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文浓香型白酒是中国三大基本香型白酒(浓香型、清香型和酱香型)之一，其酿造特征被总结为“千年老窖万年糟”“以窖养糟,以糟养泥”等俗语，这些经验总结是古人酿造智慧的集中体现。

生产上历来对窖泥品质给予了高度的关注，尤其重视以己酸菌(产己酸细菌的统称)为代表的挥发性风味物质产生的细菌。

近年来，随着微生物生态学与微生物组学的发展，相关技术手段的发展使窖泥中蕴含的厌氧微生物科学奥秘能逐步得以剖析。

丝瓜布固定化米根霉发酵生产L-乳酸

丝瓜布固定化米根霉发酵生产L-乳酸
付珊珊;魏顺安;王珍;王远亮
【期刊名称】《重庆大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】2006(29)10
【摘要】L-乳酸因其为生产绿色化学材料聚L-乳酸的原料而倍受重视．文中以米根霉As3．6462为菌种，玉米淀粉为原料，研究了用吸附固定米根霉发酵L等L 酸．结果表明，相对聚乙烯醇、棉布，丝瓜布有更好的固定化效果．实验条件下，载体边长在8—10mm，载体用量为15mL／50mL种子培养基，玉米淀粉发酵L-乳酸产量为72—83g/L，连续发酵4批后产量基本稳定．丝瓜布固定化米根霉发酵L看L酸有良好的工业的应用前景．
【总页数】4页(P114-117)
【关键词】L-乳酸;米根霉;固定化
【作者】付珊珊;魏顺安;王珍;王远亮
【作者单位】重庆大学化学化工学院;重庆大学生物材料与生物工程研究中心【正文语种】中文
【中图分类】TQ920.1
【相关文献】
1.固定化米根霉发酵生产L-乳酸产酸速率的研究 [J], 姜绍通;陆香庆;郑志;朱羽
2.无载体固定化米根霉发酵生产L-乳酸工艺的优化 [J], 朱羽;姜绍通;杜威;呙军;吴曼曼
3.用于固定化米根霉发酵生产L-乳酸的转盘反应器及其放大 [J], 张定丰;林建平;金志华;岑沛霖
4.无载体固定化米根霉重复间歇发酵生产L-乳酸 [J], 姜绍通;郑志;朱羽;吴学凤;潘丽军;罗水忠;杜威
5.米根霉无载体固定化发酵产L-乳酸 [J], 陈晓佩;张丽;顾夕梅;李鑫;勇强;余世袁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

凝固型牦牛乳酸奶超微结构观察与分析

凝固型牦牛乳酸奶超微结构观察与分析冶成君【摘要】为了观察和分析凝固型牦牛乳酸奶的超微结构和测定其相关宏观物理性质，利用扫描电镜观察和分析了凝固型牦牛乳酸奶的超微结构，用表观粘度、持水力和脱水收缩作用的敏感性3种测定方法，与凝固型普通乳酸奶进行了对比。

结果表明：凝固型牦牛乳酸奶的超微结构是一种纤维网状结构，该网状结构比凝固型普通乳酸奶更致密、宽厚且孔隙小，一般分布在2～13μm，酪蛋白支架间有丝状物相连接，并且凝固型牦牛乳酸奶的表观粘度、持水力和脱水收缩作用的敏感性大大优于凝固型普通乳酸奶，有利于酸奶保持更好品质。

%In order to observe and analyze the ultrastructure of coagulated yak yogurt and to deter-mine its macroscopic physical properties .Scanning electron microscope ( SEM) was used to observed and analyze the ultrastructure .Apparentviscosity ,water holding capacity and suscepibility to synere-sis were measured .Compared with coagulated cow yogurt ,the ultrastructure of yak yogurt presented a fiber network structure and the net structure is denser ,heavier,with smaller pores than that of cow yogurt.The pores are between 2μm and13μm.Having the filaments connect between casein brack -et makes the apparent viscosity ,water holding capacity and suscepibility to syneresis of yak yogurt superior than that of cowyogurt ,chich helps yak yogurt in a good quality.【期刊名称】《青海大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P96-100)【关键词】牦牛乳;凝固型酸奶;扫描电镜;超微结构【作者】冶成君【作者单位】青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁 810016【正文语种】中文【中图分类】S879.1凝固型酸奶的凝胶体是否稳定，在贮运过程中是否易破碎，都与酸奶的凝胶体结构有密切关系。

泸州古酿酒窖池中两株产甲烷杆菌比较研究

应用与环境生物学报 2010，16 ( 6 ): 840~844Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2010-12-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00840泸州老窖古酿酒窖池群是全国重点文物保护单位，自公元1573年开始酿造浓香型曲酒一直延续至今. 浓香型曲酒的主体香成分——己酸乙酯由窖内多种微生物作用生成，其前体物则来源于窖泥中的己酸发酵. 北原觉雄研究巴氏梭菌除转变乙醇为己酸和少量丁酸外，还生成CH 4和H 2，以后发现该菌并非纯种，但因此认识到己酸发酵和甲烷发酵存在一定关系[1]. 泸州老窖古酿酒窖池中，多种厌氧细菌类群参与曲酒发酵生香，其中己酸菌具有特别重要的生产性能. 上世纪80年代首次从泸州老窖泥中分离出氢营养型的布氏甲烷杆菌CS 菌株，揭示了酿酒窖池是产甲烷古菌存在的又一生态系统[2]. 随后发现该菌和从老窖泥中分离的己酸菌——泸酒梭菌菌株存在“种间氢转移”互营共生关系，混合培养时可较大程度提高己酸产量. 以后将CS 菌株应用于酿酒工业，与己酸菌共同促进新窖老熟，有效提高酒质[3]. 因此，窖泥中栖息的产甲烷古菌既是生香功能菌，又是标志老窖生产性能的指示菌.最近我们在对泸州古酿酒窖池微生物研究中，观察到窖泥中的产甲烷古菌在形态特征、营养类群和生理特性上表现出多样性，并分离到部份菌株. 本文报道其中两株产甲烷杆菌0372-D1和0072-D2菌株的比较研究结果. 值得一提的泸州古酿酒窖池中两株产甲烷杆菌比较研究王俪鲆1, 4 张良2 刘来雁3 张宿义2 许德富2 刘光烨1*（1中国科学院成都生物研究所成都 610041）（2泸州老窖股份有限公司泸州 646000）（3农业部沼气科学研究所，农业部能源微生物与利用重点开放实验室成都 610041）（4中国科学院研究生院北京 100049）Comparative Study of Two Methanobacterium Strains in the Ancient FermentationPits of LuzhouWANG Liping 1, 4, ZHANG Liang 2, LIU Laiyan 3, ZHANG Suyi 2, XU Defu 2 & LIU Guangye 1*(1Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences , Chengdu 610041, China)(2Luzhoulaojiao Co., Ltd., Luzhou 646000, Sichuan, China)(3Biogas Institute of Ministry of Agricultural, Key Laboratory of Energy Microbiology and Application, Ministry of Agriculture , Chengdu 610041, China)(4Graduate University of Chinese Academy of Sciences , Beijing 100049, China)Abstract Two strains of Methanobacterium , named as 0372-D1 and 0072-D2, were isolated from the ancient fermentation pits of Luzhoulaojiao by using the Hungate anaerobic techniques. The cells of 0372-D1 are long rod, slightly curved, both ends neatly and nonmotile, which may form long chains by some cells. However, they are dif ﬁ cult to form colony in the solid medium. This strain utilizes only H 2+CO 2 to produce methane. Strain 0072-D2 is curved in rod-shape, light yellow and forms round colonies, and it utilizes formate or H 2+CO 2 as its sole carbon source for growth. The optimal growth temperature of two strains was found at 35 ℃. The optimal growth pH of strain 0372-D1 was 6.5~7.0 and its growth pH ranged from 5.0 to 8.0, and the optimal growth pH of strain 0072-D2 occurred at pH 7.5. The double time was 19 h for 0372-D1 and 8 h for 0072-D2 when cultured under the optimal conditions. The result from the analysis of their morphological and physicobiochemical characteristics and homology of the 16S rDNA gene sequences demonstrated that strain 0372-D1 would be a novel species of Methanobacterium , and strain 0072-D2 belonged to M. formicicum with the highest similarity of 99% in 16S rDNA gene sequence. Fig 6, Tab 1, Ref 16Keywords methanogen; Methanobacterium ; comparative study; new strain isolation; pit mud; 16S rDNA sequence;phylogenetic analysis; LuzhoulaojiaoCLC Q939.97 : TQ92摘要采用厌氧操作技术，从泸州老窖古酿酒窖池窖泥中分离到两株产甲烷杆菌0372-D1和0072-D2. 0372-D1菌体形态为长杆状，略弯，两端整齐，不运动，可由多个菌体形成长链；在固体培养基中难以长出菌落，只利用H 2+CO 2产生甲烷. 0072-D2菌体形态为弯曲杆状，淡黄色圆形菌落，利用H 2+CO 2或甲酸盐作为唯一碳源生长. 两株菌最适生长温度均为35 ℃、菌株0372-D1最适生长pH 为6.5~7.0，生长pH 范围5.0~8.0；菌株0072-D2最适生长pH 则为7.5. 在各自最适条件下培养，两株菌的最短增代时间分别为19 h 和8 h. 通过形态、生理生化特征和16S rDNA 序列的同源性分析，表明菌株0372-D1为产甲烷杆菌属的一个新种. 0072-D2则为甲酸甲烷杆菌（Methanobacterium formicicum ）的新菌株，相似性为99%. 图6 表1 参16关键词产甲烷菌；比较研究；新种分离；窖泥；16S rDNA 序列；系统发育分析；泸州老窖CLC Q939.97 : TQ92收稿日期：2010-03-02 接受日期：2010-04-29*通讯作者 Corresponding author (E-mail: liugy@)8416 期王俪鲆等：泸州古酿酒窖池中两株产甲烷杆菌比较研究是，菌株0372-D1具有耐酸的特性，对其进行的多相分类研究表明该菌可能为产甲烷杆菌属（Methanobacterium ）的一个新种.1 材料与方法1.1 样品窖泥样品采自泸州老窖明代古酿酒窖池，密封低温保存.1.2 富集、分离和纯化1.2.1 培养基富集培养采用改良的MB [4]培养基（1 000 mL ）：NaCl 6 g ，NH 4Cl 1 g ，MgCl 2·6H 2O 0.1 g ，K 2HPO 4·3H 2O 0.4 g ，KH 2PO 4 0.2 g ，HCOONa 2 g ，CH 3COONa 2 g ，酵母粉1 g ，胰酶解酪蛋白1 g ，微量元素液10 mL ，复合维生素液10 mL ，0.1%刃天青1 mL ，L -盐酸半胱氨酸0.5 g.分离纯化采用改良的Medium141（DSMZ ）（http:www.dsmz.de/microorganisms/html/media/medium000141.html ）. 固体培养基另加入1.8~2.0% (w/V )的琼脂粉.无机盐培养基（1 000 mL ）：在改良的Medium141配方中去除HCOONa 、CH 3COONa 、酵母粉及胰酶解酪蛋白后即为无机盐培养基.1.2.2 操作方法采用亨盖特厌氧操作改良技术[5~6]进行液体梯度稀释和固体滚管分离纯化. 25 mL 厌氧管或120 mL 血清瓶中加入无氧培养基，顶空为氮气，121 ℃，30 min 高压灭菌，接种后充入H 2+CO 2（V/V =4/1，约200 kPa ）混合气，35 ℃培养.1.3 形态观察和生理生化实验1.3.1 检测镜检采用Nikon 80i 和Olympus BH-2荧光相差显微镜，甲烷含量的测定采用岛津GC-2010气相色谱仪. 1.3.2 生理实验生长条件测定包括最适pH 值、最适生长温度和最适NaCl 浓度试验. 最适生长条件下选取生长对数期的甲烷产量作线性回归，计算得到产甲烷菌的倍增时间. 1.3.3 生化实验底物实验、刺激因子实验、抗生素敏感性实验均采用改良的Medium141无机盐培养基.不同底物利用实验[7]：H 2/CO 2（V/V =4/1）、甲酸盐（50 mmol/L ）、甲醇（50 mmol/L ）、甲胺（50 mmol/L ）、三甲胺（50 mmol/L ）、乙酸盐（50 mmol/L ）、乙醇（50 mmol/L ）分别作为唯一碳源.不同刺激因子实验：酵母粉0.2%、胰酶解酪蛋白0.2%、复合维生素溶液1%（V/V ）、微量元素溶液1%（V/V ）、窖泥浸提液1%（V/V ）、瘤胃浸提液1%（V/V ）、污泥浸提液1%（V/V ）、Na 2WO 4 0.02%、Na 2SeSO 4 0.02%、HS-CoM0.025%.不同抗生素抑制实验[8]：红霉素、卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素、利福平、氯霉素，终浓度均为200 μg mL -1.1.4 16S rDNA 基因扩增与测序提取基因组D N A 作为模板，用产甲烷菌16S r D N A 特异性引物进行P C R 扩增. 正向引物M e t -86F ：5’-GCTCAGTAACACGTGG-3’，反向引物Met-1340R ：5’-CGG TGTGTGCAAGGAG-3’. PCR 反应条件：94 ℃预变性3 min ；94 ℃变性30 S ，58 ℃退火30 S ，72 ℃延伸1.5 min ，40个循环；72 ℃延伸10min [9~10]. 经切胶纯化的PCR 产物连接到PMD18-T 载体（TaKaRa ）上，转化大肠杆菌感受态细胞（DH5α），检测到载体已连接到目的片段之后交由Invitrogen 公司（上海）完成测序.1.5 系统发育树的构建将菌株的16SrDNA 测序结果提交GenBank （/Genbank/index.html ）核酸序列数据库进行BLAST ，使用Clustalx （1.83）软件将与之同源性较高的产甲烷菌的16SrDNA 序列进行比对，通过MEGA （4.1）软件采用邻位相邻法绘出系统发育树并进行Bootstape 稳定性检验（1 000次）.2 结果与分析通过多次富集、添加抗生素梯度稀释纯化得到菌株0372-D1，滚管分离纯化得到菌株0072-D2.2.1 形态特征0372-D1菌体形态为长杆状，略弯，两端整齐，不运动，大小为(0.4~0.5)×(2~25) μm ，单个存在或由3~4个菌体形成长链，培养时间较长时可观察到长的菌体拧成绳状或大量的菌体相互缠绕形成菌丛，该菌在固体培养基上难以长出菌落. 0072-D2菌体形态为直或弯曲杆状，不运动，大小为(0.2~0.3)×(2~10) μm ，单个存在或形成弯曲长链，有时也聚集成团，在固体培养基上培养10 d 左右长出直径1~2 mm 淡黄色圆形菌落，边缘光滑. 见图1.2.2 生理特征菌株0372-D1和0072-D2均为中温产甲烷菌，最适生长温度35 ℃，生长温度范围15~50 ℃. 如图2-A 所示.0372-D1在不添加NaCl 的培养基中生长速度最快，在NaCl 浓度（w/V ）为0.5%~2.5%时生长速度相当，而当NaCl 浓度高于4.5%时不生长；0072-D2则要求培养基具有一定的盐浓度，但NaCl 浓度高于5%时也不生长，最适生长NaCl 浓度在0.5%~1.0%之间. 见图2-B.如图2-C 所示，两株菌在对酸碱的耐受范围上表现出图1 菌株照片图Fig. 1 Micrograph of strainsA ：菌株0372-D1紫外荧光显微照片；B ：菌株0372-D1扫描电镜照片；C ：菌株0072-D2紫外荧光显微照片；D ：菌株0072-D2可见光相差显微照片A: UV fluorescence micrograph of strain 0372-D1; B: Scanning electron micrograph of strain 0372-D1; C: UV fluorescence micrograph of strain 0072-D2; D: Phase-contrast microscopy of strain 0072-D284216 卷应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol了较大的差异：菌株0372-D1生长最适pH 为6.5~7.0，其生长的pH 范围为5.0~8.0. 虽然该菌在pH 5.0和pH 8.0范围内生长停滞期较长，培养7 d 后才开始生产甲烷，但是培养20 d 后可以获得较高的菌浓度，并且在pH 5.0培养基中产生的甲烷量远高于pH 8.0，说明该菌耐酸的能力强于耐碱的能力. 菌株0072-D2生长最适pH 为7.5，略偏碱性，生长pH 范围6.0~9.0，并且在生长的后期，随着CO 2的消耗殆尽，培养基pH 略有升高，而此时菌体浓度高且荧光强烈，说明该菌对碱性环境有较强的适应性.2.3 最适生长曲线两株产甲烷杆菌分别在各自最适条件下培养（300 mL 体系），定时测定甲烷产量，并绘制生长曲线，在生长曲线的直线部分取点，求得菌株0372-D1和0072-D2的倍增时间分别为：19 h 和8 h. 见图3.2.4 生化特征分别以H 2+CO 2、甲酸钠、甲醇、甲胺、三甲胺、乙酸钠和乙醇作为唯一碳源，接种量10%，培养1 mo 监测这两株产甲烷菌的生长情况，结果表明菌株0372-D1只利用H 2+CO 2产生甲烷，0072-D2能够利用H 2+CO 2或甲酸钠作为唯一碳源生长；二者均不利用甲醇、甲胺、三甲胺、乙酸钠或乙醇. 见图4.图2 不同温度（A ）、不同NaCl 浓度（B ）和不同pH （C ）下菌株0372-D1和0072-D2的甲烷生成比较Fig. 2 Comparison of methane production by strain 0372-D1 and 0072-D2 at various different temperatures (A), concentrations of NaCl (B) and pH values (C)图3 菌株0372-D1和0072-D2的最适生长曲线Fig. 3 The growth curves of strains 0372-D1and 0072-D2 underoptimum conditions图4 菌株0372-D1和0072-D2在不同底物中的生长情况Fig. 4 Methane production by strains 0372-D1 and 0072-D2 in various substrates图5 刺激因子对菌株0372-D1和0072-D2生长的影响Fig. 5 Effect of growth stimulators on the growth of strains 0372-D1 and 0072-D21PMF ：窖泥浸提液；2SF ：污泥浸提液；3RS ：瘤胃浸提液；4TES ：微量元素液；5VS ：复合维生素液；6YP ：酵母粉；7BBL ：胰酶解酪蛋白；8VAX ：Na 2WO 4/Na 2SeSO 4混合溶液；9CK ：对照1PMF: Pit mud ﬂ uid; 2SF: Sludge ﬂ uid; 3RS:Rumen solution; 4TES: Trace elements solution; 5VS: Vitamin solution; 6YP: Yeast extract; 7BBL: Trypticase;8VAX: Na 2WO 4/Na 2SeSO 4 mixed solution; 9CK: Contrast8436 期王俪鲆等：泸州古酿酒窖池中两株产甲烷杆菌比较研究刺激因子实验结果表明，0372-D1能在无机盐培养基中生长良好，瘤胃浸提液对其的刺激作用最明显，其次是复合维生素液和酵母粉；而0072-D2在无机盐培养基中生长不良，污泥浸提液和酵母粉对其生长有较强的刺激作用. 见图5.抗生素抑制实验表明，0372-D1和0072-D2对氯霉素敏感，对红霉素、卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素和利福平均有抗性.2.5 系统发育学分析0372-D1和0072-D2的16SrDNA 序列相似性为95%.将0372-D1和0072-D2的16SrDNA 序列在G e n Ba n k中分别进行B L A S T ，相似性最高的均为产甲烷杆菌属（M e t h a n o b a c t e r i u m ）的菌株. 以此为根据选择10株M e t h a n o b a c t e r i u m 菌株，以1株产甲烷短杆菌模式株Methanobrevibacter smithii 作为外群种构建系统发育树，见图6.由系统发育树可以看出，菌株0372-D1与0072-D2与Methanobacterium 内的10株菌亲缘关系最密切，形成一个簇群. 其中，0372-D1与M. curvum 和M. congolense C 的16S rDNA图6 根据16S rDNA 序列同源性构建的产甲烷杆菌属的系统发育树Fig. 6 Dendragram of Methanobacterium based on 16S rDNA sequence homology表1 0372-D1，0072-D2与16SrDNA 序列同源性相近的几种产甲烷杆菌的特征比较Table 1 Comparison of phenotypic features of strains 0372-D1 and 0072-D2 with other species of Methanobacterium特征 Features123456789101112菌体大小Cell size (d /µm)0.4~0.5×2~250.2~0.3×2~100.4~0.8×2~150.4~0.5×2~100.3~0.4×2~200.5×2.5~50.1~0.15×0.6~1.20.3~0.4×3~100.4~0.5×3~50.7×5~180.5~1.0×10~150.8×3~22菌落大小Colony size (d /mm)ND1.0~2.0Up to 5.0Up to 1.0 1.0~1.5ND 1.0~2.0 1.0~2.00.5~1.0ND 1~50.5~1.0底物利用Substrates used H 2+CO 2H 2+CO 2甲酸盐Formate H 2+CO 2甲酸盐Formate H 2+CO 2H 2+CO 2H 2+CO 2甲酸盐Formate H 2+CO 2甲酸盐Formate H 2+CO 2甲酸盐Formate H 2+CO 2甲酸盐Formate H 2+CO 2H 2+CO 2H 2+CO 2最适温度Optimum temperature (θ/℃)353537~4537~423733~3720~4040374537~3935温度范围Temperature range(θ/℃)15~5015~50ND 25~5027~4520~45 3.6~4520~4225~505~48ND 15~50最适pH Optimum pH 6.5~7.07.5 6.6~7.87.2 6.5~7.57.07.8~8.87.07.27.5~8.0 6.9~7.2 5.6~6.2pH 范围pH range 5.0~8.0 6.0~9.0ND 5.9~8.2ND ND 6.5~9.2 6.0~8.5 6.5~8.0 5.0~9.0ND 4.6~7.0最适NaCl 浓度Optimum NaCl con. (w /%)00.2~0.5ND ND <0.5ND ND ND ND ND ND ND NaCl 浓度范围NaCl con. range(w /%)0~4.50~5.0NDNDND0~0.30.1~1.20~0.40~0.5NDNDND来源Source 窖泥Pit mud 窖泥Pit mud 厌氧消化器Anaerobic digester 厌氧消化器Anaerobic digester 厌氧消化器Anaerobic digester 泥炭沼泽Peat bog 深岩地下水Deep granitic groundwater 稻田Rice ﬁ eld 厌氧消化器Anaerobic digester 海洋沉积物Marinesediment厌氧消化器Anaerobic digester污泥SludgeStrains: 1, 0372-D1; 2, 0072-D2; 3, M. formicicum DSM 1535T ; 4, M. congolense DSM 3387T ; 5, M. curvum Px1; 6, M. palustre DSM 3108T; 7, M. subterraneum DSM 11074T ; 8, M. oryzae DSM 11106T ; 9, M. beijingense 8-2T ; 10, M. aarhusense DSM 15219T ; 11, M. bryantii DSM 863T ; 12, M. espanolae OCM 178T ; ND: Not determined84416 卷应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol序列同源性最高，为96%；0072-D2与M. formicicum的同源性最高，为99%.菌株0372-D1和0072-D2与16SrDNA序列同源性最相近的产甲烷杆菌属几个种的特征比较见表1.3 讨论根据国际细菌系统分类学产甲烷菌分类鉴定的基本标准[11]，以及细菌分类学家普遍认为的当16S rDNA序列同源性在98%以上时，可认作同一个种；当序列同源性低于97%时，可认为是属内的不同种，低于93%~95%则可能为属外成员[12~13]；通过系统发育分析得出0372-D1与产甲烷杆菌属中同源性最高的种M. curvum和M. congolense C的相似性为96%. 在生理特征上，菌株0372-D1与产甲烷杆菌属其它种最大的区别就在于生长pH范围的宽泛性和一定的耐酸能力，生化性质上也存在较大差异，因此0372-D1可能为产甲烷杆菌属的一个新种. 菌株0072-D2与M. formicicum的同源性最高，为99%，因此为甲酸甲烷杆菌的一个新菌株.古酿酒窖池为一酸性环境，老窖泥pH值在3.8~4.0之间，滴窖黄水的pH值则低达3.0左右，然而从窖泥富集的产甲烷古菌最适pH基本在中性附近. 这种情况和酸性泥炭沼泽相类似. 泥炭pH值一般在3.5~5.0之间，但从泥炭中分离出的绝大多数菌株仍是中性产甲烷菌. 这种在酸性环境中仍以中性产甲烷菌为优势种群的现象，值得进一步研究.产甲烷古菌作为古菌域中最大的一个类群，广泛存在于地球上各类厌氧环境中. 淡水和海洋沉积物、稻田、沼泽、动物瘤胃和肠道等大小厌氧生态环境均有产甲烷古菌存在. 产甲烷古菌能适应多种多样的温度环境，但大多数产甲烷古菌的适宜pH在相对狭窄的范围内（6.0~8.0）. 至今已报道的产甲烷古菌中，仅有少数几个种为嗜酸或耐酸产甲烷古菌. 分离自污泥中的M. espanolae是嗜酸产甲烷菌，生长最适pH 为5.6~6.2，但若pH低于4.68则停止生长[14]. 2006年《Nature》报道的一株分离自泥炭沼泽的嗜酸产甲烷菌Methanoregula boonei，生长最适pH5.0，当pH低于4.0或高于5.8则不生长，为目前分离到的最耐酸的产甲烷古菌[15~16]. 本次从古酿酒窖池分离出的产甲烷杆菌0372-D1菌株虽然生长最适pH为6.5~7.0，但在pH 5.0时仍可生长，表现出一定的耐酸特性，因而具有较好的学术意义和应用价值.References1 北原觉雄. 细菌利用工业. 平安译. 北京: 中国轻工出版社, 1956.147~1562 Liu GY (刘光烨), Zhao YZ (赵一章), Wu YY (吴衍庸). 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包埋法固定化细胞技术的研究进展

.5 /
等通过加入 01 的方法来降低制备
研究结果表明，在 K’1 浓度为 !$> "8 ， K’1 珠体的难度， 01 为 !> $"8 ，所用的氯化钙的浓度为 +8 ，固定 + G 5I 后，制备的 K’1 珠体效果较好。李峰
. !5 /
等也采用添加 $8 的 01 来包埋细
氯化钙的浓度为 $8 ，获得的小珠胞，所用的 K’1 浓度为 !%8 ，直径为 &22，包埋固定的小珠具有较高的细菌活性，较好的强度及传质性能。钟娅玲 . !# / 对 01 的添加量对 K’1 珠体的影响进行研究，发现随着 01 添加量的增加，载体孔容增加，比表面积增大，但其载体机械强度大幅度下降，但当 01 浓度为 !8 时，可在保证载体在长期耐机械搅拌的同时增加载体表面积，增加孔容，改善传质效果。由于 01 不适宜含有磷酸盐缓冲液的反应体系，为此，童群义 . $% / 等采用 K’1 4 卡拉胶混合载体进行实验，研究发现在 K’1 浓度为 !%8 ，卡拉胶浓度为 %> "8 ，成型剂的 LA 值为 B> + ，包埋菌体量为 %> "J E J，固定时间为 &BI 时，固定化细胞具有较好的机械强度和较高的酶活力。陈敏 . $! / 用 K’1 加少量的活性炭进行固定化研究，发现有助于颗粒成型，改善通透性，增加固定化颗粒的孔隙，达到吸附和包埋的双重效果。黄霞
. !" /
等以 K’1—无纺布混合载体包埋固定化优势菌种用于降
解吡啶，喹啉，异喹啉，结果表明，经固定化细胞处理 5I 后，三种有机物的去除率均达 #%8 以上。取得较好效果。桥本奖 . $& / 等人在 K’1—硼酸法固定化过程中引入海绵状多孔性载体，减少了微生物活性损失。角立野夫 . $+ / 等则在 K’1—硼酸聚合反应过程中引入丙烯酰胺聚合反应，使之在 K’1 凝胶颗粒内部及表面形成聚丙烯酰胺网状结构，有效的改善了 K’1 凝胶的水溶膨胀性。 MN( 4 <I;?J CI;? . $" / 等在 K’1 与硼酸交联后与磷酸进行酯化以固定凝胶球。 !> & !> &> ! 聚丙烯酰胺包埋法方法先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙稀酰胺 6 :O0 7 的溶液，与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，然后加入一定量的过硫酸铵 6 1K0 7 和四甲基乙二胺 6 PQ9QR 7 ，混合后让其静置聚合，将凝胶块用手术刀切块，获得所需形状的固定化细胞胶粒。 !> &> $ 研究与发展用聚丙烯酰胺凝胶制备的固定化细胞机械强度高，可通过

乳酸氧化酶的固定化研究

www. hxyswgc. com 2020,Vol.37 No. 12Chemistry & Bioengineeringdoi ：10. 3969/j. issn. 1672 — 5425. 2020. 12. 010刘洋，周晶辉，赵强，等.乳酸氧化酶的?定化研究[J].化学与生物工程，2020,37(12):4044.LIU Y, ZHOU J H , ZHAO Q, et al. Immobilization of lactate oxidase[J]. Chemistry W Bioengineering , 2020,37(12) : 40-44.乳酸氧化酶的固定化研究刘洋，周晶辉，赵强，赵士敏，许岗(湖南福来格生物技术有限公司，湖南长沙422010)摘要：将乳酸氧化酶(LOx)在大肠杆菌E . col BL21CDE3 "中重组表达，研究了 LOx 游离酶的基本性质，优化了 LOx 的?定化条件，并考察了 ?定化LOx 的使用稳定性及储存稳定性。

结果表明，LOx 游离酶具有较好的pH 值稳定性和热稳定性；LOx 的最优?定化条件为：使用ECHA/S 氨基载体丄Ox 游离酶与载体比例为1 000 : 1(U : g )、2 3盐浓度、固定化温度20 b 、固定化pH 值7〜8; ?定化LOx 具有较好的使用稳定性和储存稳定性，转化13批次后，固定化LOx 酶活无明显下C 4 b 下储存130 d,无酶活损失&关键词：乳酸氧化酶；氨基载体；？定化酶；稳定性中图分类号:Q814 Q554+.9文献标识码:A文章编号=1672-5425(2020)12-0040-05Immobilization of Lactate OxidaseLIU Yang,ZHOU Jinghui,ZHAO Qiang,ZHAO Shimin,XU Gang(.Hunan Flag Bio-Technology Co . .Ltd . , Changsha 422010 , China}Abstract : Lactate oxidase(LOx ) was recombinantly expressed in E. coii BL21(DE3). We studied the basicproperties of the free LOx, optimized the immobilization conditions of LOx, and investigated the use stabilityand storage stability of the immobilized LOx. The results show that the free LOx has good pH value stability and thermal stability. The optimum immobilization conditions of LOx are determined as follows : using ECHA/S amino carrier,the ratio of the free LOx to carrier of 1 000 : 1 (U : g) ,natural sl concentration ,the immobiliza tion temperature of 20 b ,and the immobilization pH value of 7 — 8. After 13 batches of conversion,the immobi lized LOx has no significant decrease in enzyme activity ；when stored at 4 b for 130 d,the immobilized LOx shows noloss of enzyme activity , indicating that the immobilized LOx has good use stability and storage stability.Keywords : lactate oxidase ； amino carrier ； immobilized enzyme ； stability 丙酮酸是生物代谢的重要中间体，丙酮酸及其盐被越来越广泛地应用于药物前体、食品添加剂和减肥补充剂等的制备,市场潜力巨大［12］*乳酸是制备丙酮酸的重要原料，其价格仅是丙酮酸的10% *随着生物技术的发展，生物催化越来越多地运用于丙酮酸的制备3*以乳酸为原料生物催化制备丙酮酸的常用酶有乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase , LDH )、乳酸氧化酶(lactate oxidase , LOx )"5) * 其中 LDH 需要有NAD +参与反应，其价格昂贵，不易于工业化生产〔5)；而LOx 作为一种黄素蛋白酶，以黄素核昔酸(FMN )作为辅因子,FMN 和酶蛋白牢固结合，反应过程中无需额外添加辅因子，节约了生产成本［67］ *因此，以 LOx 为催化用酶更适合于丙酮酸的工业化生产*固定化酶在生产中具有产物易分离、可重复使用等优点，相对于游离酶更具应用价值89 *目前，文献报道的固定化LOx 多用于制备检测微量乳酸的生物传感器［1012］，且不具备生产能力；而用于工业化生产丙酮酸的固定化LOx 也未能克服固定化酶稳定性差的问题，如刘真等制备的磁性壳聚糖固定化LOx转化5批次后，残余酶活仅70% ；王艳等采用包埋收稿日期2020-08-18作者简介：刘洋(1988 —"，男，湖南益阳人，工程师，研究方K ：酶定向进化、酶?定化，E-mail ： 396787917@qq. com.刘洋，等：乳酸氧化酶的固定化研究/2020年第12期法制备的海藻酸钙凝胶包埋LOx反应5批次后，残余酶活仅85%*酶的基本性质对酶固定化有直接影响。

1株好氧反硝化菌的筛选鉴定及固定化研究

宋漫利，李　成，刘春敬，等．１株好氧反硝化菌的筛选鉴定及固定化研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１３）：２７１－２７５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１３．０６３１株好氧反硝化菌的筛选鉴定及固定化研究宋漫利，李　成，刘春敬，梁致齐，李容臻，谢建治（河北农业大学资源与环境科学学院／河北省农田生态环境重点实验室，河北保定０７１００１）摘要：为了提高污水处理设施的低温生物强化效果，以崇礼污水处理厂ＳＢＲ反应池活性污泥为菌源，进行污水处理耐冷菌的分离鉴定及固定化研究。

从活性污泥中分离筛选出１株硝化和好氧反硝化耐冷菌，结合生理生化、形态学以及１６ＳｒＤＮＡ基因测序结果，初步鉴定该菌株为假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）。

以海藻酸钠（ＳＡ）和聚乙烯醇（ＰＶＡ）为包埋材料，利用正交试验优化ＮＬ－４包埋固定化制备条件。

当ＳＡ质量分数为１％、ＰＶＡ质量分数为１２％、ＣａＣｌ２质量分数为１％、包菌量为１０％时，制备的固定化小球物理性能最佳。

在１０℃培养条件下，ＮＬ－４对污水中氨态氮（ＮＨ３－Ｎ）和硝态氮（ＮＯ３－－Ｎ）的去除率分别是６８．０５％、９８．９４％，包埋固定化后分别提高了１４．４９％、１．４％。

４℃保藏６０ｄ后，比游离菌相比固定化载体的ＮＨ３－Ｎ、ＮＯ３－－Ｎ去除率分别提高５８．８％、５３．３％。

ｐＨ值为７～９、温度为１０～２０℃时，最适宜ＮＬ－４及其固定化载体发挥硝化、反硝化能力。

关键词：假单胞菌；聚乙烯醇－海藻酸钠（ＰＶＡ－ＳＡ）；好氧反硝化；包埋固定化；去除率中图分类号：Ｘ７０２；Ｓ１８２文献标志码：Ａ文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１３－０２７１－０５收稿日期：２０１７－１０－１８基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项（编号：２０１５ＺＸ０７２０３－００５）；河北省高等学校科学技术研究青年基金（编号：ＱＮ２０１７０７６）；河北省博士研究生创新资助项目（编号：ＣＸＺＺＢＳ２０１７０７１）。

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细胞（微生物）或酶，限制或定位在某一特定空间范围合基质或连接于载体分子而限制酶、微生物的移动；
３湿度传感器的应用：以在堆积培养设备上实．３可
现湿度控制调整自动化。
３流量计的应用：以在液体配料工艺上做到精量的试验和数据采集，照对比，出其中的规律。．４可参找
ｅｕｔｓｏｄｉｒｓｌｈｗｅｓｍｍｏｉｚｄｏＶＡｏｃｉａｅａｂｎｉｃｎｅｉｎｔｏ．ｂｌｅｎＰｒｔｔｄｃｏｓｏｖｎｅｔｈｄｉａｖｒｍｅＫｅｒｓｐｔｍｕｎｔｎａｔｒ；ｍｍｏｉｚｔｎ；ｓａｎｎｌｃｒｎｍｉｒｓｏｙｃｎｉｕｕｃｄｐｏｕｉｇｙｗｏｄ：ｉｄｆｃｏａｂｃｅａｉｕｉｌｉｂｌａｉｉｏｃｎｉｇｅｅｔｏｃｏｃｐ；ｏｔｏｓａｉ－ｒｄｃｎｎ
ｌｗｙｉｔｎｉ，ｏｒｏｅａｉｎｔｂｌｙｅｃＩｈｓｐｐｒｉｍｕｎｔｎａｔｒｍｍｏｉｚｄｏＶＡｒａｔａｅａｂｎｗｅｅｏｌｎｅｓｙｐｏｐｒｔａｓｉｔ，ｔ．ｎｔｉａｅ，ｐｔｄｆｃｉａｂｃｅａｉｔｏｌａｉｕｏｌｉｂｌｅｎＰｉｏｃｉｔｄｃｒｏｒｖ
固定化微生物可以进行高密度增殖培养，提高
反应器单位体积的生物转化速率，延长发酵细胞的
寿命，增加稳定性，于实现连续化生产，利利于产物
分离等。为此天津津酒集团对采用活性炭、ＶＰＣ为载
换，常规临界点干燥，离子镀膜，最后用日立Ｘ５ＳＭ，２Ｋ６０Ｅ在５ｖ下观察并照相。扫描电镜下观察。１．固定化ＰＡ断面，作过程同上。．２取５Ｖ操
２结果与讨论
体的窖泥功能菌固定化细胞发酵进行研究摸索。
１材料与方法
１１己酸茵培养．
１．．１菌株：１天津津酒集团老窖窖泥中分离筛选。
１１培养基和培养条件．．２培养基：乙酸钠０５，酸氢二钾０４％，酸．磷％．４磷镁００％，酸铵００％，．２硫．５酵母膏０１碳酸钙１，．％，％ｐ７２灭菌：小时（Ｈ．，１压力为０１ａ．ＭＰ）试管至大角瓶阶段抽真空至６０７０毫米汞５～０柱，压培养。减１２窖泥功能茵培养．１．株：．１菌２天津津酒集团老窖窖泥。菌：ｈ压力为０１ａ试管至大角瓶阶段抽真空至１（．ＭＰ）
２１固定化载体材料的选择．．１
１．料：．１材３颗粒活性炭
１．载体处理：性炭先用自来水冲洗干净，除．２３活去粉末，干，１０｛干４，淋于１￣烘２ｈ装袋用多层布包好，高压灭菌，干备用。烘１Ｉ固定化细胞制备：袋装好的材料，置发酵．３３将放旺盛的己酸发酵液中，置过夜。静１．培养液中加人吸附活性炭载体（袋）行培．４３装进养。培养５ｄ后，载体转入下一瓶，将如此反复进行。
ＡｂｔａｔＰｔｍｕｎｔｎｌｂｃｅａａｅａｗａｓｉｓｒｃ：ｉｄｆｃｏａａｔｒｒｌｙｍｍｏｉｚｄｏｏｉｍｌｉａｅｏｇｒｕｉｉｒｂｌｅｎｓｄｕａｇｎｔｒａａ．Ｈｏｖｒｔｅｅａｅｍａｙｓｏｔｏｎｓｓｃｓｉｗｅｅｒｒｎｈｒｍｉｇｕｈａｈｃ
６０７０ｈ，压培养。５～０ｍｍｇ减
１３活性炭吸附法．
固定化方法一般包括：埋法，法，附法，包交联吸载
体结合法，膜包法等等。现常用的包埋法和吸附法。
固定化细胞技术是在固定化酶的技术上发展起来的，由于该技术既不需要把酶从细胞中提取出来，细胞可以为酶提供良好的反应环境，提供能量，多可有
细化生产，在打量水时实现精确定量，工艺技术得到
有效控制。
３压力传感器的应用：．５在蒸粮、酒时通过压力蒸
我们将继续对现有清香、浓香、芝麻香型酿酒机械化设备系统进行优化和完善，继续对酱香型、馥郁香型
白酒酿酒机械化、曲机械化设备、酵生物反应器制发
缓冲液（Ｈ．中用超声波清洗器振荡半分钟后，ｐ７）４反
复冲洗３次，每次１ｍｉ。再放人１酸中固定１。５ｎ％锇ｈ用０１ｏＬ磷酸缓冲液（Ｈ．）冲洗３次，每次．ｍｌ／ｐ７４
１ｍｉ。用３％～０％乙醇逐级脱水，酸异戊酯置５ｎ０１０醋
周仁忠，王建忠，黄敬，刘宏媛
３０３）０１０（天津津酒集团有限公司，天津
摘
要：用海藻酸钠、琼脂等栽体对固定化窖泥功能茵进行发酵产酸的研究，但都存在着载体强度低，操作稳定性
差等不足。我们用活性炭、ＶＡ制备了两种固定化窖泥功能茵，Ｐ并用扫描电镜（Ｍ）ｓ观察了．Ｉ炭、Ｖ固定化窖Ｅ活｝ＰＡ生
固定化技术是指利用化学或物理手段将游离的内，留其固有的催化活性，能够被重复和连续使保且用的现代生物工程技术。其包括固定化酶技术与固定化细胞技术两种。二十世纪中期已有应用固定化
收稿日期：０１０ — ９２１－１０作者简介：周仁忠（９０）男，１６一，天津市人，大学，高级工程师，主要从事酿酒工艺及微生物方面的研究。
泥功能茵的形态。连续发酵产酸表明两种固定化窖泥功能茵具有良好的操作稳定性和产酸能力。
关键词：窖泥功能茵；固定化；扫描电镜；续产酸连中图分类号：Ｓ６．；Ｓ６．；Ｓ０．Ｔ２２３Ｔ２１１Ｔ２１２文献标识码：Ｂ
Ｅｌｃｒｎｍｉｒｓｏｉｂｅｖｔｏｎａｐａａｃｅｔｒｓｏｍｍｏｉｚｄｐｔｅｔｏｃｏｃｐｃｏｓｒａｉｎｏｐｅｒｎｅｆａｕｅｆｉｂｌｅｉｉｍｕｕｃｉｎｌｂｃｅｉ＆Ｓｕｙｏｔｃｄｐｏｕｉｇｐｏｅｔｓｄｆｎｔａａｔｒａｏｔｄｎｉａｉｒｄｃｎｒｐｒｉｓｅ
ＺＨＯＵＲｅ－ｈｎ，ＡＮＧｉｎｚｏｇｎｚｏｇＷＪａ－ｈｎ，ＨＵＡＮＧｉｇＬＵＨｏｇｙａＪｎ，Ｉｎ－ｕｎ（ｅｈｉｌＣｎｅｆＴａｊｉＪｒｕＯ，ＬＤ，ｉｎｉ３０３，ｈａＴｃｎｃｅｔｒｏｉｉＪｉＧｏｐＣ．Ｔ．Ｔａｊ０１０Ｃｉ）ａｎｎｎｕｎｎ
第二期
西良
酒
２１０２
细胞技术在固定化酶的基础上发展以来，其应用研究已涉及到医药、食品、化工、环境、能源开发等各个
领域。
１．．１取固定化活性炭颗粒断面，放人２５５．％戊二醛中固定２ｈ以上，￣冰箱固定２。后０１ｌ４Ｃｈ然．／酸ｍｏＬ磷
ｓｄｅｄｔｅｂｅｖｄｂｌｃｒｎｍｉｒｓｏｙｈｏｔｕｕｃｄｐｏｕｉｇｏｍｍｏｉｚｄｂｃｅａｗｒｓｅｅｒｈ．ｈｔｉｄａｎｏｓｒｅｙｅｅｔｏｃｏｃｐ．Ｔｅｃｎｉｏｓａｉ－ｒｄｃｎｆｉｕｎｈｎｂｌｅａｔｒｅｅａｏｒｓａｃｅＴｅｉｉｌｄ
传感器控制调整蒸汽的开度，实现生产自动化。
４白酒酿酒机械化展望
等进行深入研究和开发，积极响应中国酿酒工业协会 “ ５划 ”为中国白酒酿酒机械化，动白酒行１８计，推业整体进步和创新作出应有的努力。
白酒酿酒机械化已经迈出了坚实的步伐，中国
技术，们通过有目的地将酶、生物细胞包裹于聚人微也可采用酶、微生物细胞的交联，过蛋白质交联或通无活性材料的加入，从而产生了无数不同材料的固定方法。固定化微生物细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，地利用游离细胞的完整酶系统有效和细胞膜的选择通透性，具有固定化酶的优点，既又具有其自身的优越性。自二十世纪六十年代固定化白酒传统工艺的特殊性注定了白酒酿造机械化是一个复杂的系统工程，有一段实践探索过程，要大还需