水质 总大肠菌群测定作业指导书

水质总大肠菌群测定作业指导书

1含义及执行标准

1.1含义

总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

1.2方法原理

多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。

1.3水环境质量标准

表1-1 总大肠菌群地下水质量分类指标（GB/T 14848-93）

表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）

表1-3 总大肠菌群渔业水质标准（GB 11607-89）

1.4水污染物排放标准

表1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准（GB 3552-83）

2分析方法

2.1方法名称、方法来源及适用范围

方法名称：多管发酵法

方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二

章五(一)

方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。

2.2仪器

高压蒸汽灭菌器

电热干燥箱

恒温培养箱

显微镜

冰箱

采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压

蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。

2.3 标准菌株制备

将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。必须包

括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。接种完后需记录：母种的来源，母种和工作

种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯

度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。

2.4 培养基

2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。

2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。

2.4.3 品红亚硫酸钠培养基：市售品红亚硫酸钠培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

2.4.4 伊红美蓝培养基：市售伊红美蓝培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，

在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

2.3.5培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。

2.5分析步骤

2.5.1 生活饮用水

①初发酵实验：在二个装有已灭菌的50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的大试管中（内有倒

管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖

蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10ml，混匀后置于

37℃恒温箱培养24h。

②平板分离：经初发酵试验培养24h后，发酵试管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为

产气。将产酸产气及只产酸发酵管，分别用接种环划线接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，置37℃恒温箱内培养18～24h ，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。

品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落；伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。 ③复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养基中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱内培养24h ，有产酸产气者，即证实有大肠菌群菌存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管数查表6，报告每升水样中的大肠菌群数。 2.5.2 水源水

①将水样作1：10稀释。

②于各装有5ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加10ml 水样；于各装有10ml 乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加1ml 水样；于各装有10ml 乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加1ml1:10稀释的水样。共计15管，三个稀释度，将各管充分混匀，置于37℃恒温箱培养24h 。

③平板分离和复发酵试验的检验步骤同（1）“生活饮用水”检验方法。

④根据证实总大肠菌群存在的阳性管数查表7，即求得每100ml 水样中存在的总大肠菌群数。 2.5.3 地表水和废水

①地表水中较清洁水的初发酵试验步骤同2.5.2饮用水源水检验方法。有严重污染的地表水和废水初发酵试验的接种水样应作1：10，1：100；1：1000或更高的稀释，检验步骤同2.5.2饮用水源水检验方法。

②如果接种的水样量不是10ml ，1ml 和0.1ml ，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面的公式换算成每1L 的MPN 值，即为1L 水样中的总大肠菌群数。

2

10

-⨯=

第一个浓度的接种量指数

值MPN MPN

表6 大肠菌群检数表

（接种水样100ml2份，10ml10份，总量300ml）

10ml水量的阳性管

数

100ml水量的阳性瓶数

0 1 2

1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数

0 ＜3 4 11

1 3 8 18

2 7 1

3 27

3 11 18 38

4 14 24 52

5 18 30 70

6 22 36 92

7 27 43 120

8 31 51 161

9 36 60 230

10 40 69 ＞230

表7 最可能数（MPN）表

（接种5份10ml水样、5份1ml水样、5份0.1ml水样时，不同阳性及阴性情况下100ml