CIK细胞联合埃克替尼对肺腺癌细胞系的体外抑制效应

、安徽医科大学学报ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ２０１３Ａｕｇ；４８（８）

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ＣＩＫ细胞联合埃克替尼对肺腺癌细胞系的体外抑制效应丁艳琦，江蓓蕾，鲍扬漪

摘要目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞（ＣＩＫ）疗法和盐酸埃克替尼（Ｉｃｏｔｉｎｉｂ）对肺腺癌ＰＣ９细胞和Ａ５４９细胞的体外杀伤效应。方法以ＰＣ９和Ａ５４９分别为靶细胞，将实验分为４组：ＣＩＫ细胞单独组、Ｉｃｏｔｉｎｉｂ单药组、ＣＩＫ细胞＋Ｉｃ—ｏｔｉｎｉｂ联合组和空白对照组。用噻唑蓝（ＭＴＴ）法检测Ｉｃｏｔｉｎ—ｉｂ对两种靶细胞的半数抑制浓度（Ｉｃ∞）；细胞计数（ＣＣＫ８）试剂盒以及细胞凋亡检测（ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ）试剂盒联合流式细胞仪检测ＣＩＫ细胞和Ｉｃｏｔｉｒｔｉｂ分别及联合对ＰＣ９细胞和Ａ５４９细胞的生长抑制和促凋亡作用。结果①Ｉｃｏｔｉｎｉｂ对ＰＣ９及Ａ５４９细胞作用４８ｈ后的Ｉｃ５０值分别为：（０．２１±０．０３）、（４．７９±０．７４）斗ｍｏｌ／Ｌ；②ＣＣＫ８杀伤和ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ凋亡实验可观察：ＣＩＫ细胞与Ｉｃｏｔｉｎｉｂ联合应用对靶细胞的体外杀伤作用均明显高于ＣＩＫ细胞单独组和Ｉｃｏｔｉｎｉｂ单药组。靶细胞为ＰＣ９细胞时，ＣＩＫ细胞＋Ｉｃｏｔｉｎｉｂ联合组的杀伤率可达（６５．８５±１．４４）％；靶细胞为Ａ５４９细胞时，ＣＩＫ细胞＋Ｉｃｏｔｉｎｉｂ联合组的杀伤率可达（５２．９２±１．５７）％。结论ＣＩＫ细胞疗法联合分子靶向药物在体外可有效抑制肺癌细胞的生长，分子靶向治疗和细胞免疫疗法为临床上肺癌的综合治疗提供可行性。关键词细胞因子活化的杀伤细胞；肺肿瘤：埃克替尼；ＰＣ９细胞；Ａ５４９细胞中图分类号Ｒ７３０．５

文献标志码Ａ文章编号１０００—１４９２（２０１３）０８—０８９３—０５

肺癌是全世界范围内各种恶性肿瘤中导致死亡最常见的疾病，尤其是非小细胞肺癌（ｎｏｎ—ｓｍａｌｌｃｅｌｌ

ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ），占肺癌的８０％～８５％。肺癌是男性中最为常见的肿瘤之一，并且在女性中的发病率也逐年上升。近年来，由于传统的治疗手法如手术、化疗和放疗等已进入平台期，肿瘤的生物治疗迅速发展，其在改善患者生存质量和降低复发率方面的重要作用已得到越来越多的认可和重视。其中，免疫疗法和分子靶向药物是近年来生物治疗中的热点¨‘２Ｊ。细胞因子诱导的杀伤细胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ－

２０１３—０２—２８接收作者单位：安徽医科大学第三附属医院血液肿瘤科，合肥２３０００１作者简介：丁艳琦，女，硕士研究生；鲍扬漪，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，Ｅ－ｍａｉｌ７６１７６０５６５＠ｑｑ．ｃｏｒｎ

ｉｎｄｕｃｅｄｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ，ＣＩＫ）是将人体外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子［如抗ＣＤ３分子的单克隆抗体（ＣＤ３Ｍｏｎｏ—ｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＣＤ３ＭｃＡｂ）、白细胞

介素－２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２，ＩＬ－２）、１一干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ一１，ＩＦＮ．１）等］共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞能同时表达ＣＤ３和ＣＤ５６两种膜蛋白分子，故又被称为自然杀伤（ＮＫ）细胞样Ｔ淋巴细胞，兼具有Ｔ淋巴细胞强大的抗瘤活性和ＮＫ细胞的非主要组织相容性复合物（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍ—ｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）限制性杀瘤的特点旧Ｊ，已成为肿瘤过继免疫治疗的主要效应细胞。盐酸埃克替尼（Ｉｃｏｔｉｎｉｂ）是一种强效的新型国产表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）酪氨酸

激酶抑制剂（ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＴＫＩ）。可阻断ＥＧＦＲ介导的信号转导，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床的Ｉ期试验表明了Ｉｃｏｔｉｎｉｂ临床用药的安全性和患者良好的耐受性Ｈ１。该研究通过ＣＩＫ细胞联合Ｉｃｏｔｉｎｉｂ对两种ＮＳＣＬＣ细胞株在体外的杀伤作用作一研究，旨在为临床上肺癌的综合治疗提供新的可行性。

１材料与方法１．１材料１．１．１细胞系ＮＳＣＬＣ细胞株ＰＣ９细胞和Ａ５４９细胞均由我院内分泌科惠赠。细胞治疗的ＣＩＫ细胞由我院的中心实验室制备。１．１．２主要试剂及仪器Ｉｃｏｔｉｎｉｂ由浙江贝达药业有限公司惠赠；ＲＰＭＩ一１６４０培养液、胎牛血清为美国Ｇｉｂｃｏ公司产品；噻唑蓝（ＭｑＴ）粉剂、二甲基亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；细胞计数（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇ

ｋｉｔ，ＣＣＫ８）试剂盒购自上海

贝博生物科技有限公司；细胞凋亡检测（ＡｎｎｅｘｉｎＶ—

ＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ，Ａｎｎｅｘｉｎ

Ｖ—ＦＩＴＣ）试剂

盒、流式细胞仪购自美国ＢＤ公司；酶标仪由美国伯乐公司提供。１．２方法１．２．１细胞培养ＰＣ９细胞和Ａ５４９细胞常规培养

万方数据・８９４・安徽医科大学学报Ａｃｔａ

ＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ

２０１３Ａｕｇ；４８（８）

于含体积分数１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养液中，于体积分数为５％ＣＯ：、３７ｏＣ饱和湿度条件下培养，每１～２天传代１次，取对数生长期细胞用于实验。ＣＩＫ细胞在每次制备好后２４ｈ内用于实验中，不能传代。！．２．２实验分组将Ｉｃｏｔｉｎｉｂ溶于１００％ＤＭＳＯ中，再用ＲＰＭＩ．１６４０培养液稀释至所需浓度梯度，使得ＤＭＳＯ的终体积分数为０．１％。实验分别以ＰＣ９和Ａ５４９细胞为靶细胞，分组如下：①ＣＩＫ细胞单独组（Ｉ）：ＣＩＫ细胞具有浓度和梯度依赖性，本实验将效应细胞与靶细胞之比（Ｅ／Ｔ）设置为３０：１。②Ｉｃ—ｏｔｉｎｉｂ单药组（Ⅱ）：靶细胞为ＰＣ９细胞，用ＲＰＭＩ一１６４０培养液将Ｉｅｏｔｉｎｉｂ稀释至终浓度ｌＩ１、１１２、Ⅱ３分别为０．０４、０．０８、０．１６／ｘｍｏｌ／Ｌ；靶细胞为Ａ５４９细胞，用ＲＰＭＩ．１６４０培养液将Ｉｅｏｔｉｎｉｂ稀释至终浓度Ⅱ４、Ⅱ５、ｌＩ６分别为１．０５、２．１、４．２ｐｍｏｌ／Ｌ。③ＣＩＫ＋Ｉｃｏｔｉｎｉｂ联合组（Ｉ＋Ⅱ）：将同一效靶比下的ＣＩＫ细胞和不同浓度梯度下的Ｉｅｏｔｉｎｉｂ药物分别联合作用，记做联合组：靶细胞为ＰＣ９细胞，联合组Ａ＝ＣＩＫ＋０．０４ｔｚｍｏｌ／ＬＩｃｏｔｉｎｉｂ、联合组Ｂ＝ＣＩＫ＋０．０８Ｉｘｍｏｌ／ＬＩｅｏｔｉｎｉｂ、联合组Ｃ＝ＣＩＫ＋０．１６ｉ出ｍｏｌ／Ｌｌｅｏ－ｔｉｎｉｂ；靶细胞为Ａ５４９细胞，联合组Ｄ＝ＣＩＫ＋１．０５斗ｍｏｌ／ＬＩｅｏｔｉｎｉｂ、联合组Ｅ＝ＣＩＫ＋２．１¨ｍｏｌ／ＬＩｅｏ－ｔｉｎｉｂ、联合组Ｆ＝ＣＩＫ十４．２斗ｍｏｌ／ＬＩｅｏｔｉｎｉｂ。④空白对照组（即单独的靶细胞组）：以ＲＰＭＩ．１６４０培养液＋１０％胎牛血清正常培养靶细胞。１．２．３ＭｒＩＴＩ’法检测取对数生长期的ＰＣ９或Ａ５４９细胞，按４Ｘ１０３／孔分别接种于９６孔培养板内，待２４ｈ细胞贴壁后：靶细胞为ＰＣ９细胞的９６孔板内分别加入浓度为１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５斗ｍｏｌ／Ｌ的Ｉｅｏｔｉｎｉｂ；靶细胞为Ａ５４９细胞的９６孔板内分别加入浓度为２４、１２、６、３、Ｉ．５、０．７５ｐ，ｍｏｌ／Ｌ的Ｉｅｏｔｉｎｉｂ；每组６个复孑Ｌ，另设单独的ＰＣ９细胞对照组、单独的Ａ５４９细胞对照组和空白对照组。４８ｈ后终止培养，每孑ＬＪＪＩ入５ｇ／ＬＭｒｒｌｌ２０斗ｌ，继续培养４ｈ，吸出全部上清液，加入ＤＭＳＯ１５０汕ｌ／孔，在平板摇床上摇晃１０ｍｉｎ后，用酶联免疫分析仪测定４９０ｎｍ处的吸光度（ＯＤ值），计算出Ｉｅｏｔｉｎｉｂ对两种靶细胞的半数抑制浓度（ｍｅｄｉａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｏｎｃｅｎｔｒａ．ｔｉｏｎ，ＩＣ，。值）。实验重复至少３次。１．２．４ＣＣＫ８法检测ＣＩＫ细胞及Ｉｅｏｔｉｎｉｂ对肺癌细胞盼杀伤活性１。２．４．１检测ＣＩＫ细胞对肺癌细胞的杀伤活性本实验用ＣＣＫ８试剂盒对ＣＩＫ细胞对肺癌细胞的杀伤活性进行检测。取对数生长期的ＰＣ９或Ａ５４９细胞接种于９６孔板，１０４个／孔，于培养箱中培养。待培养４８ｈ后加入统一效靶比（３０：１）的ＣＩＫ细胞，同时设单独的ＰＣ９细胞对照组、单独的Ａ５４９细胞对照组和单独的ＣＩＫ细胞对照组，每组６个复孑Ｌ。共培养２４ｈ后加人ＣＣＫ８溶液，２０¨Ｌ／孑Ｌ，于孵育箱中继续培养２ｈ后，用酶标仪检测４５０ｎｍ处每孔的

ＯＤ值。计算出ＣＩＫ细胞对肺癌细胞的杀伤活性，杀伤率（％）＝［１一（实验组ＯＤ值一单独的ＣＩＫ对照组ＯＤ值）／单独的ＰＣ９细胞、Ａ５４９细胞对照组ＯＤ值］－Ｘ１００％。实验重复至少３次。１．２．４．２检测Ｉｅｏｔｉｎｉｂ对肺癌细胞的杀伤活性同

上接种靶细胞于９６孔培养板中，１０４爪／孔，于５％ＣＯ：、３７℃孵箱中孵育。待２４ｈ后细胞贴壁，根据不

同的靶细胞加入不同配制好的Ｉｅｏｔｉｎｉｂ，２０肛Ｌ／孑Ｌ，同时设单独的ＰＣ９细胞对照组、单独的Ａ５４９细胞对照组，每组６个复孔。继续放入培养箱中培养４８ｈ

后加入ＣＣＫ８液，２０¨Ｌ／孔，２ｈ后，用酶标仪检测每孔的ＯＤ值，计算出细胞的增殖抑制率（ｃｅｌｌｉｎｈｉｂｉｔｏ．

ｒｙｒａｔｅ，ＣＩＲ）：ＣＩＲ＝（１一实验组ＯＤ值／单独的ＰＣ９细胞、Ａ５４９细胞对照组ＯＤ值）Ｘ１００％。实验重复

至少３次。１．２．４．３检测ＣＩＫ细胞联合Ｉｅｏｔｉｎｉｂ对肺癌细胞的杀伤活性同上接种靶细胞，待细胞贴壁２４ｈ后，

加人不同浓度的Ｉｅｏｔｉｎｉｂ２０肛ｌ／孔，共培养２４ｈ后再

加入同一效靶比的ＣＩＫ细胞（３０：１），标记为联合组。继续培养２４ｈ后加入ＣＣＫ８液２０仙Ｌ／孔，孵育

２ｈ后用酶标仪检测每孔的ＯＤ值。计算ＣＩＲ，公式同上。实验重复至少３次。１．２．４．４ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ／碘化丙啶（ＰｒｏｄｉｕｍＩｏ—ｄｉｄｅ，ＰＩ）双染法检测细胞凋亡本实验用ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ细胞凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡。将处于对数生长期的靶细胞接种于６孔板中，按上述各分组的方法处理并收集各组细胞。参照试剂盒说明书的方法，用结合缓冲液悬浮细胞４００“Ｌ／管，然后分别加入ＡｎｎｅｘｉｎＶ．ＦＩＴＣ、ＰＩ各５斗ｌ，室温避光反

应１５ｍｉｎ后，用流式细胞仪检测靶细胞的凋亡情

况。实验重复至少３次。１．３统计学处理应用ＳＰＳＳ１３．０统计软件分析，

实验数据以石±ｓ表示。ＣＩＫ细胞及Ｉｃｏｔｉｎｉｂ对肺癌

万方数据