外周血染色体制备及分析
人类染色体标本制备及核型分析
4、离心：10分钟（1500转／分），弃上清液，留 下沉淀物。 5、低渗：6～8m1预温37℃的0.075M KCl溶液， 沉淀细胞重重冲散，37℃水浴箱30-35分钟。 6、预固定：1ml新配制的固定剂，轻轻冲打， 37℃水浴箱中静置5分钟。 7、离心：1500转／分离心10分钟，弃上清液。 6．第一次固定：固定液6～8m1，沉淀物轻轻冲 打均匀，37℃水浴箱中静置固定10分钟。 7、第一次离心10分钟(1500转／分)，弃上清液。 8、 重复第6、7步。
八下
8号染色体 • 短臂： 有2条深带，其间有一条较明显的浅带，这是与10 号染色体相区别的主要特征。此臂分为2个区，中段浅带为 2区1号带。 • 长臂： 近侧段可见2-3条分界不明显的深带，远侧段有一 明显而恒定的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1号带。
九苗条
9号染色体着丝粒染色浓。 • 短臂：远侧段可见两条深带，在有的标本上融合成一条深 带。此臂分为2个区，近侧的第1深带为2区1号带。 • 长臂：可见两条明显的深带，次溢痕一般不着色，在有些 标本上呈现特有的狭长“颈部区”。此臂分为3个区，近中 段的一深带为2区1号带，远侧段的一深带为3区1号带。
溢痕远侧的浅带为2区1号带，中段第2深
带为3区1号带，远侧段第3深带为4区1号 带。
二蛇
2号染色体 • 短臂：可见4条深带， 中段的两条深带稍靠 近。此臂分为2个区， 中段第2、3深带之间 的浅带为2区1号带。 • 长臂：可见6-7条深 带，此臂分为3个区， 第2和第3深带之间的 浅带为2区1号带，第4 和第5深带之间的浅带 为3区1号带。
这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。
人类染色体的制备
第3讲
人类外周血淋巴细胞染色体标本制备
5）固定 : 加入6ml固定液，混匀，室温放置10min。
6) 2000r/m 6min, 吸弃上清液。
7) 再固定: 重复5,6 步一次。
第3讲
染色体处于中期
第3讲
人类外周血淋巴细胞染色体标本制备
试剂: 植物血凝素 (PHA ) 刺激外周血淋巴细胞从G0期返回正常细胞周
期。
秋水仙素（colchicine） 作用：阻止微管组装。 1)中期染色体无法排列赤道板。 2)抑制姐妹染色体的分离，将细胞停留在中
第3讲
人类外周血淋巴细胞染色体标本制备
其他试剂：
低渗液 (0.075 mol/L 氯化钾):能使细胞膨胀，便于染色体 分散而易于观察和计数
固定液 (甲醇与冰醋酸按3: 1配制) :稳定染色体的形态结 构，清除染色体外层物质对染色体在玻片上展开的影 响，通过更换固定液2-3次，清除红细胞的碎片，使标 本片的背景更为清晰，现用现配。
。Giemsa染液
第3讲
人类外周血淋巴细胞染色体淋巴细胞的培养
提取血液在含PHA、血清的培养基中培 养 72小时。 1)大多数细胞进入第二细胞周期。 2)实验前4小时加入秋水仙素。 3)实验时，多数细胞停留在中期。
第3讲
人类外周血淋巴细胞染色体标本制备
2.染色体标本制备 1）摇匀培养物，吸取培养物于离心管中。 2）2000r/m 离心 6min(注意配平), 吸弃上清液
。
第3讲
人类外周血淋巴细胞染色体标本制备
3）低渗: 加入预温37℃的 6ml KCl (0.075 M ), 吹打混匀沉淀, 37℃ 水浴 15min，以达到红细胞破裂、淋巴细胞膨胀和染 色体分散的目的。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求， 选择合适的提交方式，如纸质版 或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报 告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与 讨论，对实验结果进行深入探讨 和改进。
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04 外周血淋巴细胞培养注意 事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条 件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的 酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防 止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基 ，如RPMI-1640或DMEM培养基 。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状 态良好时，可以收获用于后续 实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜 通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变 或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实 验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、 抗生素等添加剂，以促进细胞生 长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情 况，记录细胞密度、 形态等指标。
定期进行微生物检测， 确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确 保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
高分辨外周血染色体制备与羊水细胞培养课件
行培养。
染色体分析
经过一定时间的培养后，采用 显微技术对胎儿细胞的染色体
进行分析。
羊水细胞培养的注意事项
适应症与禁忌症
羊水细胞培养适用于产前 诊断，但存在一定的风险 ，需严格掌握适应症和禁 忌症。
并发症
羊水穿刺可能导致感染、 出血、流产等并发症，需 严格消毒并确保操作规范 。
。
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通过羊水细胞培养，可以了解 胎儿的染色体数目和结构，预 测是否存在遗传性疾病风险。
羊水细胞培养是产前诊断的重 要手段之一，有助于优生优育 。
羊水细胞培养的步骤
01
02
03
04
采集羊水
通常在妊娠16-20周进行羊水 穿刺，抽取约20毫升羊水。
羊水处理
将羊水离心后去除上清液，收 集沉淀的胎儿细胞。
细胞培养
高分辨外周血染色体制 备与羊水细胞培养课件
目录
CONTENTS
• 高分辨外周血染色体制备 • 羊水细胞培养 • 高分辨外周血染色体制备与羊水细胞培
养的应用 • 高分辨外周血染色体制备与羊水细胞培
养的挑战与展望
01 高分辨外周血染色体制备
染色体制备的基本原理
01
染色体是细胞核中的遗传物质， 通过染色体制备可以将细胞中的 染色体分离出来，以便进行遗传 学分析和诊断。
结果解读
染色体分析结果较为复杂 ，需由专业医生进行解读 ，并提供遗传咨询。
03 高分辨外周血染色体制备 与羊水细胞培养的应用
在遗传学研究中的应用
遗传疾病研究
高分辨外周血染色体制备与羊水细胞培养技术可用于研究遗传性疾病的发病机 制、基因突变类型和遗传模式，为遗传性疾病的预防和治疗提供科学依据。
外周血染色体制备成功方法的探讨
外周血染色体制备成功方法的探讨近年来，外周血染色体（PBC）技术已成为人类疾病和遗传学研究的重要工具。
然而，收集外周血染色体比其他血液检测和分析技术要困难得多。
因此，有必要探讨有效的收集和准备PBC的方法，并分析其优劣势，以促进PBC技术的发展。
本文详细介绍了PBC的收集和准备技术，并根据技术的复杂性、准确性和效率等指标，对不同技术进行了评估和比较。
其中包括基于普遍分布的FISH技术和基于单克隆抗体的Flow Cytometry技术。
结果表明，FISH在染色效果和准确性方面表现出色，但FISH需要大量时间和器材，耗费巨大，而细胞流式技术不仅可以检测更多标记，而且快速有效，耗费较少。
本文旨在展示PBC收集和准备不同技术的优势和劣势，并为未来的PBC技术发展提供建议。
1.言近年来，外周血染色体（PBC）技术在人类疾病和遗传学研究中发挥着越来越重要的作用，如基因定位和新基因发现，以及性别识别等。
PBC是一种以双束染色体为特点的染色体，它融合了多种研究工具，可以用于分析由染色体亚型组成的蛋白质结构，可以更好地理解基因的功能，有助于诊断和治疗复杂的遗传性疾病。
然而，收集PBC比其他血液检测和分析技术要困难的多，而且收集PBC的方法和技术也相当复杂，因此，有必要探讨有效的收集和准备PBC的方法，以促进PBC技术的发展。
2. PBC准备成功方法的探讨（1）FISH技术：FISH是Fluorescence In Situ Hybridization的简称，它是一种有效的染色体定位技术，可以检测染色体的变化，识别正常和异常染色体。
它通过将特异性的核酸和染料分子结合到染色体上，实现染色体的染色。
这种技术可以有效地使得染色体呈现出色彩鲜艳、明显的双色效果。
优势：FISH技术可以检测多种染色体，包括常见的单倍体、三倍体以及更复杂的染色体变体，染色细节非常清晰，准确性较高，可用于研究许多疾病的机理。
劣势：但FISH技术需要大量的时间和器材，而且耗费巨大，对技术要求较高，容易出现差错。
人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究
人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术的研究近年来，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术受到了研究者们的极大关注，为研究人类基因组的结构、组成、表达、功能以及毒性性质等提供了重要的理论支持。
一、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术1、技术基础：染色体制备技术基于染色体延伸链分析技术，可以在特定细胞类型中获得更多有关人外周血淋巴细胞的信息。
2、实验方法：首先，经过放免定向损伤，用VP-16/Adr真核表达载体PCR形成染色体重组，生成环状染色体；然后，用PCR用LUC7+2分离染色体，形成环染色体；最后，用IMD技术将染色体细化为单个的LUC7+2染色单体，并用Cross-Linking（CL）技术衍生细胞凋亡程序，即可获得高分辨率的染色体。
二、人外周血淋巴细胞的高分辨染色体制备技术的应用1、研究基因表达和表达调节：通过对人外周血淋巴细胞的染色体制备，可以研究基因表达和表达调节机制、调控水平及其功能，有助于研究人体健康和病理状态的机制。
2、研究药物作用：人外周血淋巴细胞的染色体制备技术可以很好的帮助研究中药的作用机制及其药效，为临床治疗使用提供理论依据。
三、未来发展1、对不同类型细胞的染色体制备技术的研究：进一步研究不同细胞的染色体制备技术，提供更多的信息，以更好地研究基因结构和功能。
2、研究不同材料的染色体制备技术：进一步完善不同类型材料染色体（如核酸、细胞类型或体液类型）染色体制备技术，为研究更多的生物信息提供参考。
综上所述，人外周血淋巴细胞高分辨染色体制备技术日益受到研究者们的重视，他们可以利用这项技术研究人体健康状态及病理状态机制、研究药物作用机制和提供理论依据来指导临床治疗，为健康科学发展提供重要理论支撑。
未来，研究将持续着眼不同类型细胞和不同材料染色体制备技术，更加完善技术，帮助研究者更好地了解人体基因组结构、表达、功能和毒性性质的信息。
人类外周血染色体标本制备
整体实验安排：课堂教学主要进行五个独立的实验，包括：人类外周血染色体标本制备；人类染色体Ｇ带标本制备及观察；遗传病基因突变分析（SSCP）；进行性肌营养不良症（DMD）基因检测；人类染色体核型分析实验一1. 人类外周血染色体标本制备1）实验目的：通过实验初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。
2）实验原理：正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。
1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)和其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。
这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。
外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血外周血液中，再在从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞成为外周血干细胞正常人外周血中一般看不见幼稚的干细胞的,只存在有极少量的造血干细胞，其含量为0.01%左右。
如果幼稚细胞的比例大幅增加，有可能是类白血病。
正因为存在0.01%的造血干细胞，可利用细胞分离的技术(血细胞自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者以之代替骨髓而进行的干细胞移植，称为外周血干细胞移植。
外周血培养基配制一、配制用水培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。
按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。
二、培养基培养基有天然、人工两种。
一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。
NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。
实验1人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
实验一人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】(1)了解人类外周血淋巴细胞培养技术。
(2)初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备技术。
【实验原理】在健康成年人外周血淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主。
在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。
但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，简称PHA）的作用可发生转化而重新进行有丝分裂活动。
因此，当该类细胞在人体外经PHA 刺激短期培养后，经秋水仙素（colchicine）处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。
【材料】人外周血【器材与试剂】1、主要器材超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、水平式离心机、高压蒸汽消毒锅、水浴箱、冰箱、离心管、滴管、试管架、酒精灯、载玻片等。
2.主要试剂RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA(浓度5mg/ml)、秋水仙素(浓度4ug/ ml), 肝素(配制浓度:0. 4%)、固定液(甲醇与冰醋酸按3: 1配制) 、低渗液(0.075 mol/L 氯化钾) Giemsa染液(浓度5%)。
【实验步骤】1.取材与细胞培养在无菌条件下抽取静脉血0.5 ml，立即接种于盛有5 ml RPMI-1640培养液的培养瓶中，加入5mg/ml PHA 20-40ul,轻轻将其摇匀后放在37℃恒温培养箱中。
2、培养至68 -70h。
然后加人秋水仙素0.05 ml，继续培养2-4h，即可获得细胞。
3.染色体标本制备(1)将培养物吸入离心管内，以1500-2 000 r/min离心5-10 min，用吸管小心吸弃上清液。
(2)将预温至37℃的低渗液7-8 ml加入离心管中，用吸管混匀后放人37℃水浴箱中低渗处理10-20 min 。
中途混匀一次。
(3)取出离心管，加入1 ml固定液，缓慢混匀，立即离心5-10 min（15 00-2 000 r/min）。
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外周血染色体制备及分析
原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。
外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。
由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：
一、试剂准备
1、0.2%的肝素溶液
2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）
3、0.075mol/Ll氯化钾溶液
4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）
5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）
二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。
置37℃培养箱内培养72小时。
每日早晚定时摇匀培养物1次。
收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml
秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。
摇匀后继续培养 2小时。
三、收获细胞
培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。
1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。
2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。
3、离心以1000转/分钟，离心10分钟
4、固定：吸去上清液，留下沉淀物。
沿离心管壁加入新配固定液6-8ml，混匀，室温放置30分钟。
5、离心以1000转/分钟，离心10分钟
6、重复4、5步骤二遍使细胞经过3次固定，除第一次固定至少需30min外，其余两次固定，每次15或30min均可
7、细胞悬液的制备吸去上清液，加适当固定液，制成浓度适合的细胞悬液备用
8、制片、显带和染色
1）制片：用吸管将细胞悬液轻轻混匀后吸取少量，从10cm高处滴至一端倾斜15°经冰水或20%乙醇浸泡过的无脂玻片上,每篇滴2-3滴,然后在酒精灯火焰上来回通过数次,使其干燥；将制备的染色体标本片置鼓风干燥箱内37℃过夜，取出后自然冷却至室温。
2）显带：染色缸中的45ml生理盐水，加2.5ml浓度为0.25%的胰酶溶液（胰酶最终浓度0.013%）用3%Tris3～5滴调整PH值为6.8－7.0，在37℃预热30分钟，将染色体标本片放入胰蛋白酶溶液中消化（恒温）。
先将一张标本片分成三段进行预消化，以确定最佳消化时间，一般在30秒～1分钟。
3）染色：将消化过的染色体标本片立即放入10%Giemsa染色液中染色5-10分钟；自来水轻轻冲洗3～5秒钟，晾干。
4）核型分析：
显微镜下常规计数20个分裂相，分析3个G带核型，（异常者分析5个）。
如遇到嵌合休加倍计数和分析。