牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达
牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA的原核表达及免疫活性分析
牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA的原核表达及免疫活性分析刘思国;亓英芳;黄瑛;杜艳芬;刘慧芳;赫明雷;司微;倪洪波;王春来【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2009(017)004【摘要】为验证牛分枝杆菌外膜蛋白A是否具有免疫活性,以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板扩增牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA,采用DNA重组技术将此基因片段连于表达载体pGEX6p-1,构建重组质粒pGEX6p-1-ompA,并将其转化到大肠杆菌中BL21(DE3)中,IPTG诱导(终浓度为0.1mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析.用glutathione sepharose 4B纯化蛋白和Western blot分析该蛋白的免疫学活性.结果表明:pGEX6p-1-ompA以可溶形式表达,蛋白分子量大小为60 kDa,与预计大小相符,纯化的蛋白具有良好的免疫学活性.【总页数】4页(P43-46)【作者】刘思国;亓英芳;黄瑛;杜艳芬;刘慧芳;赫明雷;司微;倪洪波;王春来【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;新疆昌吉市动物疾病预防和控制中心,昌吉,831100;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S858.232.618;Q753【相关文献】1.迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究 [J], 张志强;杨楠;李永慧;王洪彬;冯东青;吴同垒;史秋梅;朱国强2.嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因的原核表达及免疫保护性研究 [J], 郑宗林;郑曙明;DelbertM.GatlinIII;汪开毓3.大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白OmpA的原核表达及免疫原性分析 [J], 汪浩;汪玮;许文军;施慧;何杰;谢建军;王庚申4.大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白OmpA的原核表达及免疫原性分析 [J], 汪浩;汪玮;许文军;施慧;何杰;谢建军;王庚申;;;;;;;5.牛分枝杆菌MPB83基因的原核表达及免疫活性分析 [J], 张秀华;刘思国;王春来;郭设平;郭洋;邵美丽;宫强;彭永刚;沈国顺因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分枝杆菌
结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，
简称结核杆菌，首次由德国科学家Robert Koch于 1882年由肺结核病人的痰液中分离得到，并被证实为结 核病的病原菌核杆菌在分类上隶属于放线菌目、分支杆 菌科、分支杆菌属，是种不能运动、不产芽孢、专性需 氧的短小杆菌。菌体-般细长、略弯曲，端极钝圆，多呈 单个或分枝状排列，大小约1-4×0.4μm。
革兰氏染色呈阳性；Ziehl -neelsen抗酸染色呈红色 ，非抗酸性细菌则呈蓝色。结核杆菌的抗酸性主要取决 于其胞壁内所含的分枝菌酸残基，亦和其胞壁固有层的 完整性有关。
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02 治疗性结核病疫苗的种类 2.1 活载体疫苗 2.2 亚单位疫苗 2.3 DNA疫苗 2.4 全菌灭活疫苗 2.5 其他疫苗 03 结核病治疗性疫苗的研究现状 04 结核病治疗性疫苗的展望
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04 展望
结核疫苗快速发展，并能对致病性结核杆菌产 生保护性免疫应答，为TB的防治带来了希望。然而， 迄今还没有一个重组疫苗能达到BCG的免疫水平。 其原因在于，重组疫苗虽可激活免疫系统，但不能 引起长期特异性的细胞免疫记忆，所以开发一种与B CG协同的、可产生长效免疫应答的疫苗十分重要。 初免-加强免疫策略的出现，有效联合了BCG与新型 结核疫苗，为预防结核、诱导机体产生长期免疫保 护作用提供了可能。
等
MTB肝素结合血凝
素
DNA疫苗
HG85 A/B
临床前 中国人民解放军军事 嵌合 DNA疫苗 A 医学科学院（吴雪琼） g85A/Ag85B 等
蝴蝶兰花瓣瞬时转化体系建立
蝴蝶兰花瓣瞬时转化体系建立孟妮;刘雅莉;窦雪溪;刘红利;李方殷【摘要】蝴蝶兰花器官中基因功能的研究受遗传转化效率低和遗传转化周期长的制约,而花瓣瞬时表达体系是一种快速分析基因功能的有效手段.该研究以蝴蝶兰'大辣椒'花瓣和萼片为实验材料,通过农杆菌介导的瞬时转化方法,分析了侵染的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等4个因素对β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因表达效率的影响,以探寻其瞬时表达的最佳条件;并将查尔酮合成酶( chalcone synthase ,CHS )基因RNAi干扰载体瞬时转化蝴蝶兰花瓣,共培养3 d 后观察转化材料中花色表型以及色素的变化,并利用半定量 RT-PCR来检测C H S 基因转录水平的表达.结果表明:(1 )农杆菌菌液 OD600为0 .6 、侵染时间60 s ,在重悬液中添加150 μmol/L乙酰丁香酮,共培养3 d ,GUS瞬时表达率最高(85 .01%) . (2)转基因蝴蝶兰花瓣颜色明显变淡,色素含量降低. (3)半定量PCR检测表明,C H S基因的转录活性相比于对照组显著降低.该实验成功的在蝴蝶兰花器官中建立了一种快速基因功能验证方法,为后期蝴蝶兰基因功能研究和育种工作提供技术支持.%The study of gene function in Phalaenopsis aphrodite is hampered by the low efficiency of trans-formation systems and the long time span needed for the generation of transgenic plants.Therefore ,the es-tablishment of transient expression system of Phalaenopsis aphrodite petals will be an effective method for gene function analysis.An experiment was conducted to investigate the transient expression mediated by Agrobacterium tumefaciens using the sepals and petals of Phalaenopsis aphrodite (P.'Big chili'). Effects of A.tume faciens concentration ,infection time ,acetosyringone concentration ,and co-culture length on the transient expression of β-glucuronidase(GUS)gene were analyzed to determine the optimal transfor-mation condition.The chalcone synthetase gene RNAi interference vector was transiently transformed into the petals of Phalaenopsis aphrodite.After 3 days of co-cultivation ,changes in the phenotype and pig-mentation of the flower color were observed ,and RT-PCR was used to detect the expression level of CHS gene transcription.(1)A higher transient expression level of GUS gene could be obtained as OD600 value of A.tume faciens 0.6 ,infiltrating for 60 seconds ,adding 150 μmol/L acetosyringone to co-culture medium , and co-culture for 3 days in darkness.It reaches 85.01%.(2)The color of the petals of transgenic Phalae-nopsis aphrodite was significantly lighter and pigment content decreased.(3 ) Semi-quantitative PCR showed that the transcriptional activity of CHS gene was significantly lower than that of the control group.The experiment successfully established a rapid gene function verification method ,providing techni-cal support for the study of gene function and breeding work of the Phalaenopsis aphrodite.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2018(038)006【总页数】7页(P1017-1023)【关键词】蝴蝶兰;花器官;农杆菌转化;GUS;瞬时表达【作者】孟妮;刘雅莉;窦雪溪;刘红利;李方殷【作者单位】西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)是兰科蝴蝶兰属的花卉，因其花色艳丽，形似蝴蝶，花期持久，深受人们喜爱，被誉为“兰花皇后”，具有极高的科研、观赏、生态和经济价值[1]。
第15章分枝杆菌
第15章分枝杆菌表15-1 分枝杆菌的分类分类生长速度菌落和色素产生代表菌种致病性结核分枝杆菌复合群生长缓慢结核分枝杆菌、牛分枝杆菌结核病非结核分枝杆菌RunyonⅠ组生长缓慢菌落不见光时为淡黄色,光照后则变为黄色或橙色堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海分枝杆菌(M. marinum ) 肺结核样病变；皮肤丘疹、结节与溃疡RunyonⅡ组在37℃生长缓慢在暗处培养时菌落呈橘红色瘰疠分枝杆菌(M. scrofulaceum)儿童淋巴结炎RunyonⅢ组40～42℃下生长慢通常不产生色素鸟-胞内分枝杆菌(M.avium)结核样病变，多见于肺与肾RunyonⅣ组在25～45℃快速生长。
培养5～7天即可见到菌落个别种产生色素偶发分枝杆菌(M.fortuitum)极少致病麻风分枝杆菌人工培养基上不生长麻风第一节结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是结核病的病原菌。
该菌可侵1/3感染了结核分枝杆菌。
特别是近年来世界范围内艾滋病的流行，结核病作为最多见的一种机会性感染，成为HIV阳性者死亡的主要原因，因此，结核病已成为全球重大公共卫生问题。
一、生物学性状（一）形态与染色在感染的组织中，结核分枝杆菌细长且直，大小约0.4×3 m（图15-1）；在人工培养基上，不同种呈现丝状、球状、串珠状等多形性。
由于结核分枝杆菌细胞壁中含有大量的脂质，不易着色，一旦被碱性染料着色后能够抵抗盐酸乙醇（含95%的乙醇和3%的盐酸）的脱色作用，被定性为抗酸菌（acid-fast bacteria），一般不用革兰染色法分类为革兰阳性或革兰阴性。
常用齐尼抗酸染色法（Ziehl-Neelsen acid-fast stain），以5%石碳酸复红加温染色后再经3%盐酸乙醇脱色，结核分枝杆菌被染成红色，而其他非抗酸菌及背景则被美蓝复染呈蓝色。
此外，结核分枝杆菌在药物如异烟肼的影响下，亦可变为抗酸染色阴性。
图15-1 痰标本中的结核分枝杆菌（箭头所指）（Brooks et al, 2004）（二）培养和生长特性结核分枝杆菌的初代分离培养应使用选择和非选择培养基。
牛分枝杆菌系统进化及鉴定-欧喜超
性肝肾损伤，随后异烟肼被吡嗪酰胺和乙胺丁醇替代治疗，3周后出院，两个月后病人去世。
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病案分析
2002年，在患者居住的农场，一只屠宰的病牛肺组织上发现结核分枝杆菌， 流行病学调查发现上述患者也在同一时间因结核病离世。基因分型结果显示 两株分枝杆菌具有相同的基因型。
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牛分枝杆菌传统鉴定方法
1、生化鉴定
6
➢ 枝杆菌感染患者1例，占全部患者的0.32%（1/313）。
牛分枝杆菌在复合群菌株进化中的位置
M. bovis M. tuberculosis
人型结核分枝杆菌起源于牛型结核分枝杆菌？？？
7
全基因组序列图
1998年,首次完成了人结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列图，牛结核杆 菌 的全基因组序列于2003年完成，牛分枝杆菌全基因组序列较结核分枝杆菌小得 多。
2
牛结核分枝杆菌
➢ 1882年，德国科学家Koch发现结核病的病原菌结核分枝杆菌， 1898年， Smith 通过 ➢ 培养特征的差异将结核分枝杆菌和牛分枝杆菌区分开来。 ➢ 结核分枝杆菌为细长略带弯曲，牛分枝杆菌较粗短。 ➢ 牛分枝杆菌生长缓慢，专性需氧，初次分离培养时， ➢ 需36-37℃培养5-8周可出现菌落（推荐观察10-12 周）。 ➢ 结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的培养温度均为37℃～ ➢ 38℃。培养时最适pH值，结核分枝杆菌为7.4～8.0， ➢ 牛分枝杆菌为5.9～7.4。 ➢ 从标本内分离牛分枝杆菌或作为本菌的传种及保存 ➢ 需使用丙酮酸钠培养基（丙酮酸钠替代丙三醇）。 ➢
MTB和牛分枝杆菌均存在16s rRNA、Rv0577和ISl561 DNA片段，而牛 分枝杆菌缺失Rvl510、Rvl970和Rv3120基因。
20 20
牛分枝杆菌三重PCR检测方法的建立
牛分枝杆菌三重PCR检测方法的建立钱爱东;王建;王春芳【摘要】For developing the multiplex PCR of Mycobacterium bovis detection, the genomic DNA was extracted from M. bovis ValleeⅢ strain, the recA, IS6110 and IS1081 gene were amplified with 3 pairs of specific primers by PCR. The PCR products were approximately 860 bp, 520 bp and 340 bp, respectively. The BLAST sequential analysis indicated that the nucleotide sequence homology with recA, IS6110 and IS1081 gene of M. bovis AF2122/97 reached 99％ respectively. Moreover,the recA-IS6110-IS1081 gene triple PCR was constructed. The sensitivity ofrecA, IS6110 and IS1081 gene PCR were 585 fg, 19.5 fg and 19.5 fg respectively, the specificity tests showed that there were no cross reacted with other bacteria. These results could be serve as a basis for further studies on the recA, IS6110 and IS1081 genes and their application in diagnosis of tuberculosis.%为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的三重PCR方法,本研究以M bovis ValleeⅢ株染色体DNA 为模板,分别以其recA、IS6110、IS1081基因特异性引物进行PCR扩增,建立检测M.bovis的recA-IS6110-IS1081三重PCR 反应.通过PCR扩增获得大小约为860 bp、520bp和340 bp的DNA片段.BLAST序列分析表明,这3个基因片段与GenBank中登录的相关基因的核苷酸序列同源性均达到99%.同时,recA、IS6110和IS1081PCR扩增的敏感性分别达到585fg、19.5fg和19.5fg.特异性较强,只有M.bovis和人结核临床分离株扩增反应为阳性,为进一步研究recA、IS6110和IS1081基因以及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)006【总页数】4页(P479-482)【关键词】牛分枝杆菌;recA基因;IS6110基因;IS1081基因;三重PCR【作者】钱爱东;王建;王春芳【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】S852.65牛结核病(Bovine tuberculosis)主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患传染病[1]。
结核分枝杆菌
（1）原发感染
结核分枝杆菌 侵入肺泡 被肺泡中 吞噬细胞吞噬 在吞噬细胞内繁殖 导致 巨噬细胞裂解释放出的细菌 释放出大量细 菌在肺泡内引起渗出性炎症即为原发性灶。细菌 随淋巴管到达肺门淋巴结，引起淋巴结肿大称原 发综合征 感染3-6周，机体产生特异性细胞免疫，同 时也产生迟发超敏反应
机体免疫力低下时，原发感染灶恶化，结核 分枝杆菌经气管淋巴道或血流播散，形成全身性 粟粒性结核 。 当机体抵抗力强时，使感染灶形成结核结节。 淋巴结病灶逐渐纤维化和钙化，不治自愈。但病 灶内常有一定量的细菌长期潜伏，不断刺激机体 产生免疫。也可成为以后内源性感染的来源
2 肺外感染 结核杆菌可经血液循环引起肺外感染， 如脑、肾、结核，痰被咽入可引起肠结核、 结核性腹膜炎等。一般认为血中播散的大 多是L细菌
(三) 免疫性 人类对结核分枝杆菌的感染率甚高，但发病率 不高。这表明人体对结核分枝杆菌有相当强的 免疫力。 （1）结核的免疫为有菌免疫或称传染性免疫 。这种免疫系指结核分枝杆菌(或BCG) 进入机 体后使机体对细菌再次入侵有免疫力；而当细 菌或其成分从体内彻底消失后机体的免疫力也 随之消失。遗传因素决定对结核病的易感染性 ， HLA-Bw15为易感个体。
（三）抵抗力 结核分枝杆菌因细胞壁含有大量脂类，故对 理化因素抵抗力较强。耐干燥，在干燥的痰内 可存活6-8个月。含有结核分枝杆菌痰液的尘埃 经8-10d仍有传染性。此菌对化学消毒剂的抵抗 力也较一般细菌强，在3%HCl或6%H2SO4中不被杀 死。因此常用于处理有杂菌污染的检材，以便 进行分离培养。对湿热敏感，60℃30min可杀死 细菌；在70%-75%乙醇中数分钟即被杀死 ，对 紫外线敏感
牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析
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பைடு நூலகம்
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牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达宫强1,刘思国2 (1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150001
)
摘要 [目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD2NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85bDNA疫苗奠定了基础。关键词 牛分枝杆菌;ag85b基因;克隆;表达中图分类号 S858.23 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)21-08908-02
TransientExpressionofMycobacteriumbovisag85bGeneGONGQiangetal (FoodandBioengineeringCollege,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003)Abstract [Objective]TheresearchaimedtoprovidereferencesfortheDNAvaccinedevelopmentofbovinetuberculosis.[Method]Theag85bgenefrag2mentamplifiedbyPCRfromMycobacteriumboviswasclonedintotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+),therecombinantplasmidpcAg85Bwasobtained.ThentherecombinantplasmidwastransfectedintoSP2/0cellsinvitro.IndirectimmunofluorescencewasusedtodetecttheexpressionoftargetproteininSP2/0cellstransfectedbypcAg85B.[Result]IndirectimmunofluorescencewhichusedtodetecttheexpressionoftargetproteinshowedSP2/0cellstransfectedbypcAg85Bappearedfluorescence.Sothetargetproteinhadbeensuccessfullyexpressed.[Conclusion]Thisstudylaidafoundationforag85bgeneDNAvaccineofMycobacteriumbovis.Keywords Mycobacteriumbovis;ag85bgene;clone;expression
作者简介 宫强(1979-),男,山东泰安人,博士,讲师,从事动物病原分子生物学研究。收稿日期 2008204218
牛结核病是一种严重危害人畜健康的传染病,然而目前仍无一种疫苗可用于该病的预防[1]。传统的卡介苗(BCG)由于会干扰牛结核病的检疫,并不适用于预防该病[2]。因此,研制针对牛结核病的新型疫苗对于该病的预防和开发人结核病新型疫苗无疑具有重要的意义。该研究构建了牛分枝杆菌分泌蛋白基因ag85b的真核表达质粒pcAg85B,对其在SP2/0细胞中的表达进行了研究,为牛结核病DNA疫苗的研制奠定了一定的基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与细胞。牛分枝杆菌ValleeⅢ菌株购自中国兽医药品监察所;大肠杆菌感受态细胞TG1和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室细菌室(以下简称细菌室)保存。1.1.2 载体。质粒pET32a+和pcDNA3.1(+)由细菌室保存。1.1.3 试剂。TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶KpnI、EcoRⅠ、T4DNA连接酶及DL2000Marker购自大连宝生物工程公司,脂质体2000为Invitrogen公司产品,羊抗兔IgG2HRP和IgG2FITC为北京中杉金桥公司产品。1.2 方法1.2.1 重组质粒构建。设计合成牛分枝杆菌ag85b基因引物,以牛分枝杆菌ValleeⅢ全基因组DNA为模板,PCR扩增ag85b基因,引物序列如下,PU:5′2GTGGGGAATTCC2TAGCCGGCGCCTAACGAAC23′;PL:5′2GCGCGGTACCATGA2CAGACGTGAGCCGAAAG23′。PCR产物回收后以EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切,连接到真核载体pcDNA3.1(+)的相应位点,转化大肠杆菌感受态细胞TG1,抽提质粒酶切鉴定,阳性重组质粒命名为pcAg85B,进行序列测定。1.2.2 重组质粒的转染。将处于对数生长期的SP2/0细胞于转染前1d接种于24孔细胞培养板中,在5%CO2、37℃下孵育至细胞融合度约80%,取2μl脂质体2000和0.8μg重组质粒pcAg85B在200μl细胞培养液中充分混匀,室温作用20
min,加入800μl新鲜的完全培养液,混匀后加入细胞培养板中,37℃、5%CO2培养72h。设转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞为阴性对照。1.2.3 Ag85B兔抗血清的制备。将ag85b
基因连接原核表
达载体pET32a+构建重组质粒pET32a
+2ag85b,转化入大肠
杆菌感受态细胞,诱导表达并纯化重组蛋白,用纯化的蛋白与矿物油混合制成疫苗免疫兔子,采用背部多点注射,共免疫3次,每次间隔2周,间接ELISA方法检测抗体效价后-20
℃保存备用。1.2.4 重组质粒的表达。转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞培养72h后,用70%的乙醇室温固定30min,加入1∶40
稀释的兔抗Ag85B血清,37℃湿盒内作用1h,加入1∶100稀释的含1%伊文斯兰的FITC标记的山羊抗兔IgG,湿盒内37
℃作用1h,洗涤后滴加碱性甘油,倒置显微镜下观察结果[3]。2 结果与分析2.1 重组质粒pcAg85B的构建 将PCR扩增的牛分枝杆菌ag85b基因(图1A)克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上构建重组质粒,命名为pcAg85B,并进行双酶切鉴定,结果如图1B
所示。2.2 间接免疫荧光分析 转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞在倒置显微镜下可见到均匀的绿色荧光,表明该重组质粒在SP2/0细胞中获得了表达,所表达的蛋白可与兔抗Ag85B多抗发生特异性结合,而pcDNA3.1(+)转染的SP2/0细胞中无荧光出现,此结果表明牛分枝杆菌ag85bDNA能进入真核细胞并表达目的蛋白(图2)。3 结论与讨论Ag85B蛋白又称为MPB59,是牛分枝杆菌Ag85复合物中的一种主要成分,最早在结核杆菌和卡介苗(BCG)的培养滤液中发现。牛分枝杆菌在侵入机体后可分泌大量的Ag85B
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(21):8908-8909 责任编辑 张彩丽 责任校对 傅真治蛋白,诱导细胞免疫,产生IFN2γ,其诱导的细胞免疫应答在抵抗牛分枝杆菌再次感染中具有重要作用[4]。该试验构建了真核表达质粒pcAg85B,并转入SP2/0细胞中进行了表达,
结果表明ag85b基因能成功在真核表达系统中表达相应蛋白,从而为研究牛分枝杆菌ag85bDNA疫苗奠定基础。
注:A与B中M为DL2000Marker,A中1与2为ag85b扩增产物,B
中1为pcAg85BKpnⅠ/EcoRⅠ消解的鉴别。Note:MinbothChartAandChartBisDL2000Marker;1and2inChartAaretheamplifiedproductsofag85bgene;1inChartBisthei2dentificationofpcAg85BbyKpnⅠ/EcoRⅠdigestion.图1 ag85b基因的PCR扩增(A)与酶切鉴定(B)
Fig.1 PCRamplificationandenzymedigestionidentificationofag85bgene
注:A为pcAg85B转染SP2/0细胞,B为pcDNA3.1(+)转染细胞。Note:A,SP2/0cellstransfectedbypcAg85B;B,SP2/0cellstransfectedbypcDNA3.1(+).图2 ag85b基因转染SP2/0细胞的免疫荧光结果Fig.2 Theimmunofluorescenceresultsofag85bgenetransfectedin2toSP2/0cells参考文献
[1]BUDDLEBM,SKINNERMA,WEDLOCKDN,etal.Newgenerationvac2cinesanddeliverysystemsforcontrolofbovinetuberculosisincattleandwildlife[J].VetImmunolImmunopathol,2002,87:177-185.[2]BRANDTL,CUNHAJF,OLSENAW,etal.FailureoftheMycobacterium
bovisBCGVaccine:SomespeciesofenvironmentalMycobacteriablockmulti2plicationofBCGandinductionofprotectiveimmunitytotuberculosis[J].InfectImmun,2002,70:672-678.[3]JUW,LIUJY,YUYL.ExpressionofHSP65fromMycobacterialtuberculosis
ineukaryoticcellsystem[J].JImmunol,2005,21:216-217.[4]KAMATHAT,FENGCG,MACDONALDM,etal.Differentialprotectiveef2ficacyofDNAvcaccineexpressingsecretedproteinsofMycobacteriumtuberculo
2
sis[J].InfectImmun,1999,67:1702-1707.
(上接第8869页)预报x1的因子是{x72,x8×x9},预报x2的因子是{x
10,x11,
x72,x4×x8,x7×x10,x5×x11},预报x3的因子是{x4×x8,x4