菌种鉴定的方法
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
香菇菌种检验实验报告
一、实验目的 1. 了解香菇菌种的生物学特性。 2. 掌握香菇菌种检验的基本方法。 3. 通过实验，提高对香菇菌种的认识和鉴定能力。 二、实验原理 香菇（Lentinula edodes）是一种广泛栽培的食用菌，具有较高的营养价值和药用价值。香菇菌种检验是香菇栽培过程中的重要环节，通过检验可以筛选出优质、高产的香菇菌种。本实验采用显微镜观察和菌落特征比较等方法对香菇菌种进行检验。
三、实验材料 1. 香菇菌种：市售香菇菌种。 2. 实验仪器：显微镜、培养皿、无菌操作台、无菌水、酒精灯、镊子、刀片等。 3. 实验试剂：10%氢氧化钾溶液、乳酸酚棉蓝染色液等。 四、实验方法 1. 香菇菌种活化 将市售香菇菌种接种于PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养5-7天，待菌丝长满培养基表面后，备用。
2. 显微镜观察 取少量香菇菌丝，用无菌刀片切下，放入10%氢氧化钾溶液中处理1-2分钟，然后用无菌水清洗，制成临时装片。在显微镜下观察菌丝的形态、颜色、粗细等特征。
3. 菌落特征比较 将活化后的香菇菌种接种于PDA培养基上，在25℃恒温培养箱中培养，观察菌落形态、颜色、边缘、质地等特征。
4. 菌种鉴定 根据显微镜观察和菌落特征，对香菇菌种进行鉴定。 五、实验结果与分析 1. 显微镜观察结果 香菇菌丝为白色，有横隔，菌丝粗细均匀，菌丝表面有微小的疣状突起。菌丝横隔处可见明显的膨大。
2. 菌落特征比较结果 香菇菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，颜色为白色至淡黄色。菌落质地致密，不易挑起。
3. 菌种鉴定结果 根据显微镜观察和菌落特征，该香菇菌种为Lentinula edodes。 六、实验结论 通过本实验，我们成功地对香菇菌种进行了检验。显微镜观察和菌落特征比较是鉴定香菇菌种的有效方法。在香菇栽培过程中，选择优质、高产的香菇菌种对于提高产量和品质具有重要意义。
七、实验讨论 1. 实验过程中，无菌操作至关重要，避免污染。 2. 显微镜观察和菌落特征比较是鉴定香菇菌种的基本方法，但在实际操作中，还需结合菌种的生长速度、产量、抗病性等多方面因素进行综合评价。
菌种鉴定方法
1. 菌落形态观察观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。
2. 革兰氏染色按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。
3. 鞭毛染色挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。
滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。
自然干燥后用油镜观察。
菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。
4. 糖类分解试验将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。
如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。
培养基仍呈蓝色，说明未产酸。
选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。
5. 吲哚（靛基质）试验将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。
于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。
6. 淀粉水解试验将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。
将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。
9. V－P试验将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。
数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。
10.甲基红（M.R）试验接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。
11. 柠檬酸盐利用试验将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
addgene质粒鉴定方法 -回复
addgene质粒鉴定方法-回复Addgene质粒鉴定方法引言：在分子生物学实验中，质粒常用于基因克隆、基因表达和遗传转化等研究。
为了保证实验的可靠性和结果的准确性，对于所使用的质粒进行鉴定是至关重要的。
Addgene是一个非营利性的生命科学研究资源库，为全球科学界提供各类质粒。
本文将介绍Addgene质粒鉴定的方法，帮助科研人员准确、可靠地使用Addgene中的质粒。
一、菌种鉴定1. 培养样品中含有质粒的菌株。
Addgene质粒资源库提供的质粒常以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株，因此在使用之前需要确认宿主菌株的鉴定结果。
2. 菌株的培养和扩增。
从低温保存的菌种中挑取一部分菌落，接种到含有适当抗生素的LB （Luria-Bertani）培养基中。
培养至菌落生长形成后，进行菌株的扩增。
3. 菌株鉴定方法。
常见的菌株鉴定方法包括形态特征观察、生理生化试验和分子生物学方法。
菌株形态特征观察主要包括菌落形状、色素产生和荧光等。
生理生化试验则通过菌株对特定试剂的反应，如碳源利用测试、酶活性检测等，来判断菌株的种属。
分子生物学方法则利用特定的引物和PCR扩增技术检测菌株的特定基因片段，进行鉴定。
二、质粒鉴定1. DNA提取将质粒DNA提取出来，可采用常规的DNA提取试剂盒进行提取，也可以使用自制的提取方法。
2. 琼脂糖凝胶电泳将提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，通常选择1琼脂糖凝胶进行分离。
加入DNA电泳缓冲液和DNA加载缓冲液后，将DNA样品加载到琼脂糖凝胶孔中，接通电源进行电泳。
3. DNA转印将电泳后的DNA迁移到合适的膜上，如尼龙膜（nylon membrane）或硝酸纤维膜（nitrocellulose membrane）。
4. DNA固定和杂交用含有标记DNA探针的杂交液（例如荧光标记的探针或放射性同位素标记的探针）将DNA固定在膜上，然后在适当的条件下进行固定与杂交。
菌种鉴定的依据
菌种鉴定的依据
菌种鉴定是指通过对菌株的形态学、生理生化特征、生态习性以及分子生物学特征等方面的分析，确定菌株的种属分类和亚种分类。
菌种鉴定的依据主要包括以下几个方面：
1. 形态学：包括菌落形态、菌丝形态、孢子形态、染色反应等
方面的特征。
通过比较菌株的形态学特征，可以初步确定其种属分类。
2. 生理生化特征：包括菌株生长速度、营养需求、代谢产物等
方面的特征。
通过比较菌株的生理生化特征，可以进一步确定其种属分类和亚种分类。
3. 生态习性：包括菌株的生境、生长条件、寄主等方面的特征。
通过比较菌株的生态习性，可以确定其种属分类和亚种分类，并推测其在自然界中的分布和生态功能。
4. 分子生物学特征：包括菌株的DNA序列、蛋白质结构等方面
的特征。
通过比较菌株的分子生物学特征，可以准确地确定其种属分类和亚种分类，并建立菌株间的进化关系。
综上所述，菌种鉴定的依据主要包括形态学、生理生化特征、生态习性和分子生物学特征等方面的特征。
通过综合比较这些特征，可以准确地确定菌株的种属分类和亚种分类，为菌种鉴定提供科学依据。
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3种方法对1株临床疑难菌的鉴定及结果比较
㊃4221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n,M a y2024,V o l.21,N o.9㊃论著㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2024.09.0083种方法对1株临床疑难菌的鉴定及结果比较*许一丹1,谢成彬2,苏喆2,王频佳1ә1.成都医学院检验医学院临床微生物学教研室,四川成都610500;2.四川省妇幼保健院/成都医学院附属妇女儿童医院检验科,四川成都610045摘要:目的通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA L D I-T O F M S)㊁16S r R N A序列分析和全基因组测序(WG S)对从临床标本中分离的1株疑似盐单胞菌进行菌种鉴定,比较3种方法的鉴定结果㊂方法采用MA L D I-T O F M S对待测菌进行蛋白质图谱收集,通过比对图谱特征峰实现菌种鉴定;对菌株进行16S r R N A基因测序,将测序结果与数据库比对;待测菌WG S后进行序列比对分析,具体包括使用A N I m和A N I b2种方法计算平均核苷酸一致性(A N I)以及与基因组分类数据库(G T D B)进行比对;基于全基因组序列中的16S r R N A序列和看家基因序列构建系统进化树,以及基于C O G和K E G G功能对基因组进行聚类分析㊂结果 MA L D I-T O F M S对待测菌株的鉴定结果是H a l o m o n a s h a m i l t o n i i;经16S r R N A序列分析,发现待测菌株与3种盐单胞菌(H a l o m o n a s h a m i l t o n i i㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i和H a l o m o n a s j o h n s o n i a e)的相似度均> 99%,且相似度差异非常小,因此无法进行准确的菌种鉴定;基于WG S的基因序列比对㊁系统发育树㊁聚类分析均显示待测菌与H a l o m o n a s s t e v e n s i i的亲缘关系更为接近㊂结论3种方法对分离的1株疑难菌的菌种鉴定结果有差异,MA L D I-T O F M S的菌种鉴定操作更加方便㊁快速,非常适用于临床检验工作;基于WG S的细菌鉴定更适合用于遗传特征相似的菌种之间的鉴别㊂关键词:细菌鉴定;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;16S r R N A序列;全基因组测序中图法分类号:R446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)09-1224-06I d e n t i f i c a t i o n o f a c l i n i c a l l y d i f f i c u l t b a c t e r i a l s t r a i n b y t h r e em e t h o d s a n d c o m p a r i s o n o f r e s u l t s*X U Y i d a n1,X I E C h e n g b i n2,S U Z h e2,WA N G P i n j i a1ә1.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y,S c h o o l o f M e d i c a l L a b o r a t o r y S c i e n c e,C h e n g d u M e d i c a lC o l l e g e,C h e n g d u,S i c h u a n610500,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e,S i c h u a nP r o v i n c i a l M a t e r n i t v a n d C h i l d H e a l t h C a r e H o s p i t a l,C h e n g d u,S i c h u a n610045,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e MA L D I-T O F M S,16S r R N A s e q u e n c e a n a l y s i s,a n d w h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g (WG S)w e r e a p p l i e d t o i d e n t i f y a s t r a i n o f s u s p e c t e d H a l o m o n a s i s o l a t e d f r o m a c l i n i c a l s p e c i m e n a n d t o c o m-p a r e t h e r e s u l t s o f t h e t h r e e m e t h o d s.M e t h o d s MA L D I-T O F M S w a s u s e d t o c o l l e c t p r o t e i n p r o f i l e s o f t h e b a c t e r i a t o b e t e s t e d,a n d t h e i d e n t i f i c a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s w a s a c h i e v e d b y c o m p a r i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c p e a k s o f t h e p r o f i l e s.T h e16S r R N A g e n e s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d o n t h e b a c t e r i a t o b e t e s t e d,a n d t h e s e-q u e n c i n g r e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h d a t a b a s e.B a s e d o n t h e g e n o m i c s e q u e n c e s o b t a i n e d f r o m WG S,a c o m-p a r a t i v e a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d,i n c l u d i n g t h e c a l c u l a t i o n o f A v e r a g e N u c l e o t i d e I d e n t i t y(A N I)b y A N I m a n d A N I b,a n d t h e c o m p a r i s o n w i t h t h e G e n o m e T a x o n o m y D a t a b a s e(G T D B).P h y l o g e n e t i c t r e e s w e r e c o n s t r u c-t e d b a s e d o n16S r R N A s e q u e n c e s a n d h o u s e k e e p i n g g e n e s e q u e n c e s f r o m WG S,a s w e l l a s c l u s t e r a n a l y s i s b a s e d o nC O G a n d K E G G f u n c t i o n s.R e s u l t s MA LD I-T O F M S r e s u l t e d i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s t r a i n t o b e t e s t e d a s H a l o m o n a s h a m i l t o n i i.T h e16S r R N A g e n e s e q u e n c e c o m p a r i s o n r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e s i m i l a r i-t y b e t w e e n t h e b a c t e r i a t o b e t e s t e d a n d t h e t h r e e H a l o m o n a s s p e c i e s(H a l o m o n a s h a m i l t o n i i,H a l o m o n a s s t e v e n s i i a n d H a l o m o n a s j o h n s o n i a e)w e r e a l l a b o v e99%,a n d t h e d i f f e r e n c e i n t h e i r s i m i l a r i t y w a s s o s m a l l t h a t a c c u r a t e s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n c o u l d n o t b e p e r f o r m e d.T h e g e n e s e q u e n c i n g c o m p a r i s o n b a s e d o n WG S, p h y l o g e n e t i c t r e e a n d c l u s t e r a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e b a c t e r i u m w a s m o r e c l o s e l y r e l a t e d t o H a l o m o n a s s t e v e n s i i.C o n c l u s i o n T h e r e s u l t s o f t h e t h r e e m e t h o d s o n t h e s t r a i n i d e n t i f i c a t i o n o f t h e i s o l a t e a r e d i f f e r e n t.*基金项目:四川省大学生创新创业训练计划项目(S202013705085);成都医学院研究生创新基金项目(Y C X2022-03-17);成都医学院检验医学院自然科学基金(J Y Z K202206);四川省妇幼保健院菁英人才科研启动项目(Z C6.16)㊂作者简介:许一丹,女,在读研究生,主要从事细菌致病性的研究㊂ә通信作者,E-m a i l:p i n j i a w o n g@f o x m a i l.c o m㊂MA L D I-T O F M S i s m o r e c o n v e n i e n t a n d f a s t f o r s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n,w h i c h i s v e r y s u i t a b l e f o r c l i n i c a l t e s-t i n g;WG S-b a s e d b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n i s p a r t i c u l a r l y u s e f u l f o r d i s t i n g u i s h i n g g e n e t i c a l l y v e r y s i m i l a r s p e-c i e s.K e y w o r d s:b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n; MA L D I-T O F M S;16S r R N A s e q u e n c e; w h o l e-g e n o m e s e q u e n-c i n g细菌的准确鉴定是细菌学中最重要㊁最具挑战性的问题之一,也是抗感染治疗的基础㊂细菌鉴定的方法有很多种,常用的包括形态学鉴定㊁生化鉴定和分子生物学鉴定等㊂由于基于生化鉴定原理的自动微生物鉴定仪早在1985年就进入我国临床实验室,并从20世纪90年代至今广泛用于临床标本的检测,因此细菌生化鉴定是目前临床最常用的细菌鉴定方法[1-3]㊂但由于细菌的种类繁多,存在多样性和复杂性,选择的生化鉴定特征可能难以代表全部被鉴定菌株,特别是临床少见菌㊁罕见菌和未明确分类的细菌,生化鉴定往往难以发挥作用㊂本课题组前期从临床标本中分离出1株细菌,经生化鉴定疑似为盐单胞菌(H a l o m o n a s),但无法准确鉴定其菌种㊂针对这株疑难菌,本研究将利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(M A L D I-T O F M S)㊁16S r R N A序列分析和基于全基因组测序(W G S)的基因组序列比对3种方法进行菌种鉴定,并对鉴定结果进行比较㊂现将结果报道如下㊂1材料与方法1.1菌株来源2018年7月从四川省妇保健院新生儿重症监护室的1例患儿血液标本中分离出1株革兰阴性菌,生化鉴定结果显示该菌疑似为盐单胞菌属的细菌,菌株编号为18071143㊂1.2主要试剂和仪器哥伦比亚血琼脂平板(郑州博赛生物技术股份有限公司),A u t o f m s1000全自动微生物质谱检测系统(郑州安图生物工程股份有限公司)㊂1.3方法1.3.1菌株培养将受试菌株18071143接种于哥伦比亚血琼脂平板,35ħ培养24~48h,再次转种于哥伦比亚血琼脂平板,35ħ培养18~24h,挑取纯菌,按照实验要求进行后续的MA L D I-T O F M S检测㊁16S r R N A测序分析以及基因序列比对㊂1.3.2 MA L D I-T O F M S检测按照仪器说明书操作[4]步骤进行操作㊂1.3.316S r R N A序列分析16S r R N A基因测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成㊂将测序所得的16S r R N A序列输入E Z B i o C l o u d细菌16S鉴定数据库(h t t p s://w w w.e z b i o c l o u d.n e t/i d e n t i f y)[5-6],进行序列相似性分析㊂物种水平鉴定以99%核苷酸相似度为标准[7]㊂1.3.4基于WG S的基因组序列比对 WG S由北京百迈客生物科技有限公司完成㊂将与菌株18071143的16S r R N A基因序列相似性>99%的模式菌株作为平均核苷酸一致性(A N I)分析的对比菌株㊂利用美吉生物云工具(h t t p s://c l o u d.m a j o r b i o.c o m/ p a g e/t o o l s/)进行A N I分析,使用A N I m和A N I b2种方法计算A N I值㊂此外,将菌株18071143的基因组序列与基因组分类数据库(G T D B)[8]进行比对,以获得菌种信息㊂1.3.5系统发育分析基于WG S中的16S r R N A 序列和看家基因(d n a G,f r r,i n f C,n u s A,p g k,p y r G, r p l A,r p l B,r p l C,r p l D,r p l E,r p l F,r p l K,r p l L,r p l M, r p l N,r p l P,r p l S,r p l T,r p m A,r p o B,r p s B,r p s C,r p s E, r p s I,r p s J,r p s K,r p s M,r p s S,s m p B,t s f),选择在G T-D B中种属水平上与菌株18071143最接近的20株菌,通过M E G A7.0软件采用近邻相接法构建系统进化树㊂1.3.6基因组聚类分析通过S p e a r m a n相关性分析,在C O G和K E G G功能上对基因组进行聚类分析,评估菌株18071143和与其在16S r R N A基因序列相似性>99%的模式菌株之间基因组水平上的亲缘关系㊂相关系数越接近于1,表明样本间相关性越好㊂2结果2.1 MA L D I-T O F M S检测MA L D I-T O F M S对菌株18071143的鉴定未出现低分辨和无法鉴定的情况,鉴定结果为H a l o m o n a s h a m i l t o n i i㊂2.216S r R N A序列分析菌株18071143的16S r R N A 基因序列的G e n B a n k登录号是M Z097522.1㊂该菌株的16S r R N A序列经与细菌16S鉴定数据库比对后,得到相似度较高的细菌,相似性排名前5的细菌见表1,其中菌株18071143与H a l o m o n a s h a m i l t o n i i㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i㊁H a l o m o n a s j o h n s o n i a e的相似度均>99%㊂表1菌株18071143的16S r R N A序列比对结果排名细菌名称菌株G e n B a n k登录号相似性(%) 1H a l o m o n a s h a m i l t o n i i W1025AM94139699.93 2H a l o m o n a s s t e v e n s i i S18214A J T S010*******.86㊃5221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n,M a y2024,V o l.21,N o.9续表1 菌株18071143的16S r R N A 序列比对结果排名细菌名称菌株G e n B a n k 登录号相似性(%)3H a l o m o n a s jo h n s o n i a e T 68687AM 94139999.574H a l o m o n a s m a g a d i e n s i s 21M 1X 9215098.855H a l o m o n a s a qu a m a r i n a D S M 30161A J 30688898.352.3 基因组序列比对 菌株18071143的全基因组序列的G e n B a n k 登录号是C P 078120.1㊂通过A N I m 和A N I b 2方法分别计算菌株18071143与H a l o m o n a s h a m i l t o n i i ㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i 和H a l o m o n a s jo h n s o n i a e 3种盐单胞菌的A N I 值㊂2种算法均显示菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的亲缘关系最近(A N I b =0.9751,A N I m=0.9786)㊂将菌株18071143与G T D B 数据库进行比对后发现,与菌株18071143最为相似的细菌是H a l o m o n a ss t e v e n s i i ,见表2㊂故基于WG S 的序列比对分析,菌株18071143被鉴定为H a l o m o n a s s t e v e n s i i㊂2.4 系统发育分析 菌株18071143基因组中预测到6个16S r R N A 和31个看家基因㊂基于16S r R N A 和看家基因分别构建系统进化树,见图1和图2㊂16S r R N A 和看家基因的进化树均显示,菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的亲缘关系最为接近㊂图1 菌株18071143与20株盐单胞菌的16S r R N A系统的进化树图2 菌株18071143与20株盐单胞菌的看家基因系统的进化树㊃6221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n ,M a y 2024,V o l .21,N o .9表2 菌株18071143与G T D B 数据库对比结果排名参考基因组I DG T D B 物种分类1G C F _000275725.1H a l o m o n a s s t e v e n s i i2G C F _002442575.1H a l o m o n a s h y d r o t h e r m a l i s 3G C F _900129255.1H a l o m o n a s m e r i d i a n a2.5 基因组聚类分析 基于的C O G 和K E G G 功能对基因组进行聚类分析,菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的相关系数分别是0.9935和0.7037,相关性最高,因此菌株18071143与H a l o m o n a s s t e v e n s i i 的亲缘关系最为接近㊂见图3㊂注:A 是基于C O G 功能分类的结果;B 是基于K E G G 功能注释的结果㊂图3 菌株18071143与H a l o m o n a s h a m i l t o n i i ㊁H a l o m o n a s s t e v e n s i i ㊁H a l o m o n a s jo h n s o n i a e 的聚类分析3 讨 论作为常规细菌鉴定方法的生化试验虽操作简单,但需要一定的培养时间,且对于一些细菌只能达到区分菌属的程度㊂MA L D I -T O F M S 技术是近年来快速发展的一种用于鉴定多肽㊁蛋白质的新型软电离质谱技术,由于其具有快速㊁准确㊁高通量㊁易于操作和重复性好等优点,该技术越来越广泛地取代常规方法成为细菌鉴定的一线工具[9-11]㊂16S r R N A 基因测序被认为是一种成熟的分类学研究方法[12],特别适用于MA L D I -T O F M S 数据库中无数据细菌的鉴定[12-15]㊂另外,需要进行生物信息学分析,且成本较高的基于WG S 的菌种鉴定因其方法的高分辨率,使之成为传染病诊断和感染源追踪的一项非常有前景的技术[16]㊂在基因组水平上,A N I 分析被认为是菌种鉴定的神器㊂普遍认为亲缘关系较近的种群间A N I 值应为70%~75%,而定义一个种的A N I 值需要达到95%~96%[17-18]㊂A N I 值一般可以通过2种运算方法得出:一种是以B L A S T n 方法为基础(A N I b),另一种以MUMm e r 运算法则为基础(A N I m )㊂A N I 具有方便㊁快速㊁分辨率高的优点,近年来被广泛用于细菌鉴定㊂Z HO U 等[19]通过高通量测序技术和A N I 识别一个名为A V 208的革兰阳性球菌菌株㊂J I N 等[20]利用A N I b 和全基因组测序的系统发育分析,纠正奈瑟菌属中错误的菌种分类,并指出G e n B a n k 中的N e i s s e r i a m u c o s a (n =13)和N e i s s e r i a s i c c a (n =16)应使用A N I b 和高分辨率系统发育分析重新进行分类㊂本研究结果发现,MA L D I -T O F M S ㊁16S r R N A基因测序和WG S 对菌株18071143在菌属层面的鉴定一致性达到100%,但在菌种水平的鉴定上却存在差异㊂MA L D I -T O F M S 的鉴定结果为H a l o m o n a sh a m i l t o n i i ㊂16S r R N A 基因序列分析最为相似的细菌也是H a l o m o n a s h a m i l t o n i i ,但菌株18071143与3种盐单胞菌的序列相似度均>99%,且不同种之间的分辨率低于0.8%㊂根据美国临床和实验室标准协会(C L S I )指南[21]要求,本次16S r R N A 基因序列分析无法在菌种水平上鉴定细菌㊂基于WG S 的A N I 分析发现,菌株18071143更倾向于是H a l o m o n a ss t e v e n s i i ,这一点也从该菌的基因组序列与G T D B 数据库的比对结果㊁与相似菌的系统发育以及基因组的聚类分析得到证实㊂以往有学者指出,16S r R N A 序列分析的主要问题是无法准确确定物种[22-23]㊂尽管16S r R N A 基因序列被广泛用于分类学和系统发育学的研究,但在区分密切相关的菌株和物种时有一定的局限性,尤其是没有基于与公共数据库中序列的相似性来明确识别物种的普遍认可的阈值[24]㊂MA L D I -T O F M S 也存在同样的问题㊂MA L D I -T O F M S 方法操作简便,非常适用于临床工作,但仪器数据库的完备性也会影响到结果的可靠性[25]㊂细菌基因组包含其全部的遗传信息,确定基因组序列成为了解细菌生物学特性与功能特征的基础和前提㊂细菌全基因组序列信息能够对细菌的鉴定提供最高的分辨率㊂㊃7221㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n ,M a y 2024,V o l .21,N o .9本研究利用3种方法对临床常规方法无法鉴定到种的盐单胞菌进行了菌种鉴定,结果显示基于WG S的鉴定结果更加准确㊂MA L D I-T O F M S方法简单㊁快速,适用于临床常规工作;16S r R N A序列分析分辨率较差,对于某些疑难菌难以准确鉴定;WG S 分辨率高,适用于具有相似遗传学特征的菌种之间的鉴别㊂因此,在临床工作中若分离到罕见菌株和疑难菌株,建议使用WG S技术获取细菌全基因组序列信息,以全面了解该菌的生物学特性与功能特征㊂参考文献[1]翁秀清.全自动血培养仪与微生物鉴定仪在临床血液检验中的应用效果以及敏感性㊁准确性差异研究[J].中国医疗器械信息,2023,29(7):53-55.[2]蒲玉熙,次仁央金,嘎松卓嘎,等.高原地区两种微生物鉴定系统对临床常见病原菌鉴定的一致性分析[J].中国实用医药,2023,18(7):97-99.[3]宋玲玲.微生物鉴定仪在检测妊娠晚期孕妇阴道B族链球菌感染率中的应用价值[J].医疗装备,2023,36(11): 65-67.[4]沈玲,白欢,李丽,等.A U T O F M S1000质谱鉴定系统对临床实验室常见菌株鉴定能力的评估[J].现代检验医学杂志,2020,35(3):100-102.[5]S H I N S Y,P A R K S,MO O N J M,e t a l.C o m p o s i t i o n a lc h a n g e s i n t h e g u t m i c r o b i o t a o f r e s p o nde r s a n d n o n-r e-s p o n d e r s t o p r o b i o t i c t r e a t m e n t a m o n g p a t i e n t s w i t h d i a r-r h e a-p r e d o m i n a n t i r r i t a b l e b o w e l s y n d r o m e:a p o s t H o c a-n a l y s i s of a r a n d o m i z e d c l i n i c a l t r i a l[J].J N e u r og a s t r o e n-t e r o l M o t i l,2022,28(4):642-654.[6]R A I A,U P P A D A J,G U P T A D,e t a l.N e o r o 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m o n g v a g i n a l m i c r o b i o t a i n h e a l t h y a n d af f e c t-e d s o w s w i t h e n d o m e t r i t i s[J].R e s V e t S c i,2022,143:33-40.[13]A L N A K I P M E A,R HO UMA N R,A B D-E L F A T A H EN,e t a l.D i s c r i m i n a t i o n o f m a j o r a n d m i n o r s t r e p t o c o c c i i n c r i m i n a t e d i n b o v i n e m a s t i t i s b y MA L D I-T O F M S f i n-g e r p r i n t i n g a n d16S r R N A g e n e s e q u e n c i n g[J].R e s V e tS c i,2020,132:426-438.[14]S U L A I MA N I M,M I R A N D A N,S I M P S O N S.MA L D I-T O F m a s s s p e c t r o m e t r y a n d16S r R N A g e n e s e q u e n c e a-n a l y s i s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f f o o d b o r n e c l o s t r i d i u m S p p [J].J A O A C I n t,2021,104(5):1381-1388.[15]C HU R C H D L,C E R U T T I L,GÜR T L E R A,e t a l.P e r-f o r m a n c e a n d a p p l i c a t i o n o f16S r R N Ag e n e c y c l e s e q u e n-c i n g f o r r o u t i n e ide n t if i c a t i o n o f b a c 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志贺菌生化鉴定方法
志贺菌生化鉴定方法
志贺菌是一种常见的致病菌，它能引起多种疾病，如食物中毒、痢疾等。
因此，对于志贺菌的鉴定方法十分重要。
常用的志贺菌生化鉴定方法包括：
1. 培养基鉴定法：利用不同的培养基来观察菌落形态、生长速度、产生的色素等性质，从而鉴定志贺菌。
2. 生化反应鉴定法：包括氧化酶试验、葡萄糖发酵试验、麦芽糖发酵试验、甘露糖发酵试验、氢化氮试验等，可以通过不同的生化反应来确定志贺菌的种类。
3. 血清学鉴定法：志贺菌产生的特定抗原可以与血清中的特异性抗体结合，形成典型的血清学反应，从而鉴定志贺菌。
以上鉴定方法需要经过专业培训才能熟练掌握，同时还需要注意无菌操作、正确识别菌种、严格控制实验条件等因素，才能确保鉴定结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
真菌培养及鉴定方法有哪些
真菌培养及鉴定方法有哪些真菌培养及鉴定方法有哪些真菌的营养要求不向。
在一般细菌培养基上均能生长。
真菌培养及鉴定有哪些的呢?本文是店铺整理真菌培养及鉴定的资料，仅供参考。
真菌培养及鉴定1.采集标本体表真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。
深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴-道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本应注意无菌操作。
2.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。
标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(Sabouraud agar)上，置室温或37℃培养1～3周。
必要时可行小培养协助鉴定。
菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断。
对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。
真菌培养的方法与直接镜检法相比较而言，更能对大部分真菌感染的灰指甲作出准确的鉴定，也是诊断灰指甲的一个很重要的手段。
下面我们就从培养基的选择、培养时间、菌种鉴定三方面来了解一下灰指甲的真菌培养法。
1.培养基的选择通常培养真菌会同时选用两种培养基，如果单用一种培养基，则容易忽略其它种类的真菌诊断。
常见的两种培养基，一种为沙氏葡萄糖琼脂培养基中加抗菌剂，常为氯霉素和放线菌酮;另一种是沙氏葡萄糖琼脂培养基中仅加氯霉素，不加放线菌酮。
2.培养时间各种真菌的生长速度不同，所以报告的时间也不同。
一般皮肤癣菌生长较缓慢，在26℃-28℃的环境下需要培养2-4周才能发报告，但是，皮肤癣菌含盖的菌种较多也需要区别对待;酵母菌生长较快，通常2-3就可以发报告，如果为阴性则需要观察1周;霉菌生长也比较快，一般2-4天就可以发报告。
3.菌种鉴定(1)丝状真菌：包括皮肤癣菌和霉菌，根据菌落形成所需要的时间，在不同条件下生长的情况，菌落表面及背面的形态、色素，培养基中有无色素，培养物用乳酚棉蓝染色后镜检找特征性标志结构。
(2)酵母菌：分为形态学鉴定及生化试验。
铜绿假单胞菌的鉴定方法与技术进展
铜绿假单胞菌的鉴定方法与技术进展铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阴性杆菌。
它是一种多重耐药的病原菌，对众多常用抗菌药物表现出不同程度的耐受性。
鉴定铜绿假单胞菌的方法及技术的进展对于临床医学、环境卫生以及食品安全等领域具有重要意义。
一、传统鉴定方法1. 形态学特征：铜绿假单胞菌在常规琼脂平板上生长呈青绿色，细菌呈短杆状或不规则杆状，革兰染色呈阴性，不产生孢子。
2. 生理和生化特性：铜绿假单胞菌可利用较多种类的碳源生长，产生草酸酶、葡萄糖氧化酶等酶类。
此外，它还可产生金黄色脆忻素、绿色芽孢杆菌素等色素。
3. 血清学鉴定：通过血清学反应检测铜绿假单胞菌所产生的O抗原和Vi抗原，结合凝集试验、血凝试验等方法进行鉴定。
二、分子生物学鉴定方法随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学方法被用于铜绿假单胞菌的鉴定和检测。
1. 16S rRNA基因测序：16S rRNA基因是细菌共有的基因，在物种鉴定上具有较高的特异性和可溯源性，通过对铜绿假单胞菌菌株进行16S rRNA基因测序，可以快速准确地鉴定其物种。
2. 基因片段PCR：利用铜绿假单胞菌特异基因片段进行PCR扩增，如oprL基因、oprD基因等，通过特异性条带出现可以判断是否为铜绿假单胞菌。
3. 多重PCR技术：多重PCR技术可以通过扩增多个特异基因片段，提高检测的特异性和灵敏度，如gyrB、rpoB、27-kDa等基因片段。
三、质谱法质谱法是近年来快速进行菌种鉴定的一种方法，其应用已得到广泛推广。
主要有飞行时间质谱法、荧光定量PCR结合质谱法、表面增强激光解析电离质谱法等。
这些质谱方法可以通过菌株代谢产物的分子质量进行鉴定。
四、胶体金技术胶体金技术通过标记特异性抗体或引物，利用胶体金颗粒作为信号素，通过胶体溶液在酶或免疫检测中的特异性反应，可以高度敏感地鉴定铜绿假单胞菌。
五、纳米生物传感器纳米生物传感器是一种新兴的鉴定技术，通过利用纳米材料的特殊性质以及生物传感机制来实现铜绿假单胞菌的高灵敏度检测。
菌种分离筛选的5个步骤
菌种分离筛选的5个步骤一、样品采集与处理菌种分离筛选的第一个步骤是样品采集与处理。
在进行菌种分离之前，我们需要选择合适的样品进行采集。
样品可以来自不同的环境，如土壤、水体、动植物等。
采集样品时，我们需要注意卫生和安全，避免污染和交叉感染。
采集后，样品需要进行处理，包括样品的细碎、过滤、稀释等步骤，以便于后续的菌种分离工作。
二、菌种分离菌种分离是菌种分离筛选的核心步骤。
在这一步骤中，我们需要将样品中的微生物菌种分离出来，并培养成单菌种。
常用的分离方法有稀释平板法、涂布平板法、过滤法等。
分离时，需要选择适当的培养基和培养条件，以促进菌种的生长和繁殖。
分离出的单菌种需要进行纯化，以确保其纯度和纯种性。
三、菌种鉴定菌种鉴定是确定分离出的菌种种属和种类的步骤。
鉴定菌种的方法有形态学观察、生理生化特性测定、分子生物学方法等。
通过对菌种的形态、生长特征、代谢产物等进行观察和分析，可以初步确定其分类地位。
而通过分子生物学方法，如16S rRNA基因序列分析，可以更准确地确定菌种的种属和种类。
四、菌种筛选菌种筛选是根据特定需求从众多菌种中选择出具有特殊功能或性质的菌株的步骤。
筛选的目标可以是抗菌活性、产酶能力、产生生物活性物质等。
常用的筛选方法有抗菌活性筛选、产酶能力筛选、生物活性物质筛选等。
在进行筛选时，需要设置合适的筛选条件和指标，并利用适当的方法进行评价和选择。
五、菌种保存与应用菌种保存与应用是菌种分离筛选的最后步骤。
在菌种分离筛选过程中，我们通常会得到很多有潜力的菌株。
为了保证这些菌株的长期保存和应用，我们需要采取相应的保存措施，如冷冻保存、冻干保存、液氮保存等。
同时，我们还可以将这些菌株应用于不同的领域，如农业、医药、环境等。
通过进一步的研究和开发，这些菌株可以发挥出更大的应用价值。
通过以上五个步骤，我们可以从自然环境中分离出具有特殊功能或性质的菌株，并进行进一步的研究和应用。
菌种分离筛选是微生物学研究中的重要工作，对于发现新的生物资源和开发新的生物产业具有重要意义。
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菌种鉴定的方法
菌种鉴定是确定微生物种类的过程，通常涉及形态学、生理生化、分子生物学等方面的分析。
以下是一些常见的菌种鉴定方法：
1. 形态学鉴定：通过观察微生物的形态、大小、颜色、形状等特征来初步鉴定菌种。
这可以通过光学显微镜或电子显微镜进行。
2. 生理生化特性鉴定：分析微生物的代谢产物、酶活性、生长条件等生理生化特性，以确定其种类。
这可以通过培养、生化试验等方法进行。
3. 分子生物学鉴定：利用分子生物学技术，如DNA 测序、PCR、Southern blotting 等，分析微生物的基因组成，以确定其种类。
这是目前最准确的菌种鉴定方法之一。
4. 免疫学鉴定：利用抗体与微生物表面抗原的特异性结合来鉴定菌种。
这可以通过免疫荧光、ELISA 等方法进行。
5. 光谱学鉴定：利用光谱学技术，如红外光谱、拉曼光谱等，分析微生物的化学成分，以辅助菌种鉴定。
以上方法通常需要结合使用，以提高菌种鉴定的准确性。
在进行菌种鉴定时，应选择适当的方法，并遵循相关的操作规程和标准。