用分光光度计测定质粒DNA的浓度

用分光光度计测定质粒DNA的浓度

一、目的

熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。

二、原理

DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时， dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml寡核苷酸浓度约为30μg / ml（youyu底物不同有差异）

当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。

经验值：

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）

纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）

若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。

三、材料、试剂及器具

1、材料

提取的PUC19样品、PUC19标准样品

2、试剂

灭菌重蒸水，TE缓冲液

四、操作步骤

1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min.

2、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。

3、设定狭缝后校零。

4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记

录编号和稀释度。

5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。

6、设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。

7、计算待测样品的浓度与纯度。

DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000

RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000

PS：对于一般的紫外分光光度计，若用1cm的石英比色皿，则至少稀释到3ml，才能达到光照高度的量。