HPLC 同时测定苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定血药浓度

HPLC 同时测定苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定血药浓度 天津儿童医院儿研所 李惠芬 内容摘要 目的：应用高效液相色谱法同时测定抗癫痫“中药”中苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、

安定血药浓度，以指导临床安全、有效、合理用药。方法：应用高效液相色谱法，采用Symmtry C18色谱柱，磷酸盐缓冲液与乙晴64:36(v/v)为流动相，紫外检测波长 214 nm。微量血中，乙腈沉淀蛋白，上清液进样分析。结果：苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定色谱分离理想，分别在5.0～50.0、1.0～12.0、5.0～25.0、0.10～2.00 mg/L范围内线性关系良好，日内和日间精密度<5%，平均相对回收率为98.65% ～102.64%。结论：本方法简便、快速、精密、准确，用血量少，适用于临床治疗药物监测，为临床用药的合理、有效、安全提供保证。

关键词 HPLC、苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定、血药浓度

目前，我国约有癫痫患者600万，每年新发病例65万～70万[1]。癫痫主要采取药物治疗，很多患者及其家属认为中药毒副作用小而更愿意选用中药进行治疗。然而，治疗癫痫的一些中药制剂中常常含有西药成分，患者服用后，有些产生西药的不良反应，且给其他临床医生添加西药带来不便。因此，所谓纯中药进行治疗的患者，往往需检测血液中一种或多种西药的药物浓度，方便临床进一步治疗。目前最常用的检测方法为高效液相色谱法。一般来说，在临床药学实验室中通常只配备一台高效液相色谱仪，在测定其血药浓度时，各个方法间的切换费时、费力，直接影响到危重病人的抢救和对病人用药的指导，并且增添了不少工作量。为此，建立同一条件下，测定苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定血药浓度的方法，为临床提供简便、快速、准确的定性、定量结果。

1 材料与方法 1.1 材料 （1）仪器: 美国Waters公司高效液相色谱仪，配备600E型泵，486 型可变波长检测器，pc-800工作站。（2）药品和试剂: 苯巴比妥、卡马西平、苯妥英和安定对照品（中国药品生物制品检定所），5-羟基5-乙基巴比妥酸（美国Sigma公司），乙腈、甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯试剂， 1.2 方法：（1）色谱条件： 色谱柱: Symmtry C18钢柱（4.6 mm×150 mm , 5 um）；流动相：磷酸盐缓冲液(pH 6.9)与乙晴体积比为 64:36；流速: 1.2 ml/min，紫外检测波长: 214 nm。柱温：室温，进样量：10μl。（2）血清样品处理： 取标准或待测血清50 μl，加入80 μl含内标物5-羟基5-乙基巴比妥酸10 mg/L的乙腈液，沉淀蛋白，静置，10000 r/min离心5 min，取上清液10 μl进样。按内标法计算标本含量。（3）标准溶液的配制： 精密称取苯巴比妥、卡马西平、苯妥英和安定对照品50，25，50，10 mg，用甲醇分别定容为1.0，0.5，1.0，0.2 g/L的标准溶液，4ºC保存。（4）标准样品配制：取空白血清加入苯巴比妥、卡马西平、苯妥英和安定标准溶液，配制苯巴比妥5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 mg/L；卡马西平1.0，2.0，4.0，8.0，12.0mg/L；苯妥英5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 mg/L；安定0.10，0.25，0.50，1.00，2.00mg/L 系列浓度的标准血清样品，按上法操作，以对照品与内标物的峰高比为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），进行线性回归。以标准样品的测定考核方法的精密度和回收率。 1.3 统计学方法 计量资料数据均用 _ X ±S表示， 进行直线回归与相关分析。 2 结果 2.1 色谱图 在上述色谱条件下，苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定和内标物色谱峰分离效果好 ，保留时间分别为2.98，4.82，5.68，17.63，4.21 min。 血清中内源性物质对测定无影响, 见图1。

P1D1: 苯巴比妥 P3D1: 卡马西平 P4D1: 苯妥英 P7D1: 安定 P2D1: 内标物 P5D1、P6D1:血清内物质峰

图1 血清苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定色谱图

2.2 标准曲线及检测限 血清苯巴比妥、卡马西平和苯妥英分别在5.0～50.0 、1.0～12.0 、5.0～25.0 和0.10～2.00 mg/L 浓度范围内线性关系良好，回归方程分别为苯巴比妥 Y=0.04936X+0.009753，r=0.9997 ；卡马西平 Y=0.08198X-0.0007091，r=0.9997 ；苯妥英 Y=0.04086X-0.001901，r=0.9996 ；安定Y=0.07092X+0.0009930，r=0.9994。线性关系良好。血清苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定最低检测浓度分别为0.1，0.1，0.2，0.05 mg/L。 2.3 精密度和回收率 苯巴比妥 10.0，20.0，40.0 mg/L，卡马西平 4.0，8.0，12.0 mg/L，苯妥英5.0，10.0，20.0 mg/L，安定0.50，1.00，1.50 mg/L各3种浓度的血清标本6 份，当日测定，求得日内精密度，同法，血清标本6 份，8 日内测定，求得日间精密度。将同一血清标本，加入不同量的苯巴比妥、卡马西平、苯妥英和安定标准样品作回收实验，得苯巴比妥、卡马西平、苯妥英和安定的相对回收率，见表1。日内和日间精密度均小于 5%，平均相对回收率为98.65%～102.64%，符合方法学要求。 表1 苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定的精密度和回收率 ──────────────────────────────────————— 日内精密度实验(n=6) 日间精密度实验(n=6) 相对回收率(n=3) 药物 浓度 ─────────- -───────── --───────── (mg/L) 实测值(mg/L) RSD(%) 实测值(mg/L) RSD(%) 实测值(mg/L) RSD(%) ──────────────────────────────────--------- 10.0 10.06±0.18 1.79 10.05±0.23 2.29 101.87±1.31 1.29 苯巴比妥 20.0 19.84±0.38 1.92 19.88±0.48 2.41 99.65±1.51 1.52

40.0 40.12±0.52 1.31 40.02±0.73 1.82 99.54±0.46 0.46 4.0 4.06±0.05 1.23 3.94±0.06 1.52 98.65±1.82 1.82 卡马西平 8.0 8.30±0.13 1.56 7.95±0.10 1.26 98.77±2.21 2.23 12.0 12.76±0.14 1.10 11.81±0.20 1.69 101.11±1.88 1.86 5.0 5.04±0.11 2.27 5.01±0.12 2.40 101.20±2.98 2.95 苯妥英 10.0 10.03±0.15 1.49 10.10±0.21 2.08 99.97±2.76 2.76

20.0 20.08±0.27 1.35 19.86±0.45 2.27 100.18±2.73 2.72 0.50 0.53±0.02 3.77 0.49±0.02 4.08 102.64±4.12 4.01 安定 1.00 1.01±0.02 1.98 1.01±0.03 2.97 100.44±3.44 3.42 1.50 1.51±0.04 2.65 1.43±0.06 4.19 99.17±3.32 3.34 ──────────────────────────────────---------

2.4 干扰实验 在上述色谱条件下，对通常配伍的药物如叉癫宁、丙戊酸、奋乃静、硝西泮、氯硝西泮、艾司唑仑、呵普唑仑、三唑仑等进行分析，结果，均不干扰苯巴比妥、卡马西平、苯妥英和安定的测定。

3 抗癫痫“中药”中苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定检出情况 2007 年3 月～2010 年8 月神经内科就诊的服用市售抗癫痫“中药” 治疗的癫痫患者49例，所服中药均未标有抗癫痫化学成分,所有患者在整个治疗期间均未服用任何一种抗癫痫化学药品，其中男24 例，女25 例，年龄为2～59岁， 进行上述四种西药成分的血药浓度测定。检出西药情况见表2。

表2 抗癫痫“中药”中苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定检测结果 ------------------------------------------------------------------- 药品名称 例数/n 最低血药浓度/mg·L-1 最高血药浓度/mg·L-1 -------------------------------------------------------------------- 苯巴比妥 36 2.6 41.8 卡马西平 17 1.2 7.8 苯妥英 12 0.7 12.1 安定 4 0.05 0.16 --------------------------------------------------------------------

4 讨论 癫痫为神经科的常见病,70%～80% 的癫痫可以通过合理、常规地给予一线抗癫痫药物得到控制[1]。目前，中药制剂掺有西药成分治疗癫痫的现象比较常见。 若接诊的患者有用“中药”的，应首先详细了解所用“中药”的具体情况，用药时要考虑“中药”与西药的相互作用，以及“中药”中可能含有的西药成分。对服用含西药成分的抗癫痫“中药”患者，必须检测其血药浓度。了解所含西药种类及是否达到治疗浓度，以保证用药安全，为调整用药做准备。希望那些生产抗癫痫“中药”的厂家，能标明其生产药物中所含西药成分，这样临床和患者才能合理选用药物[2]。生产厂家还应考虑到“中药”与西药之间可能出现的相互作用, 合理组方,遵循癫痫的药物治疗原则,尽量避免不必要的联合用药。 筛选色谱条件时，流动相pH的确定十分关键，当pH降低0.1时，内标物、卡马西平、苯妥英色谱峰部分重叠，分离不完全。 内标物5-羟基5-乙基巴比妥酸，化学性质稳定，与待测物质结构相似，又非临床治疗药物，是一种理想的内标物。 苯巴比妥、卡马西平、苯妥英、安定血药浓度测定方法，精密、准确、特异性强、回收率高，色谱分离效果好，较之文献报道的检测方法[3,4]既节省提取所需有机试剂，又简化了繁琐的提取过程，具简单、快速，用血量少等特点。目前，该方法已用于临床治疗药物监测，为临床用药的合理、有效、安全提供保证。