实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
抗体制备方法
第1章 抗体制备技术抗体（antibody，Ab）是机体B淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为免疫球蛋白。
机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。
由于抗体能与相应的抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。
在免疫学检测中应用的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。
本章主要介绍这两种抗体的制备方法。
实验一 多克隆抗体的制备多克隆抗体（polyclonal antibody）是机体针对抗原的不同表位所产生的抗体混合物。
是用制备的纯化免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，在含有多种抗原表位的抗原刺激下，该动物体内多个B细胞克隆被激活并产生针对这种抗原多种不同表位的抗体混合物。
含有这些特异性抗体的动物血清称为免疫血清或抗血清，而从免疫血清中纯化的免疫球蛋白则称为抗体。
一、抗体制备的流程优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，动物的应答能力以及免疫程序（如免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素）。
因此制备高质量的抗体必须具备理想的免疫原、适宜的动物和切实可行的免疫方案。
（一）免疫动物的选择免疫用的动物主要为哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、豚鼠及小鼠等。
选择动物要依据抗体制备的条件而定。
1．抗原与动物的种系 抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强，越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。
如用鸡球蛋白免疫亲缘关系较近的鸭或鹅，则免疫原性较差。
2．动物的个体状况 动物的年龄与健康状况可影响产生抗体的效价，年龄太小者易产生免疫耐受，而年老体衰者免疫应答能力低下，不易产生高效价的抗体。
第03章抗体制备
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
噬菌体抗体库主要工作流程
从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。
筛选含有目的Ig表达的噬菌体。 建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。 扩增制备噬菌体抗体。 纯化抗体。
噬菌体抗体库技术的主要特点
IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在， 因此容易保存和运输；
由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免 疫球蛋白之间不会发生交叉反应；
IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或 Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳 性结果；
IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
免疫学实验：多克隆抗体制备-免疫小鼠
分组情况
免疫程序
组别 时间
Day 0 皮下注射
Day 10 皮下注射
Day 17 腹腔注射
有佐剂组
无佐剂对照组 阴性对照组
40ugOVA 弗氏完全佐剂
40ugOVA 弗氏不完全佐剂
40ugOVA 弗氏不完全佐剂
40ugOVA 40ugOVA 40ugOVA
生理盐水 生理盐水 生理盐水
Day 24
取血
取血
取血
颈部皮下注射要点
❖ 拇指与食指捏起颈部皮肤 ❖ 水平进针，针头脱空感，缓慢注射，迅速拔出
腹腔注射要点
❖ 抓住颈部皮肤和鼠尾，将小鼠翻转，头部偏下 ❖ 45度进针，靠近腹部中线，❖ 戴手套操作 ❖ 注射器针头用后及时盖帽 ❖ 文字记录标记方法 ❖ 经常检查标记保存状况
JLU
JLU
多克隆抗体制备-免疫小鼠
实验材料
❖ 小鼠 每组3只 ❖ 注射器 每组3只 ❖ 乳胶手套 每人1付 ❖ 线手套 每组1付 ❖ 记号笔、手术剪刀 公用 ❖ 弗氏注射液 公用 200ug/ml OVA in 弗氏佐剂 ❖ 无佐剂注射液 公用
200ug/ml OVA in 生理盐水 ❖ 生理盐水（对照） 公用
抗体制备
二、免疫动物
为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度 的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、 注射途径、注射次数、注射间隔和接种动 物的年龄均与免疫效果密切的关系。
1.免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物 种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而 同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常 动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、 豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、 山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类。
第十一章 抗体制备
抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本 章主要介绍三种类型抗体的制备方法。
一、杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术的原理及流程
二、单克隆抗体制备技术
1. 主要材料
2. 细胞融合前准备
3. 细胞融合
4. 抗体的初筛和克隆化
5. 杂交瘤细胞冻存与复苏
6. 单克隆抗体的批量生产
7. 单克隆抗体的纯化与鉴定
（一）主要材料：
RPMI1640培养液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 链霉素 100Ug/ml
实验一多克隆抗体的制备(颗粒性抗原)
上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（颗粒性抗原）实验日期2011年9月至10月基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。
抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。
材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.单克隆过夜培养的坂崎肠杆菌，用灭菌生理盐水洗涤后，反复冻融3~5次，-20℃保存；3.消毒酒精及碘酒。
免疫方法1.第一次免疫: 用1ml注射器吸取1ml已升温至室温的1×107/mL坂崎肠杆菌混悬液，每侧臀部皮下各注射0.5ml。
2.第二次免疫: 间隔14天后再用1ml注射器吸取1ml已升温至室温的1×107/mL坂崎肠杆菌混悬液，每侧臀部皮下各注射0.5ml。
3.间隔14天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以凝集反应试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。
效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
4若效价未达到要求，可再次进行加强注射，隔14天后再试血。
放血颈动脉放血将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
分离血清将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。
待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。
于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。
大肠杆菌多克隆抗体的制备和检测
一、实验目的
• 1、学习掌握凝集反应原理与方法 、
二、实验原理
• 1、多克隆抗体 、 • 由多个克隆细胞产生的多种抗体的混合物 即多克隆抗体， 即多克隆抗体，也称第一代人工抗体 天然抗原
(多个抗原表位) 多个抗原表位)
三、实验器材
• 恒温培养箱、高速离心机 恒温培养箱、 • 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、家兔等 大肠杆菌、生理盐水、载玻片、
四、实验内容与步骤
• 1、抗原的制备 、 • 大肠杆菌菌悬液→60℃水浴 →稀释达 稀释达9 大肠杆菌菌悬液 ℃水浴1h 稀释达 亿个/毫升 毫升→无菌检查 亿个 毫升 无菌检查 • 2、免疫血清的制备 、 • 家兔耳缘静脉注射免疫 • 采血制备血清 • 3、凝集反应 、
机体
诱发多个B 诱发多个B细 胞克隆活化
产生多种针对不同表位的 相应抗体—多克隆抗体 相应抗体 多克隆抗体
2、凝集反应 、
• 颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞 颗粒性抗原（ 与相应抗体结合， 等）与相应抗体结合，在有电介质存在的 条件下，经过一定时间， 条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的 凝集小块。 凝集小块。 • 参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称 参与凝集反应的抗原称为凝集原 凝集原， 凝集素。 为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝 集反应两类。 集反应两类。
免疫学
第六章多克隆抗体的制备多克隆抗体(polyclonal antibody，PAb)：用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum)，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体。
第一节免疫原的制备免疫原：能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质。
★能否产生抗体有许多因素决定，如抗原的化学结构（复杂性）、分子量、个体对抗原反应的能力（异物性）以及免疫的方法、途径、剂量时间等。
纯化抗原的鉴定方法较多，常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳法，结晶法，免疫电泳法等。
几种方法联合应用才较可靠。
蛋白质抗原的定量可用生物化学分析中常用的方法，双缩脲法或酚试剂法。
还可用紫外光吸收法。
半抗原免疫原制备及佐剂纯化抗原的鉴定做免疫用的动物有哺乳动物和禽类，主要有羊、马、兔、猪、豚鼠、鸡等。
实验室常用的为兔和豚鼠。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得的抗血清的数量。
第二节抗血清的制备和鉴定一、动物的选择1）种属差异越远越好，太近不易产生良好的抗体，如鸡和鸭2）抗血清量的多少（大动物可获得大量血清，一只成年马，反复采血可获得10000ml以上的抗血清）3）抗原的选择：对蛋白质抗原，大部分动物皆适合。
但是，在某些动物体内有类似的物质或其他原因，对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔等，免疫时不易产生抗体。
免疫的动物应适龄、健壮、无感染性病患等。
在饲养过程中，要注意饲养环境卫生，预防疾病。
有许多种：静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下，静脉注射等。
免疫途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性。
★肌肉注射，皮内注射和皮下注射适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答。
初次免疫和免疫加强注射均可使用。
★静脉注射则只适合于可溶性抗原及分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。
一般采用皮下或背部多点皮内注射的方法。
实验二多克隆抗体的制备
摇匀 置 37℃ ℃ 水浴 箱内 15~3 0min
全溶 全溶 全溶 全溶 全溶 大半溶 全不溶
ห้องสมุดไป่ตู้
注意事项： 注意事项： 1.抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确。 抗原注射的方式和量要准确 2.补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜。 补体和绵羊红细胞要新鲜
作业：计算本组的溶血素单位。 作业：计算本组的溶血素单位。
实验二 多克隆抗体的制备
LOGO
目的： 目的：掌握溶血素的制备和溶血素单位滴定 的原理和方法。 的原理和方法。 原理：绵羊红细胞（ 原理：绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔后可以 ） 产生抗SRBC的抗体，该抗体能与 的抗体， 结合， 产生抗 的抗体 该抗体能与SRBC结合， 结合 在补体参与下，能使SRBC溶解，此抗体也称 溶解， 在补体参与下，能使 溶解 溶血素， 溶血素，常用于补体结合及补体活性测定等 实验。 实验。
LOGO
实验器材： 实验器材： 1.器具： 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、小 器具： 器具 冰箱、水浴箱、显微镜、平皿、 试管、滴管、注射器。 试管、滴管、注射器。 2.材料：家兔、全羊血、20%羊红细胞悬 材料：家兔、全羊血、 材料 羊红细胞悬 液。
LOGO
实验方法
1.溶血素的制备 溶血素的制备
最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。 最后一次注射后，间歇3d，自耳静脉采血，滴定溶血素单位。如果达 3d 5000以上时 可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃ 以上时， 4℃保存 到1：5000以上时，可由心脏或颈动脉放血，分离血清，加甘油4℃保存
LOGO
2.溶血素单位滴定法 溶血素单位滴定法
注射日期 1 3 5 7 9 12 15 注射途径 皮内 皮内 皮内 皮内 皮内 静脉 静脉 注射剂量 全羊血0.5ml 全羊血 全羊血1.0ml 全羊血 全羊血1.5ml 全羊血 全羊血2.0ml 全羊血 全羊血2.5ml 全羊血 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞 20%羊红细胞 羊红细胞1.0ml 羊红细胞
多抗制备
原理
1,克隆(clone): 是指无性繁殖细胞系,是由单一 ,克隆 : 是指无性繁殖细胞系, 个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系. 个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系.在 这个家族的所有成员中,如无突变发生, 这个家族的所有成员中,如无突变发生,其基因 是完全相同的. 是完全相同的. 2,多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb):用 ):用 ,多克隆抗体( ): 一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物, 一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,可刺 激机体多个 细胞克隆产生针对多种抗原表位的 多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位 激机体多个 细胞克隆产生针对多种抗原表位的 不同抗体.所获得的免疫血清实际上是含有多种 不同抗体.所获得的免疫血清实际上是含有多种 抗体的混合物,即多克隆抗体. 抗体的混合物,即多克隆抗体.
单 克 隆 抗 体 和 多 克 隆 抗 体 产 生 区 别 示 意 图
脾
骨髓瘤小鼠 取腹水
抗原
B 细 胞
骨髓瘤细胞 + PEG, 融合 杂交瘤细胞
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4
抗血清
HAT培养, 培养, 培养 稀释
Ab3 Ab1 Ab2 Ab4
普通抗血清(多克隆抗体) 普通抗血清(多克隆抗体)
Ab1
抗体的制备技术经历了三代: 抗体的制备技术经历了三代: 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用 抗原免疫动物后获得抗体, 抗原免疫动物后获得抗体,称为多克隆抗 体(polyclonal antibody); ); 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对 抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆 抗体(monoclonal antibody, McAb); 抗体 ; 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来, 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来, 称为基因工程抗体(genetic engineering 称为基因工程抗体 antibody). .
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）
上海师范大学
实验报告
专业、年级生物科学班级姓名学号
课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期
基本原理
免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。
抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。
材料
(一)动物：健康雄性家兔2只
(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
(三)试剂
1.灭菌生理盐水；
2.纯化人IgG(10mg／ml)；
3.消毒酒精及碘酒；
4.弗氏不完全佐剂（FCA）
5.弗氏完全佐剂（FIA）
6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
免疫方法
1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；
2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称
FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。
如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。
4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。
效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。
即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。
间隔1周再试血。
如效价达到要求应立即放血。
另
外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。
注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。
首次注射后一周或稍长时间再次进行加强注射，可大大增强免疫应答。
对免疫原性弱的抗原，需要多次注射(注射5-6次)，可以在适当的时间间隔内，有效的控制抗体效价的增加。
放血
颈动脉放血
将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
分离血清
将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。
待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。
于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。
结果鉴定
效价的测定——双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。
琼脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到1.5g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。
用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。
中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生以判断血清的稀释度。
注意事项
1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。
另外，不能使用妊娠动物。
2.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。
上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。
采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。
前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。
这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。
3.佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。
另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。
为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。
4.抗原的剂量决定于抗原的种类。
对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。
抗原的用量一般以体重计算。
在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为
宜。
如不加佐剂时剂量可加大10倍。
另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。