碱性磷酸酶的分离纯化鉴定
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5、50％丙酮沉淀AKP
每ml溶液中加入0.36ml丙酮 3000rpm×15min，留沉淀， 5ml Ph8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀 （D液，不稀释）
.
6
四、分析及鉴定
1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法） 2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法） 3、比活性及纯化倍数计算
.
7
分光光度法 （Spectrophotometry）
.
12
参比溶液的选择
溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波 长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参 比溶液。
试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸 收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收 时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液， 这种方式最为常用。
.
13
基本组件及常见分光光度计
510nm 比色
A样
酶活性单位 （U/ml）=
×0.1 ×稀释倍数
A标
酚标准液浓度
蛋白含量测定基本原理－－BCA法
碱性 蛋白质+Cu 2＋
BCA试剂
Cu＋
紫色化合物
二喹啉甲酸，BCA
.
18
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
单位（ml）
空白管
各阶段稀释液
/
蛋白标准液（0.2mg/ml） /
红色醌式化合物
.
16
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
/
25 10 5
1
单位（ml）
空白管 标准管 A B C D
各阶段稀释液
/
/
酚标准液（0.1mg/ml） / 0.1
Tris-醋酸镁
0.1 /
复合底物液
3
3
0.1 0.1 0.1 0.1 //// //// 3 333
37保温 15分钟 各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min
K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。
.
10
对比法进行定量分析
A样 = K ·L ·C样 A标 = K ·L ·C标
A样
K ·L ·C样
C样
A标
K ·L ·C标
C标
C样 = A样·C标 / A标
.
11
Lambert—Beer定律的适用范围：
单色光、平行光（λmax） 溶液均匀、清澈、无散射 溶液性质稳定，比色皿中无化学反应 适用于稀溶液（A 0.2-0.7）
2000rpm×5min，留上清（记录体积）
3、60％乙醇沉淀AKP
每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml
3000rpm×5min，留沉淀，
加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。
（取0.1ml留作C液，使用时稀释5倍）
.
5
4、33％丙酮溶解AKP
每ml溶液中加入0.33ml丙酮 2000rpm×5min，留上清（记录体积）
根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收 （即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种 定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法 （Absorption spectrometry）。
不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来
.
8
（一）基本原理
1、光的基本知识 光具有波粒二相性。 波长和频率是光的波动性的特征。
二、提取
加入2ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过 滤，留上清。计体积。
.
4
三、分离纯化
1、50％丙酮沉淀AKP
加入等体积丙酮，3000rpm×5min，留沉淀，
加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。
（取0.1ml留作B液，稀释10倍）
Βιβλιοθήκη Baidu
2、30％乙醇溶解AKP
每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml
碱性磷酸酶的分离纯化
有机溶剂分步沉淀法
.
1
分离纯化的一般程序
选择材料 破碎细胞
提取
分离纯化
分析及鉴定
.
2
原理：
AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），
.
3
操作
一、取材及匀浆
取兔肝2g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分 匀浆。 记录体积 （取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）
紫外分光光度计（200－400nm） 可见光分光光度计（400－760nm） 红外分光光度计（760－1000nm）
.
9
2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
A ＝ K·L·C
吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D )
.
14
分光光度计的使用
1. 打开电源预热15分钟 2. 选择波长（ λmax ） 3. 光标指向Trans 4. 打开光门，调节0％；关上光门调节100％ 5. 重复4一次 6. 将光标指向ABS 7. 读数
.
15
AKP活性测定基本原理－－磷酸苯二钠法
磷酸苯二钠 碱性磷酸酶 苯酚 + 磷酸盐
苯酚 + 4-氨基安替吡啉 + 铁氰化钾 碱性
样品的蛋白含量
纯化倍数 =
每一步比活性 初提液比活性
得率 =
每一步总活性 初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性. × 每一部记录的体积数 20
蒸馏水
0.1
BCA试剂
1.5
/
标准管
/ 0.1 / 1.5
50 20
AB
0.1 0.1 // // 1.5 1.5
5
1
CD
0.1 0.1 // //
1.5 1.5
37保温 30分钟 562nm 比色
蛋白含量（mg/ml） =
A样 ×0.2 ×稀释倍数
A标
蛋白标准液浓度
计算
样品的酶活性单位 碱性磷酸酶比活性（U/mg） =
每ml溶液中加入0.36ml丙酮 3000rpm×15min，留沉淀， 5ml Ph8.8的Tris-醋酸镁溶解沉淀 （D液，不稀释）
.
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四、分析及鉴定
1、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法） 2、碱性磷酸酶蛋白含量测定（BCA法） 3、比活性及纯化倍数计算
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分光光度法 （Spectrophotometry）
.
12
参比溶液的选择
溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波 长都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参 比溶液。
试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸 收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收 时，可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液， 这种方式最为常用。
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基本组件及常见分光光度计
510nm 比色
A样
酶活性单位 （U/ml）=
×0.1 ×稀释倍数
A标
酚标准液浓度
蛋白含量测定基本原理－－BCA法
碱性 蛋白质+Cu 2＋
BCA试剂
Cu＋
紫色化合物
二喹啉甲酸，BCA
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稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
单位（ml）
空白管
各阶段稀释液
/
蛋白标准液（0.2mg/ml） /
红色醌式化合物
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稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
/
25 10 5
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单位（ml）
空白管 标准管 A B C D
各阶段稀释液
/
/
酚标准液（0.1mg/ml） / 0.1
Tris-醋酸镁
0.1 /
复合底物液
3
3
0.1 0.1 0.1 0.1 //// //// 3 333
37保温 15分钟 各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min
K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。
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10
对比法进行定量分析
A样 = K ·L ·C样 A标 = K ·L ·C标
A样
K ·L ·C样
C样
A标
K ·L ·C标
C标
C样 = A样·C标 / A标
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Lambert—Beer定律的适用范围：
单色光、平行光（λmax） 溶液均匀、清澈、无散射 溶液性质稳定，比色皿中无化学反应 适用于稀溶液（A 0.2-0.7）
2000rpm×5min，留上清（记录体积）
3、60％乙醇沉淀AKP
每ml溶液中加入95％乙醇0.86ml
3000rpm×5min，留沉淀，
加3ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。
（取0.1ml留作C液，使用时稀释5倍）
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4、33％丙酮溶解AKP
每ml溶液中加入0.33ml丙酮 2000rpm×5min，留上清（记录体积）
根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收 （即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种 定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法 （Absorption spectrometry）。
不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来
.
8
（一）基本原理
1、光的基本知识 光具有波粒二相性。 波长和频率是光的波动性的特征。
二、提取
加入2ml正丁醇，搅拌2min，室温放置30min。过 滤，留上清。计体积。
.
4
三、分离纯化
1、50％丙酮沉淀AKP
加入等体积丙酮，3000rpm×5min，留沉淀，
加4ml 0.5mol/L醋酸镁溶解沉淀，记录体积。
（取0.1ml留作B液，稀释10倍）
Βιβλιοθήκη Baidu
2、30％乙醇溶解AKP
每ml溶液中加入95％乙醇0.46ml
碱性磷酸酶的分离纯化
有机溶剂分步沉淀法
.
1
分离纯化的一般程序
选择材料 破碎细胞
提取
分离纯化
分析及鉴定
.
2
原理：
AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），
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3
操作
一、取材及匀浆
取兔肝2g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分 匀浆。 记录体积 （取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）
紫外分光光度计（200－400nm） 可见光分光光度计（400－760nm） 红外分光光度计（760－1000nm）
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2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
A ＝ K·L·C
吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D )
.
14
分光光度计的使用
1. 打开电源预热15分钟 2. 选择波长（ λmax ） 3. 光标指向Trans 4. 打开光门，调节0％；关上光门调节100％ 5. 重复4一次 6. 将光标指向ABS 7. 读数
.
15
AKP活性测定基本原理－－磷酸苯二钠法
磷酸苯二钠 碱性磷酸酶 苯酚 + 磷酸盐
苯酚 + 4-氨基安替吡啉 + 铁氰化钾 碱性
样品的蛋白含量
纯化倍数 =
每一步比活性 初提液比活性
得率 =
每一步总活性 初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性. × 每一部记录的体积数 20
蒸馏水
0.1
BCA试剂
1.5
/
标准管
/ 0.1 / 1.5
50 20
AB
0.1 0.1 // // 1.5 1.5
5
1
CD
0.1 0.1 // //
1.5 1.5
37保温 30分钟 562nm 比色
蛋白含量（mg/ml） =
A样 ×0.2 ×稀释倍数
A标
蛋白标准液浓度
计算
样品的酶活性单位 碱性磷酸酶比活性（U/mg） =