红花黄色素抗氧化活性研究

第２４卷第５期　２０１２年５月　

化学研究与应用　

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．５　

Ｍａｙ，２０１２　

文章编号：１００４—１６５６（２０１２）０５－０７１５－０７　

红花黄色素抗氧化活性研究　

张欢，张立伟。　（山西大学分子科学研究所，山西太原０３０００６）　

摘要：通过考察红花黄色素（ｓＹ）及其主要化学成分对羟基自由基介导２・脱氧核糖氧化降解的抑制作用，以及　对１，１．二苯基－２．苦肼基自由基（ＤＰＰＨ・）的清除能力，探究ｓＹ的体外抗氧化活性及其抗氧化的主要有效成　分。通过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生羟基自由基，用紫外分光光度计检测了ｓＹ及其主要化学成分对２－脱氧核糖降解的　抑制作用和对ＤＰＰＨ・的清除能力，同时对红花黄色素Ｂ（ＳＹＢ）抑制２－脱氧核糖降解的作用机制做了初步研　究。结果表明ｓＹ抑制Ｆｅｎｔｏｎ反应对２－脱氧核糖的氧化降解的，　为２５６．７９　ｇ／ｍＬ，对ＤＰＰＨ・清除的‰值　为２７．１５　０ｅＪｍＬ。羟基红花黄色素Ａ（ＨＳＹＡ）和ＳＹＢ是ｓＹ中抗氧化的两个有效成分，抑制２・脱氧核糖的氧　化降解的　分别为２２０．６８　ｐ．ｇ／ｍＬ和２０７．０１　Ｉｚｇ／ｍＬ；对ＤＰＰＨ・清除的，　值分别为５５．８ｌ　ｓ／ｍＬ和４１．２５　ｐ．ｇ／ｍＬ。ＳＹＢ对２－脱氧核糖氧化降解的抑制作用机理研究表明，ＳＹＢ除了对Ｆｅｎｔｏｎ反应产生的羟基自由基　具有直接清除作用外，又可通过与Ｆｅ　离子的络合作用而阻断Ｆｅｎｔｏｎ反应产生羟基自由基。由此可知ｓＹ具　有明显的体外抗氧化活性，ＳＹＢ和ＨＳＹＡ为其主要抗氧化活性成分。　关键词：红花黄色素；Ｆｅｎｔｏｎ反应；ＤＰＰＨ・；抗氧化　中图分类号：ＴＳ２０１　文献标识码：Ａ　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｆｆｌｏｗｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ　ＺＨＡＮＧ　Ｈｕａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｌｉ—ｗｅｉ’　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３０００６，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ（ｓＹ）ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍａｉｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ，ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ２－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ＤＰＰＨ・ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ　ｗａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　Ｆｅｎｔｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＳＹ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍａｉｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｎ　２－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｘ－　ｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ＤＰＰＨ・ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｙ　ＵＶ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．Ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ，ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｓａｆｆｌｏｗｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ　Ｂ（ＳＹＢ）ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　２－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＳＹ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　２－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａ１．ＳＹ　ｃｏｕｌｄ　ａｌｓｏ　ｅｌｉｍｉｎａｔｅ　ＤＰＰＨ・ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｌＣ　ｗａｓ　２５６．７９　ｍＬ　ａｎｄ　２７．１５　ｔ￣，／ｍＬ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｂｏｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｈｙｄｒｏｘｙ　ｓａｆｆｌｏｗｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ　Ａ（ＨＳＹＡ）ａｎｄ　ＳＹＢ　ｗｅｒｅ　ｔｗｏ　ｍａｉｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｎ　ＳＹ．Ｔｈｅ　ｌＣ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　２－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｗａｓ　２２０．６８　ｔｘｅ，／ｍＬ　ａｎｄ　２０７．Ｏ１　Ｉ．￣ｇ／ｍＬ。　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｆ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ＤＰＰＨ・ｗａｓ　５５．８１　ｓ／ｍＬ　ａｎｄ　４１．２５　Ｉ￣ｇ／ｍＬ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｔｅｓｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，ａ－　ｐａｒｔ　ｆｒｏｍ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｆｅｎｔｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＳＹＢ　ｃｏｕｌｄ　ａｌｓｏ　ｃｈｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｒｏｎ　ｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｂｌｏｃｋ　Ｆｅｎｔｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｓｏ　ＳＹ　ｈａｄ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｉｌｅ　ＳＹＢ　ａｎｄ　ＨＳＹＡ　ｗｅｒｅ　ｍａｉｎ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ　ｉｎ　ＳＹ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓａｆｆｌｏｗｅｒ　ｙｅｌｌｏｗ；Ｆｅｎｔｏｎ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＤＰＰＨ・；ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ　

收稿日期：２０１２－０１－０５；修回日期：２０１２￣２－２９　基金项目：科技部十二．五“重大新药创制”科技重大专项项目（２０１１ＺＸ０９２０１－２０１－０６）资助；山西省回国留学人员科研基金项目　（Ｎｏ．２００９００３）资助　联系人简介：张立伟（１９６３・），男，教授，研究方向为天然产物。Ｅ－ｍａｉｌ：１ｗｚｈａｎｇ＠ＳＸＵ．ｅｄｔｒ　ｃｒｌ　７１６　化学研究与应用　第２４卷　众所周知，自由基对生物体的危害非常大，它　会引起脂质过氧化反应，破坏机体中细胞膜的结　构，对生物体造成损伤。现代药理研究表明，癌　症、心脑血管疾病及衰老都与自由基有着密切的　联系　。因而，天然抗氧化剂的筛选研究是目前　研究的热点。　红花为菊科植物红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ　Ｌ．）　的干燥管状花，为传统的活血化瘀中药。从红花中　提取的水溶性红花黄色素是红花中主要的抗氧化　组分　Ｊ，可以清除羟自由基、抑制脂质过氧化，保　护脑缺血损伤，保护心肌，保护神经免受损伤＿３引。　为了深入探讨红花黄色素的抗氧化有效成分，本　实验利用大孔吸附树脂ＬＳＡ－２１和制备色谱对红　花黄色素进行了不同层次的分离，分别比较了各　层次分离产物对羟基自由基介导的２一脱氧核糖氧　化损伤的保护作用，以及对ＤＰＰＨ・的清除能力，并　对ＳＹＢ抑制２－脱氧核糖氧化降解的作用机制进行　了初步探讨，旨在筛选红花抗氧化活性成分或组　分，并为红花的药理作用机制研究提供科学依据。　１材料与方法　１．１材料与试剂　红花药材由太原华卫药业有限公司提供；羟　基红花黄色素Ａ对照品中国药品生物制品检验所　（批号：１１１６３７－２００９０５）；红花黄色素Ｂ对照品实　验室自制；２．脱氧核糖上海源叶生物科技有限公　司；ＤＰＰＨ・上海索莱宝生物科技有限公司；其他试　剂均为国产分析纯，所用水为自制蒸馏水。　１．２仪器与设备　ＨＰ８４５３　ＵＶ—Ｖｉｓ吸收光谱仪美国惠普公司；　Ｓｃｉｅｎｔｚ一１２Ｎ冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有　限公司；Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００型高效液相色谱仪美国安捷　伦公司。　１．３方法　１．３．１　红花黄色素各样品制备按文献　方法　操作，略有改动。准确称取红花药材１００　ｇ，加１０　倍水６０℃下提取５０　ｍｉｎ，过滤，药渣再加ｌＯ倍水　８０　ｃｃ下提取５０　ｍｉｎ，过滤，合并两次提取液，并减　压浓缩为０．８　ｇ／ｍＬ的药液。大孔吸附树脂ＬｓＡ一　２１（药材与树脂质量比为ｌ：４）进行分离，水洗除　杂，醇一水体系梯度洗脱，收集１５％乙醇、３０％乙醇　和４０％乙醇洗脱液，冷冻干燥，获得固形物质量分　别为４．８６　ｇ、０．８１　ｇ和３．２０　ｇ，得率分别为　４．８６％、０．８１％和３．２０％。依次标记为组分１、组　分２和组分３；提取浓缩液经大孔吸附树脂ＬＳＡ一　２１吸附后，先用水洗除杂，然后直接用７０％乙醇　洗脱、减压浓缩、冷冻干燥，得总黄色素（ＳＹ）１１．５０　ｇ，得率１１．５０％。组分１和组分３经制备型高效　液相色谱仪反复纯化，分别得到ＨＳＹＡ和ＳＹＢ单　体化合物。利用ＨＰＬＣ分析各个组分的成分组成　或相对含量。　色谱条件：色谱柱ＺＯＲＢＡＸ　ＳＢ．Ｃ１８（４．６　ｍｍ￣　２５０　ｍｍ，５　ｐ，ｍ），流动相ＣＨ３ＯＨ（Ａ）和Ｈ２Ｏ（０．２　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣＩＯ　－０．３％ｏ　ＨＣＩＯ　）（Ｂ）梯度洗脱０－８　ｍｉｎ　１５％Ａ－３５％Ａ，８—１５　ｍｉｎ　３５％Ａ－４０％Ａ，１５—１７　ｒａｉｎ　４０％Ａ－４０％Ａ，１７—２０　ｍｉｎ　４０％Ａ一１５％Ａ，流速ｌ　ｍＬ／ｍｉｎ，柱温４０℃，检测波长４０２　１＂１１１＂１，进样２０　Ｌ。　１．３．２样品溶液配制称取按１．３．１方法制备的　红花黄色素样品（组分１、组分２、组分３、ＳＹ、ＨＳＹＡ　与ＳＹＢ）适量，用水配制成质量浓度均为ｌ０　ｍｅ／ｍＬ　的样液。称取ＳＹＢ样品适量，加水配制成摩尔浓度　为２　ｍｍｏｌ／Ｌ的样品溶液，用于做２一脱氧核糖降解　机理研究。称取ＥＤＴＡ．二钠７．４　ｍｇ于１０　ｍＬ容量　瓶中，加水定容至刻度，配制成２　ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ　溶液。称取Ｆｅ（ＮＨ　）：（ＳＯ　）　・６Ｈ　Ｏ　３９．２　ｍｇ于５０　ｍＬ容量瓶中，加适量水溶解，再加入３６．５％的盐酸　５００　，加水定容至刻度，配制为２　ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ“　溶液。　１．３．３　２．脱氧核糖氧化损伤检测　按文献　方　法操作。通过Ｆｅｎｔｏｎ反应产生羟基自由基，由于　羟基自由基可以使２．脱氧核糖氧化降解，降解物　又可以与硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）反应显色，生成物　在波长５３２　ｎｍ有最大吸收峰　Ｊ，因此，体系中加　人样品后，可以通过测定Ａｓ３２值的变化间接反映样　品对羟基自由基介导的２．脱氧核糖降解的保护作　用或对羟基自由基的清除作用。反应液总体积为　４．５　ｍＬ，实验步骤为：将红花黄色素样品溶液稀配　为０．２　ｍｇ／ｍＬ、１　ｍｅ／ｍＥ、２　ｍｅ／ｍＬ、５　ｍｅ／ｍＥ、８