重组DNA技术详细概述PPT(41张)
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生物化学-核苷酸代谢(共41张PPT)
尿嘧啶磷酸核糖转移酶
尿嘧啶+PRPP
UMP+PPi
1-磷酸核糖
Pi
尿嘧啶核苷
尿苷激酶 Mg2+
UMP
ATP
ADP
胸苷激酶 脱氧胸苷
Mg2+
dTMP
ATP
ADP
x-染色体连锁隐性遗传 缺乏的酶：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT） 免疫缺陷症,
(ribonucleotide) ADA缺乏症患者体内腺苷酸分解代谢严重障碍，T、B淋巴细胞受损，引起反复感染等症状。
痛 风（GOUT）
痛风原因：高嘌呤饮食、体内核 酸分解增强、肾脏疾病
表现：尿酸盐沉积造成损害
别嘌呤醇治疗痛风：机制是别嘌 呤醇在结构上与次黄嘌呤相似 ，抑制黄嘌呤氧化酶
腺苷脱氨酶（ADA）基因位于20q13-qter，编码一条含363个氨 基酸残基的多肽链。
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏引起重症免疫缺陷症，即ADA缺乏症。ADA缺乏 症患者体内腺苷酸分解代谢严重障碍，T、B淋巴细胞受损，引起反 复感染等症状。
硫氧还蛋白
S S
谷氧还蛋白还原酶
硫氧还蛋白还原酶
G SSG
2G SH
谷胱甘肽还原酶
NADPH +H +
N A D P+
FAD
FA D H 2
硫氧还蛋白还原酶
NADPH +H +
NADP+
脱氧胸苷酸（dTMP）的生成
尿苷一磷酸激酶
尿苷二磷酸激酶
UMP
UDP
UTP
ATP合酶
CTP
ATP
ADP
ATP
ADP 谷氨酰胺
鸟苷一磷酸 (GMP) 鸟苷二磷酸 (GDP) 鸟苷三磷酸 (GTP)
分子生物学ppt课件
基因组大小(Mb)
0.58 1.83 4.20 4.60 13.50 12.50 466 165 97 2700 3000
基因数
470 1743 4100 4288 6034 4929 30000 13601 18424 30000 25000
染色体数*
无 无 无 无 16 16 21 4 6 20 23
包括：
结构基因组学
功能基因组学
三个亚领域.
比较基因组学
28
29
一、病毒基因组 二、原核生物基因组 三、真核生物基因组
30
一、病毒基因组
基因组（genome） 1个配（精子或卵子），1个单倍 体细胞或1个病毒所包含的全套遗传物质的总和。病毒核酸 或为DNA或为RNA，可以统称为病毒染色体。
完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不 受核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。
分子生物学
Molecular Biology
1
What is Molecular Biology?
分子生物学是从分子水平研究生命现象、生命规律和生命本质 的学科。
核心内容是从分子水平研究基因和基因的活动，这些活动主要 通过核酸和蛋白质的活动来实现。
医学分子生物学主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、 功能、相互作用及其与疾病发生、发展的关系。
16
三、基因的结构特点和分类
基因的结构
结构基因：编码区序列（coding region sequence ）
在细胞内表达为蛋白质或功能RNA的DNA序列
转录调控序列：非编码序列（non-coding sequence）
基因表达需要的调控区（regulatory region）序列， 包括启动子（promoter）、增强子（enhancer）等。
人教版高中生物必修一第六章第1节《细胞的增殖》优秀课件(41张)(共41张PPT)
2、细胞分裂期 前期 中期 后期 末期
核膜 核仁 染色质 着丝点 间期
染色体复制
DNA的复制和有关蛋白质的合成
染色体复制
_1__个DNA _1__个染色体 __0__个姐妹染色单体
A
A’
_2__个DNA _1__个染色体 _2__个姐妹染色单体
间期：染色体复制、DNA分子数目加倍
G1：DNA合成前期，进行RNA和 蛋白质的合成。（用时最长）
2、染色体平均移 向两极
末期
1、染色体→染色质 2、新的核膜、核仁出现，
细胞核重新形成。纺 锤体消失
3、赤道板中央位置出现 细胞板，并向外围扩 展形成新的细胞壁， 细胞质分离成两部分
4、1个亲代细胞→2个核 遗传物质完全相同的 子代细胞。
两体消失，两出现
相同
1、都有间期和分裂期。分 裂期都有前、中、后、末四个 阶段。
细胞缢裂。
植物细胞有丝分裂 动物细胞有丝分裂
前 细胞两极产生纺锤丝，由中心粒发出的星射线
期 形成纺锤体
形成纺锤体
不 同
末 期
细 扩 成胞展 两中形 个部成 子形细细成胞胞细壁胞，板形，细胞个胞胞质细膜缢胞从 裂 分中 成 裂部 两 成内 部 两陷 分 个， ， 子细 一 细
相 同
分裂过程基本相同。染色体变化规律相同；分 裂间期染色体复制；分裂期实现染色体平均分 配到两个子细胞中去
2、分裂产生的两个子细胞 的染色体数目和组成完全相同 且与母细胞完全相同。染色体 在各期的变化也完全相同。
前期
末期
动物细胞和植物细胞有丝分裂的不同
21、、末前观期期察细纺上胞锤质体面的的前分来期裂源：和末期的两 组 有植动植动图什物物物物胞，么：：：：壁细细由由动不将胞胞两中细物同中中极心胞细？部部直体隔出的接周胞开现细产围。和细胞生产植胞膜。生板向的物形内星细成凹射胞新陷线细使形各成。
核膜 核仁 染色质 着丝点 间期
染色体复制
DNA的复制和有关蛋白质的合成
染色体复制
_1__个DNA _1__个染色体 __0__个姐妹染色单体
A
A’
_2__个DNA _1__个染色体 _2__个姐妹染色单体
间期：染色体复制、DNA分子数目加倍
G1：DNA合成前期，进行RNA和 蛋白质的合成。（用时最长）
2、染色体平均移 向两极
末期
1、染色体→染色质 2、新的核膜、核仁出现，
细胞核重新形成。纺 锤体消失
3、赤道板中央位置出现 细胞板，并向外围扩 展形成新的细胞壁， 细胞质分离成两部分
4、1个亲代细胞→2个核 遗传物质完全相同的 子代细胞。
两体消失，两出现
相同
1、都有间期和分裂期。分 裂期都有前、中、后、末四个 阶段。
细胞缢裂。
植物细胞有丝分裂 动物细胞有丝分裂
前 细胞两极产生纺锤丝，由中心粒发出的星射线
期 形成纺锤体
形成纺锤体
不 同
末 期
细 扩 成胞展 两中形 个部成 子形细细成胞胞细壁胞，板形，细胞个胞胞质细膜缢胞从 裂 分中 成 裂部 两 成内 部 两陷 分 个， ， 子细 一 细
相 同
分裂过程基本相同。染色体变化规律相同；分 裂间期染色体复制；分裂期实现染色体平均分 配到两个子细胞中去
2、分裂产生的两个子细胞 的染色体数目和组成完全相同 且与母细胞完全相同。染色体 在各期的变化也完全相同。
前期
末期
动物细胞和植物细胞有丝分裂的不同
21、、末前观期期察细纺上胞锤质体面的的前分来期裂源：和末期的两 组 有植动植动图什物物物物胞，么：：：：壁细细由由动不将胞胞两中细物同中中极心胞细？部部直体隔出的接周胞开现细产围。和细胞生产植胞膜。生板向的物形内星细成凹射胞新陷线细使形各成。
菌种选育方法
SDS－PAGE 免疫分析 细胞 破碎 培养 蛋白 分离
滤 纸
凝胶
免疫 分析
NC 膜
＋
转膜
38
工程菌的稳定性问题
由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、 乙肝表面抗原、人促红细胞生成素(EPO)、重组激酶、集落 刺激因子GM-CSF等，成本大大下降
研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出 不稳定性，因而工程菌稳定性的解决已日益受到重视，并成 为基因工程这一高技术成就转变为生产力的关键之一。
保持菌株不变异，不退化。
45
菌种退化原因
基因突变
自发负突变 回复突变：生产株成为野生型
分离现象：多核（或单核）但是DNA双链之一发生
突变，随着传代，核发生分离，导致突变基因和未
突变基因的分离。
46
菌种保藏的原理和方法
原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点， 人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽 量降低，以减少其变异。
生物工艺学
2 菌种选育(4)
1
主要内容
菌种选育
自然选育 诱变育种
抗噬菌体菌株的选育
杂交育种
原生质体融合技术
DNA重组技术 菌种保藏
2
2.2.6 DNA重组技术
概述
基因工程（genetic engineering） ：在生物体外，通过对DNA分 子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和 重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在 受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物（70年代，基于 DNA限制新性内切酶、DNA连接酶的发现） 。
分子生物学课件(共51张PPT)(2024)
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
21
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
抗体：参与免疫应答。
2024/1/29
功能蛋白
激素：调节生物体的生理活动。
蛋白质的分类还可以根据其溶解度、形状等进行划分。 例如，根据溶解度可分为清蛋白、球蛋白等；根据形状 可分为纤维状蛋白和球状蛋白等。
RNA的基本组成单位是核糖核苷酸， 由磷酸、核糖和碱基组成。
磷酸二酯键
核糖核苷酸之间通过磷酸二酯键连接 形成RNA链。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌呤（A）、 鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶 （U）。
2024/1/29
12
RNA的种类与结构
mRNA
信使RNA，负责携带遗 传信息并指导蛋白质合
成。
翻译水平调控
通过控制翻译的起始、延伸和 终止来调控基因表达。
蛋白质水平调控
通过控制蛋白质的活性、稳定 性和相互作用来调控基因表达
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
2024/1/29
18
05
蛋白质的结构与功能
2024/1/29
19
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
2024/1/29
tRNA
转运RNA，负责携带氨 基酸并识别mRNA上的
遗传密码。
rRNA
其他RNA
核糖体RNA，是核糖体 的组成部分，参与蛋白
质合成。
13
如miRNA、snRNA等， 在基因表达调控等方面
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
21
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
抗体：参与免疫应答。
2024/1/29
功能蛋白
激素：调节生物体的生理活动。
蛋白质的分类还可以根据其溶解度、形状等进行划分。 例如，根据溶解度可分为清蛋白、球蛋白等；根据形状 可分为纤维状蛋白和球状蛋白等。
RNA的基本组成单位是核糖核苷酸， 由磷酸、核糖和碱基组成。
磷酸二酯键
核糖核苷酸之间通过磷酸二酯键连接 形成RNA链。
碱基
RNA中的碱基主要有腺嘌呤（A）、 鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶 （U）。
2024/1/29
12
RNA的种类与结构
mRNA
信使RNA，负责携带遗 传信息并指导蛋白质合
成。
翻译水平调控
通过控制翻译的起始、延伸和 终止来调控基因表达。
蛋白质水平调控
通过控制蛋白质的活性、稳定 性和相互作用来调控基因表达
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
2024/1/29
18
05
蛋白质的结构与功能
2024/1/29
19
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
2024/1/29
tRNA
转运RNA，负责携带氨 基酸并识别mRNA上的
遗传密码。
rRNA
其他RNA
核糖体RNA，是核糖体 的组成部分，参与蛋白
质合成。
13
如miRNA、snRNA等， 在基因表达调控等方面
《分子克隆》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶电泳法筛选第六节重组dna分子的操作过程118限制性内切酶dna连接酶基因载体目的基因染体外包装带重组体的宿主细胞表型筛选电泳法核酸杂交免疫学方法目的基因的表达119农业应用获得高产稳产和具有优良品质的农作物向日葵培育具有抗逆性的作物新品种抗虫抗病毒抗除草剂抗盐碱抗高温抗干旱第七节基因工程的应用培育体形巨大品质优良的动物超级小鼠超级绵羊超利用特定的外源基因在哺乳动物体内表达获得人们需要的物质激素抗体酶食品工业开辟新是食品来源鸡蛋白基因导入大肠杆菌和酵母菌中畜牧养殖业120世界上第一只转基因动物能产药的奶牛转基因羊转基因鱼上面121本章结束本章结束此课件下载可自行编辑修改供参考
ppt课件
7
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
ppt课件
8
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
ppt课件
35
第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
ppt课件
7
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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8
第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
ppt课件
35
第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
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动物和植物 基到某种载体上能够 代表所有可能序列并且可以稳定维持和使用的 DNA片段的集合。根据序列的来源，可分 为基因组和cDNA。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
pUC18/19质粒的基本结构
常见的几种RE识别的碱基序列和切点性Hale Waihona Puke II类限制性内切酶的三种切割方式
不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火
宿主细胞
宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。 理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但 最为常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地 贪夜蛾的培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。
λ噬菌体载体的构建、重组和包装
细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入
酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入
将外源基因或序列导入载体的工具
将外源基因或序列导入到载体需要特殊 的工具酶，其中以限制性内切酶（RE） 和连接酶最为重要，此外，有时还需要 DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸 酶等。
重组DNA技术
中心法则
转录
编码链，有意义链， Crick 链
翻译
重组DNA技术的基本步骤
基因克隆的载体
载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们带 入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。一种理想的 载体至少满足以下几个条件：
（1）大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于 在原核系统中的扩增；
直接筛选 1. 根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 2. 根据营养需要进行筛选 3. 根据噬菌斑类型进行筛选 4. 蓝白斑选择
间接筛选 1. 核酸杂交法 2. PCR法 3. 免疫化学 4. 受体/配体的结合性质 5. Southwestern/Northwestern 6. DNA限制性内切酶图谱分析 7. DNA序列分析
蓝白筛选法图解
基因克隆的详细步骤
获得外源DNA序列和目的基因； 将目的基因与载体相连； 将重组体导入特定的宿主细胞； 目的基因序列克隆的筛选与鉴定。
获取目的基因的手段
人工合成 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆
载体中释放出来 反转录 PCR
目的基因与载体的连接
将外源序列或目的基因插入载体，主要 是靠DNA连接酶和其它工具酶的配合使 用。根据末端的性质，它们的连接方式 主要有三种：（1）载体和目的基因具有 相同的粘性末端；（2）载体和目的基因 均为平端；（3）载体和目的基因各有一 个粘性末端和一个平端。选择哪一种连 接方式主要取决于载体的性质（特别是 MCS
要使克隆基因在宿主细胞中表达，首先需要将目的基因亚克隆到 带有基因表达所必需的各种元件的载体之中，这些载体通称为表 达载体。目的基因可以放在不同的宿主细胞中表达。针对不同的 表达系统，需要构建不同的表达载体。
表达载体可分为融合载体和非融合载体两类，前者在插入位点上 “预装”了另外一个蛋白质或多肽的基因，因此，插入的外源基 因将会与它发生融合，表达出来的是一种融合蛋白。使用融合载 体的主要好处是方便了目的蛋白的纯化。
理想的表达系统应该满足以下条件：（1）表达载体具有合适的 MCS，以便使外源基因能够插入到正确的表达位置，或者至少是 含有3个以上阅读框架的系列；（2）能够形成正确的翻译后修饰 和三维结构，以形成有活性的或有功能的分子；（3）为可诱导的 表达系统，允许细胞生长和诱导表达，防止毒性蛋白质的积累； （4）易于分离和纯化；（5）最好能分泌到胞外。
限制性内切酶
限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异性的DNA内切酶， 它们识别双链DNA分子内部特殊的碱基序列（通常为4bp~6 bp的回文序 列），切开DNA的两条链，产生特定的末端。
限制性内切酶的命名是按照酶的来源菌的属名和种名而定，由属名的第 一个字母和种名的头两个字母组成的三个斜体字母缩写而成。如有菌株 名，再加上一个字母，其后再按发现的次序添上罗马数字。例如，第一 种限制性内切酶是在大肠杆菌RY13（E. coli RY13）被发现的，按照上述 规则，它被命名为EcoRI。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
pUC18/19质粒的基本结构
常见的几种RE识别的碱基序列和切点性Hale Waihona Puke II类限制性内切酶的三种切割方式
不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火
宿主细胞
宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。 理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但 最为常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地 贪夜蛾的培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。
λ噬菌体载体的构建、重组和包装
细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入
酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入
将外源基因或序列导入载体的工具
将外源基因或序列导入到载体需要特殊 的工具酶，其中以限制性内切酶（RE） 和连接酶最为重要，此外，有时还需要 DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸 酶等。
重组DNA技术
中心法则
转录
编码链，有意义链， Crick 链
翻译
重组DNA技术的基本步骤
基因克隆的载体
载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们带 入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。一种理想的 载体至少满足以下几个条件：
（1）大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于 在原核系统中的扩增；
直接筛选 1. 根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 2. 根据营养需要进行筛选 3. 根据噬菌斑类型进行筛选 4. 蓝白斑选择
间接筛选 1. 核酸杂交法 2. PCR法 3. 免疫化学 4. 受体/配体的结合性质 5. Southwestern/Northwestern 6. DNA限制性内切酶图谱分析 7. DNA序列分析
蓝白筛选法图解
基因克隆的详细步骤
获得外源DNA序列和目的基因； 将目的基因与载体相连； 将重组体导入特定的宿主细胞； 目的基因序列克隆的筛选与鉴定。
获取目的基因的手段
人工合成 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆
载体中释放出来 反转录 PCR
目的基因与载体的连接
将外源序列或目的基因插入载体，主要 是靠DNA连接酶和其它工具酶的配合使 用。根据末端的性质，它们的连接方式 主要有三种：（1）载体和目的基因具有 相同的粘性末端；（2）载体和目的基因 均为平端；（3）载体和目的基因各有一 个粘性末端和一个平端。选择哪一种连 接方式主要取决于载体的性质（特别是 MCS
要使克隆基因在宿主细胞中表达，首先需要将目的基因亚克隆到 带有基因表达所必需的各种元件的载体之中，这些载体通称为表 达载体。目的基因可以放在不同的宿主细胞中表达。针对不同的 表达系统，需要构建不同的表达载体。
表达载体可分为融合载体和非融合载体两类，前者在插入位点上 “预装”了另外一个蛋白质或多肽的基因，因此，插入的外源基 因将会与它发生融合，表达出来的是一种融合蛋白。使用融合载 体的主要好处是方便了目的蛋白的纯化。
理想的表达系统应该满足以下条件：（1）表达载体具有合适的 MCS，以便使外源基因能够插入到正确的表达位置，或者至少是 含有3个以上阅读框架的系列；（2）能够形成正确的翻译后修饰 和三维结构，以形成有活性的或有功能的分子；（3）为可诱导的 表达系统，允许细胞生长和诱导表达，防止毒性蛋白质的积累； （4）易于分离和纯化；（5）最好能分泌到胞外。
限制性内切酶
限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异性的DNA内切酶， 它们识别双链DNA分子内部特殊的碱基序列（通常为4bp~6 bp的回文序 列），切开DNA的两条链，产生特定的末端。
限制性内切酶的命名是按照酶的来源菌的属名和种名而定，由属名的第 一个字母和种名的头两个字母组成的三个斜体字母缩写而成。如有菌株 名，再加上一个字母，其后再按发现的次序添上罗马数字。例如，第一 种限制性内切酶是在大肠杆菌RY13（E. coli RY13）被发现的，按照上述 规则，它被命名为EcoRI。