鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究
随着畜牧业集约化和规模化的发展
随着畜牧业集约化和规模化的发展，健康养殖和食品安全已经引起人们的广泛关注。
尤其是以抗生素为代表的化学药品的大量使用，造成细菌耐药性以及畜产品中兽药残留的问题日益严重。
中药以其毒性低、副作用小、多靶点、病原微生物对其不易产生耐药性的优点引起人们越来越多的重视。
中草药免疫增强剂在免疫抑制性疾病和增强机体免疫效应方面发挥着强大的作用。
免疫增强剂(Inununopotentiator)是一类能单独与抗原同时使用，通过不同的作用方式来增强动物机体非特异性和特异性免疫的物质，如增强巨噬细胞活性、抗原物质的免疫原性和稳定性，促进抗体的合成与分泌等。
有些能非特异性地改变或增强抗原物质特异性免疫应答和发挥辅助作用的佐剂，也可称作免疫增强剂，比如胸腺激素及干扰素等生化制剂。
不同的中药成分其免疫增强作用的机制也不尽相同,尤其凸现在多靶点效应。
因此，中草药免疫增强剂在促进畜禽健康养殖过程中必将拥有广阔的发展前景。
一、中药免疫增强剂的特点（一）资源丰富，简便价廉中草药是我国传统医学的重要组成部分，有2000多年的应用历史，其原料来源广泛，种类繁多。
据统计，具有明显免疫增强作用的中草药将近200多种，除极少数是人工种植外，多数为野生。
成本低廉，易于推广应用。
（二）无毒副作用，无残留化学药物常在动物的体内蓄积残留，引起毒副作用，降低畜禽的免疫力，继而污染环境，危害人体的健康。
而中草药免疫增强剂多数无残留，不会致畸、致癌、致突变。
即使是用于防病治病的有毒中草药，经过传统炮制方法加工和科学配伍后，也可以减轻毒性或者消除毒性。
在使用剂量上，即使为常用剂量的数倍或几十倍以上，也未见机体有异常变化，安全性好。
据报道，应用40克泽漆，剂量是常用剂量的10倍。
煎水，1次灌服治疗畜禽疾病的安全范围大。
（三）无抗药性目前畜禽生产中使用的抗生素和化学药物均具有不同程度的耐药性，而中草药免疫增强剂以其独特的抗微生物作用的原理，基本不产生抗药性。
现有的研究表明，许多中药在体外实验中无显著性抑菌作用。
执业兽医资格考试预防科目(兽医微生物学与免疫学)历年真题试卷
执业兽医资格考试预防科目（兽医微生物学与免疫学）历年真题试卷汇编4(题后含答案及解析)题型有：1. A1型题1．病毒感染细胞的关键物质是( )。
A．核衣壳B．核酸C．衣壳D．纤突E．囊膜正确答案：B解析：病毒核酸携带病毒全部的遗传信息，是病毒的基因组。
它是决定病毒的感染性、复制特性、遗传特性的物质基础。
病毒核酸作为模板可在细胞内复制合成子代病毒基因组，并最终形成完整的子代病毒。
知识模块：兽医微生物学与免疫学2．下列微生物中，属于非细胞型微生物的是( )。
A．衣原体B．立克次体C．噬菌体D．支原体E．放线菌正确答案：C解析：噬菌体又称细菌病毒，是一类专门寄生在细菌体内的病毒，具有病毒的共同特性，因此噬菌体也为非细胞型微生物。
知识模块：兽医微生物学与免疫学3．病毒的培养方法不包括( )。
A．动物接种B．细胞培养C．鸡胚培养D．培养基培养E．以上都是正确答案：D解析：试验动物、鸡胚和细胞可用于病毒培养。
知识模块：兽医微生物学与免疫学4．下列病毒中，以产蛋下降为主要致病特征的是( )。
A．鸡传染性喉气管炎病毒B．鸡马立克氏病病毒C．鸡瘟病毒D．鸡产蛋下降综合征病毒E．新城疫病毒正确答案：D解析：产蛋下降综合征病毒是禽腺病毒属成员，感染禽以产蛋下降为特征，表现为产蛋骤然下降，产软壳蛋、无壳蛋或褪色蛋。
知识模块：兽医微生物学与免疫学5．下列病毒中，无囊膜的是( )。
A．小鹅瘟病毒B．马立克氏病病毒C．新城疫病毒D．鸭瘟病毒E．禽流感病毒正确答案：A解析：小鹅瘟病毒，即鹅细小病毒，病毒粒子呈球形或六角形，无囊膜。
主要侵害3～20日龄小鹅，以传染快、高发病率、高死亡率、严重下痢和渗出性肠炎为特征。
知识模块：兽医微生物学与免疫学6．能够对抗原或抗体进行定位的检测方法是( )。
A．凝集试验B．沉淀试验C．中和试验D．免疫组化试验E．补体溶血试验正确答案：D解析：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，并对其进行定位、定性及定量的研究。
传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的原核表达及其免疫效果评价
河南农业科学,2020,49(9):136-142Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi :10.15933/ki.1004-3268.2020.09.017收稿日期:2020-03-04基金项目:国家重点研发计划项目(2017YFD0501100);国家自然科学基金项目(31802165)作者简介:李甜甜(1995-),女,河南济源人,在读硕士研究生,研究方向:畜禽新型疫苗㊂E -mail:tiantianli0113@ 通信作者:张改平(1960-),男,河南内黄人,研究员,中国工程院院士,博士,主要从事动物免疫学研究㊂E -mail:zhanggaiping2003@传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价李甜甜1,2,蒋大伟1,姬鹏超1,王银铃1,张改平1,2,3(1.河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;3.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州225009)摘要:为提高原核表达传染性法氏囊病毒(IBDV )VP2蛋白纯度,在大肠杆菌中表达VP2蛋白,并对其进行纯化方法优化及其免疫原性分析㊂利用琼脂扩散试验(AGP )测定VP2蛋白效价并进行SDS -PAGE 和Western blot 鉴定;采用饱和硫酸铵溶液和离子交换层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化填料㊁洗脱液离子强度及缓冲液的pH 值进行优化,以确定最佳纯化条件㊂将纯化的VP2蛋白免疫SPF 鸡,定期采血用ELISA 方法测定其免疫抗体并进行病理组织检测㊂SDS -PAGE 及West-ern blot 鉴定结果显示,VP2分子质量约为50ku ,且具有良好反应原性,VP2蛋白可溶性表达的AGP 效价为1ʒ16㊂纯化结果显示,利用强阴离子层析优化盐离子浓度及pH 值可获得纯度较高的VP2蛋白,其质量浓度为0.6mg /mL ㊂纯化的VP2蛋白加商业佐剂免疫鸡28d 后,鸡产生的特异性免疫抗体滴度最高,且攻毒后的保护率可达到80%,法氏囊无明显病理组织损伤㊂综上,利用大肠杆菌成功表达了VP2蛋白,纯化的VP2蛋白纯度较高且具有良好的免疫原性㊂关键词:传染性法氏囊病病毒;VP2蛋白;大肠杆菌;蛋白质纯化;免疫原性中图分类号:S855.3㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)09-0136-07Prokaryotic Expression of VP2Protein of Infectious Bursal DiseaseVirus and Its Immunization EvaluationLI Tiantian 1,2,JIANG Dawei 1,JI Pengchao 1,WANG Yinling 1,ZHANG Gaiping 1,2,3(1.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China;3.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseasesand Zoonoses,Yangzhou 225009,China)Abstract :In order to improve the purity of infectious bursal disease virus(IBDV)VP2protein,this study expressed VP2protein in Escherichia coli ,optimized purification methods and estimated its immunogenici-ty.VP2protein was identified by SDS-PAGE and Western blot.The titer of VP2protein was evaluated by the agar gel immunodiffusion test(AGP).To determine the optimal purification conditions,the target pro-tein was purified by saturated ammonium sulfate solution and ion exchange chromatography,and various steps in proteins purification were optimized to determine the optimal purification conditions including the purified packing,eluent concentration and pH value of the buffer.Then,SPF chickens were immunized with the purified VP2protein,and the immunogenicity of VP2protein was determined with ELISA by de-tecting the periodically collected blood.The results showed that VP2protein was 50ku and had good re-㊀第9期李甜甜等:传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价actogenicity by SDS-PAGE and Western blot,and the titer of VP2protein determined by AGP was1ʒ16. Using a strong anion column to optimize the salt ion concentration and pH value,a higher purity VP2pro-tein could be obtained with concentration of0.6mg/mL.Twenty-eight days after immunized with purified VP2protein and commercial adjuvant,the titer of specific antibodies was the highest,and the protection rate could reach80%.No obvious histopathological damage was found in the bursal.Above all,VP2pro-tein was successfully expressed in Escherichia coli,and the purification method was optimized.The puri-fied VP2protein had high purity and good immunogenicity.Key words:Infectious bursal disease virus;VP2protein;Escherichia coli;Protein purification;Immu-nogenicity㊀㊀传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雏鸡的一种急性㊁高度传染性的免疫抑制性疾病[1]㊂自该病被发现以来,在世界各地广泛流行,随后变异毒株㊁强毒株及超强毒株的不断出现,使得传统疫苗不能为宿主提供有效的免疫保护,从而对养禽业造成了巨大的危害[2]㊂IBDV属于双RNA病毒科㊁禽双RNA病毒属,其基因组由A和B2个片段组成,共编码5种蛋白质,分别为VP1㊁VP2㊁VP3㊁VP4和VP5[3]㊂其中VP2是IBDV的主要结构蛋白和主要宿主保护性抗原,包含了诱导病毒中和抗体的抗原区域,其诱导的中和抗体能保护宿主不受IBDV感染[4-5]㊂此外, VP2与抗原变异和病毒毒力密切相关[6]㊂因此, VP2一直是研究IBD亚单位疫苗的目标蛋白㊂目前,VP2蛋白已在多种表达系统中成功表达,如大肠杆菌[7]㊁昆虫细胞[8]㊁酵母[9]和植物[10]等㊂其中,利用杆状病毒表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,但生产成本高㊁产量低㊁纯化方法复杂,不易于工业生产[11-12]㊂相比之下,大肠杆菌表达系统具有生长速度快㊁操作简便㊁成本低㊁可用于发酵等优点,被广泛应用于工业生产中[13]㊂研究者常选择亲和层析[14]㊁凝胶过滤㊁蔗糖梯度离心[15]和氯化铯梯度离心[16]等方法纯化目的蛋白,其中亲和层析纯化的蛋白质需要经透析去除咪唑,此过程蛋白质容易发生聚集析出,不适用疫苗的制备,其他方法由于操作复杂㊁耗时长或需要特殊设备等问题不能应用于工业生产㊂而盐沉淀法[17]㊁离子交换层析[18]㊁疏水相互作用层析等具有低成本㊁易操作㊁可用于大量蛋白质纯化的特点,对于工业纯化蛋白质是很好的选择㊂为了获得可用于工业生产的高通量及大规模纯化VP2蛋白的方法,利用大肠杆菌表达VP2蛋白,并经饱和硫酸铵沉淀和离子交换层析等方法进行纯化以获得纯度较高的目的蛋白,并检测其免疫原性,以期为进一步研究IBD亚单位疫苗和建立IBDV检测方法提供参考㊂1㊀材料和方法1.1㊀菌株、质粒pET28a-VP2重组质粒由河南省农业科学院动物免疫学重点室验室构建并保存,JM109感受态细胞和BL21(DE3)感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司㊂1.2㊀主要试剂限制性内切酶Bam HⅠ和XhoⅠ㊁DL2000DNA Marker㊁λHindⅢDNA Marker等均购自大连宝生物公司;IPTG㊁彩虹180广谱蛋白质Marker和BCA蛋白质定量试剂盒等均购自北京索莱宝科技有限公司;His-Tag单克隆抗体购自Proteintech公司;羊抗鼠IgG-HRP二抗购自Abbkine公司;超敏ECL化学发光试剂盒购自新赛美生物技术有限公司;Q Seph-arose TM Fast Flow和DEAE Sepharose TM Fast Flow均购自GE Healthcare公司;IBDV标准阳性抗原㊁IB-DV标准阳性抗体和IBDV标准强毒株BC6/85等均购自中国兽医药品监察所;IBDV ELISA试剂盒购自北京天之泰生物科技有限公司;其余试剂均为国产分析纯试剂㊂1.3㊀供试动物30只3周龄SPF鸡购自山东斯派福瑞公司㊂1.4㊀重组表达质粒的鉴定重组质粒(pET28a-VP2)转化至JM109感受态细胞,重组质粒用Bam HⅠ和XhoⅠ内切酶进行双酶切鉴定并送公司测序㊂1.5㊀VP2蛋白的诱导表达与鉴定1.5.1㊀诱导表达㊀将鉴定正确的重组质粒pET28a-VP2转化到BL21(DE3)感受态细胞,涂布于含卡那抗性的LB平板上,37ħ倒置培养过夜,然后挑取单菌落接种到含100μg/mL卡那霉素的LB 液体培养基中,37ħ㊁200r/min培养至OD600约为0.5,加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于37ħ培养16h㊂收集培养后的菌液于10000r/min 离心10min,弃去上清收集菌体,用PBS缓冲液重731河南农业科学第49卷悬菌体,并进行超声破碎(振动频率50Hz,工作4s,间歇6s,持续10min),破碎后,于4ħ㊁10000r/min 离心20min,分离上清与沉淀,进行SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色并脱色,观察结果㊂1.5.2㊀Western blot鉴定㊀诱导表达的蛋白质经SDS-PAGE分离后,经半干转膜法转移到PVDF膜上,5%的脱脂奶室温封闭2h后,一抗为1ʒ3000稀释的His-Tag单克隆抗体,37ħ孵育1h,PBST洗涤3次,每次5min,二抗为1ʒ1000稀释的羊抗鼠IgG-HRP,37ħ孵育1h,PBST洗涤3次,每次5min,ECL显色液显色㊂1.5.3㊀AGP检测㊀制备琼脂平板,用梅花打孔器在琼脂平板上打孔,在琼脂平板中间孔加IBDV标准阳性抗体,外周孔加IBDV标准阳性抗原和PBS 稀释的VP2蛋白,且依次按1ʒ2㊁1ʒ4㊁1ʒ8㊁1ʒ16和1ʒ32进行稀释,将琼脂平板平放在湿盒内,于37ħ温箱中孵育2~3d,以测定VP2蛋白表达量㊂1.6㊀VP2蛋白纯化条件的优化1.6.1㊀饱和硫酸铵沉淀法纯化VP2蛋白㊀利用饱和硫酸铵沉淀蛋白的方法,纯化1.5.1中收获的上清㊂上清液中加入饱和硫酸铵溶液,至饱和硫酸铵体积百分比为10%,充分混悬,4ħ放置10min; 10000r/min离心10min,分离沉淀与上清,再向上清中继续加入饱和硫酸铵溶液,使其百分比从10%升高到20%,同上操作,依次增至30%㊁40%㊁50%㊁60%㊁70%,每次离心保留的沉淀用离子交换层析所使用的Binding Buffer进行重悬,并处理样品,进行SDS-PAGE与Western blot分析㊂1.6.2㊀离子交换层析填料及洗脱液浓度的优化㊀上清液中加入饱和硫酸铵溶液至终含量为30%, 4ħ放置10min;10000r/min离心10min,沉淀用Binding Buffer(30mmol/L PB,pH值为7.0)充分混悬,透析,除盐并使用0.45μm的滤膜进行过滤㊂得到的样品分别利用DEAE Sepharose TM Fast Flow (DEAE)和Q SepharoseTM Fast Flow(Q)进行纯化,流速2mL/min,Binding Buffer平衡5个柱体积后上样,之后依次使用含200㊁300㊁500mmol/L NaCl的缓冲液(pH值为7.0)洗脱蛋白质,收集洗脱液,进行SDS-PAGE分析㊂1.6.3㊀离子交换层析缓冲液pH值的优化㊀分别使用不同pH值(6.5㊁7.0㊁7.5㊁8.0)的缓冲液对目的蛋白进行纯化,流速2mL/min,Binding Buffer平衡5个柱体积后上样,之后使用含200mmol/L NaCl 的缓冲液洗脱目的蛋白,收集洗脱液,进行SDS-PAGE分析㊂1.7㊀动物试验将30只鸡随机分为3组,每组10只,A组:VP2蛋白;B组:VP2蛋白加Montanide TM ISA71VG佐剂;C组:PBS阴性对照组㊂均采用肌肉注射的方式进行免疫,免疫剂量为200μL(10μg/羽),分别在免疫后的第7㊁14㊁21㊁28天,翅下静脉采血并分离血清,采用IBDV ELISA试剂盒检测抗体效价㊂1.8㊀病毒攻毒试验在免疫28d后,用IBDV标准强毒株BC6/85进行攻毒保护试验,攻毒剂量为10-5BID50㊂攻毒后观察鸡的临床症状,4d后剖检供试鸡,观察腿肌㊁法氏囊等组织的病理变化,称量体质量和法氏囊质量,并计算囊重比和囊指数㊂囊重比=法氏囊质量/体质量ˑ1000;囊指数=试验组囊重比/空白对照组囊重比㊂1.9㊀法氏囊组织学病理检测取出鸡法氏囊组织置于10%甲醛溶液中固定,之后用石蜡包埋,切片,HE染色,观察组织病理学变化,判定法氏囊组织学损伤分数(1 4)㊂1分:正常的淋巴滤泡或淋巴细胞减少,无任何局灶性坏死或明显水肿的迹象;2分:中度淋巴损伤,伴有局灶性坏死;3分:严重的淋巴细胞损伤,几乎没有淋巴细胞,有网状细胞和增生的纤维组织;4分:卵泡萎缩,有明显的纤维化㊂2㊀结果与分析2.1㊀重组质粒pET28a-VP2的酶切鉴定从活化的重组菌JM109(pET28a-VP2)菌液中提取质粒,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,获得的目的片段及载体的大小分别与预期片段大小一致(图1),表明连接的重组载体pET28a-VP2构建成功㊂测序结果也表明,重组载体中的VP2片段序列正确㊂2.2㊀VP2蛋白的诱导表达与鉴定重组菌(pET28a-VP2)在37ħ㊁0.5mmol/L的IPTG诱导16h后,离心收集菌体,超声破碎后分别收集上清与沉淀进行SDS-PAGE与Western blot检测㊂SDS-PAGE结果显示(图2A),在分子质量50ku 处有表达条带,与VP2蛋白预期大小一致㊂此外,破碎沉淀中条带更明显,说明表达的目的蛋白主要以包涵体形式出现㊂Western blot结果(图2B)与SDS-PAGE中的目标条带一致,表明VP2蛋白在大肠杆菌中成功表达㊂琼脂扩散试验结果显示(图3),表达的VP2蛋白可以与标准阳性抗体反应形成沉淀线,效价为1ʒ16,表明其具有良好的反应原性㊂831㊀第9期李甜甜等:传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价M1:λHind Ⅲ;1,2:pET28a -VP2;M2:DL2000图1㊀重组质粒pET28a -VP 2的Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定Fig.1㊀Identification of recombinant plasmid pET28a-VP2by restriction enzyme Bam HⅠand XhoⅠA:SDS -PAGE 鉴定;B:Western blot 鉴定㊂M:蛋白质Marker;1:诱导表达的重组菌破碎沉淀;2:诱导表达的重组菌破碎上清A:Identification with SDS-PAGE;B:Identificationwith Western blot.M:Protein Marker;1:Precipitation afterdisruption of induced expression of recombinant bacteria;2:Supernatantafter disruption of induced expression of recombinant bacteria图2㊀VP2蛋白的可溶性表达结果Fig.2㊀Results of soluble expression of VP2protein0:IBDV 标准阳性抗体;1:IBDV 标准阳性抗原;2 6:表达的VP2蛋白的稀释液(1ʒ2㊁1ʒ4㊁1ʒ8㊁1ʒ16㊁1ʒ32)0:IBDV standard positive antibody;1:IBDV standard positiveantigen;2 6:Diluent of expressed VP2protein (1ʒ2,1ʒ4,1ʒ8,1ʒ16,1ʒ32)图3㊀AGP 效价检测结果Fig.3㊀Results of AGP titer detection test2.3㊀VP2蛋白纯化条件的优化2.3.1㊀饱和硫酸铵纯化蛋白质㊀硫酸铵沉淀常用于蛋白质的粗纯,它根据蛋白质疏水性的不同而使其先后沉淀㊂不同含量的饱和硫酸铵溶液沉淀蛋白质结果显示(图4),表达的目的蛋白经30%的饱和硫酸铵溶液沉淀可除去部分杂蛋白,达到粗纯的目的㊂A:SDS -PAGE 鉴定;B:Western blot 鉴定㊂M:蛋白质Marker;1:细菌裂解液上清;2 8:梯度饱和硫酸铵(10%㊁20%㊁30%㊁40%㊁50%㊁60%㊁70%)A:Identification with SDS-PAGE;B:Identification with Western blot.M:Protein Marker;1:Supernatant of the bacteria lysate;2 8:Gradient saturated ammonium sulfate(10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%)图4㊀饱和硫酸铵纯化VP2蛋白Fig.4㊀VP2protein purified by saturated ammonium sulfate2.3.2㊀填料及洗脱浓度的确定㊀饱和硫酸铵纯化得到的目的蛋白再分别利用DEAE Sepharose TM Fast Flow 和Q SepharoseTMFast Flow 进行纯化㊂其中DEAE Sepharose TM Fast Flow 纯化蛋白质的SDS -PAGE 结果显示(图5A),含200mmol /L NaCl 的缓冲液可洗脱目的蛋白,但不能有效去除杂蛋白,得到的目的蛋白纯度低;Q SepharoseTMFast Flow 纯化蛋白质的SDS -PAGE 结果显示(图5B),含200mmol /LNaCl 的缓冲液可洗脱目的蛋白,并且目的蛋白纯度较高,纯化效果良好㊂可见,Q Sepharose TM Fast Flow适合用于纯化VP2蛋白㊂2.3.3㊀缓冲液pH 值的确定㊀使用不同pH 值(6.5㊁7.0㊁7.5㊁8.0)的缓冲液纯化蛋白质,SDS -PAGE 结果显示(图6A),随着缓冲液pH 值的增加,洗脱的目的蛋白纯度越高,最适合纯化目的蛋白的缓冲液pH 值为8.0,得到的VP2蛋白纯度最高可达到80%㊂Western blot 结果显示(图6B),经纯化的VP2蛋白能被His -Tag 单克隆抗体特异性识别,931河南农业科学第49卷A:DEAE Sepharose TM Fast Flow;B:Q Sepharose TM Fast Flow㊂M:蛋白质Marker;1:30%饱和硫酸铵;2:流穿液;3,7:200mmol /L NaCl;4 5:300mmol /L NaCl;6:500mmol /L NaClA:DEAE Sepharose TM Fast Flow;B:Q Sepharose TM Fast Flow.M:Protein Marker;1:30%saturated ammonium sulfate;2:Flow-through fluid;3,7:200mmol /L NaCl;4 5:300mmol /L NaCl;6:500mmol /L NaCl图5㊀不同离子交换填料纯化VP2蛋白Fig.5㊀Purified VP2protein with different ion exchangemediaA:SDS -PAGE 鉴定;B:Western blot 鉴定㊂a d:缓冲液pH 值分别为6.5㊁7.0㊁7.5㊁8.0;M:蛋白质Maker;1,5:30%饱和硫酸铵;2 4,6 8:200mmol /L NaCl;9:缓冲液pH 值为8.0纯化的VP2蛋白A:Identification with SDS-PAGE;B:Identification with Western blot.a d:The pH values of the buffers are 6.5,7.0,7.5,8.0,respectively;M:Protein Marker;1,5:30%saturated ammonium sulfate;2 4,6 8:200mmol /L NaCl;9:VP2protein purified with pH 8.0buffer图6㊀不同pH 值的缓冲液纯化蛋白Fig.6㊀Purified protein with different pH value buffers表明纯化的VP2蛋白具有良好的反应原性㊂纯化的VP2蛋白经BCA 蛋白质浓度试剂盒测定,其质量浓度为0.6mg /mL㊂2.4㊀VP2蛋白免疫原性分析纯化的VP2蛋白作为抗原免疫SPF 鸡,并将每周采集的血清进行ELISA 检测㊂从图7可以看出,免疫7d 后,抗原组均可检测到抗体,并且抗体滴度逐步提升,其中,VP2组到第21天时达到最高,VP2加佐剂组到第28天时达到最高㊂此外,在免疫14d 后,VP2加佐剂组产生的抗体滴度明显高于VP2组㊂这表明纯化的VP2蛋白免疫原性良好,可有效地刺激机体产生体液免疫应答㊂2.5㊀攻毒保护试验结果免疫28d 后进行攻毒试验,BC6/85毒株仅引起机体免疫抑制,几乎不导致死亡㊂在本试验中,未观察到鸡的死亡㊂攻毒4d 后解剖所有鸡,可见患图7㊀免疫鸡的血清抗体检测结果Fig.7㊀Serum antibody test results of immunized chicken病鸡的腿肌有出血点,法氏囊出现不同程度的肿大,表面有黄色胶冻样渗出物㊂攻毒保护结果显示(表1),抗原组均可以在一定程度上保护机体不受IBDV 的攻击,且VP2加佐剂组比不加佐剂组产生更高的保护率,可达到80%㊂41㊀第9期李甜甜等:传染性法氏囊病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫效果评价表1㊀攻毒保护试验结果Tab.1㊀Results of the Challenge protection test分组Group囊重比BF/BW ratio囊指数Bursal index法氏囊组织病理学评分Bursal histological lesion score1234保护率/%Protection ratioVP2 3.80ʃ1.62 1.05ʃ0.45451040 VP2+71VG 3.73ʃ0.64 1.03ʃ0.18820080攻毒组Challenge group 3.42ʃ0.770.95ʃ0.2100050未攻毒组Non-challenge group 3.62ʃ0.7315000100 2.6㊀法氏囊病理组织学观察通过组织病理学评价制备的疫苗对法氏囊的保护效果(表1㊁图8),VP2加佐剂组有8只鸡的法氏囊组织无损伤,有长而厚的黏膜褶,黏膜由大量多面形滤泡构成(图8A),而VP2组仅有4只法氏囊组织无损伤,两组发病鸡的法氏囊主要表现为部分滤泡坏死程度较轻及周围炎性细胞浸润(图8B)㊂攻毒组的鸡法氏囊严重坏死,滤泡细胞基本坏死,且滤泡结构消失,周围可见较多的炎性细胞浸润(图8C)㊂未攻毒组中未出现法氏囊组织损伤(图8D)㊂A:VP2加佐剂组;B:VP2组;C:攻毒组;D:未攻毒组A:VP2plus adjuvant group;B:VP2group;C:Challengegroup;D:Non-challenge group图8㊀鸡法氏囊组织学变化(HE200ˑ)Fig.8㊀Histological changes of chicken bursal3㊀结论与讨论IBDV是严重影响养禽业的一种病毒㊂VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白和宿主保护性抗原,一直是研究IBDV亚单位疫苗的靶蛋白㊂目前,VP2蛋白已经在多种表达系统中得到表达㊂其中,利用大肠杆菌表达系统表达的IBDV VP2的亚单位疫苗已经应用于临床[19]㊂因此,大肠杆菌表达系统在IBDV亚单位疫苗的研制中具有重要优势㊂本研究将构建好的pET28a-VP2的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,成功表达了VP2蛋白,经AGP检测,表达的目的蛋白可以与标准阳性抗体反应形成沉淀线,表明其具有良好的反应原性㊂此外,VP2蛋白表达量较低,推测与表达菌株有关㊂相比较于亲和层析㊁凝胶过滤㊁梯度离心等纯化方法,饱和硫酸铵与离子交换层析具有成本低㊁操作简单㊁可纯化大批量蛋白质等优点,所以本试验首先选用饱和硫酸铵溶液对VP2蛋白进行纯化㊂表达的目的蛋白经饱和硫酸铵溶液沉淀,可以除去部分杂蛋白质,沉淀经缓冲液充分溶解后,可使蛋白质恢复原来的特性,这是由于盐析的过程是可逆的,基本不会影响蛋白质的活性㊂之后再经离子交换层析进行纯化,并对纯化条件进行优化,DEAE为弱阴离子层析,Q为强阴离子层析㊂其中强阴离子层析的纯化效果比弱阴离子层析好,可有效地去除大部分杂蛋白质,这可能是由于强阴离子交换填料可以更有效的结合杂蛋白,从而使目的蛋白先被洗脱㊂此外,在一定范围内,缓冲液偏碱性比偏酸性的纯化效果好,其纯度可高达80%㊂经纯化的目的蛋白产量可达3.4mg/L,高于之前利用亲和层析纯化得到的VP2[20]㊂此纯化方法可用于工业制备VP2蛋白㊂在本试验中,VP2蛋白免疫组均产生了特异性抗体㊂Montanide TM ISA71VG是一种以矿物油为基础的佐剂,安全有效,可有效增强体液与细胞免疫应答[21]㊂本试验将纯化的VP2蛋白与Montanide TM ISA71VG佐剂混合制备成亚单位疫苗进行动物试验,加佐剂的VP2组较不加佐剂的VP2组产生抗体时间早,且产生的抗体滴度高,可有效地保护法氏囊组织㊂本试验结果显示,VP2蛋白可以刺激机体产生特异性抗体,并在一定程度上保护鸡不受强毒株的攻击,表明VP2蛋白具有良好的免疫效果㊂综上,应用大肠杆菌表达系统中成功表达VP2蛋白,采用简便㊁低成本的纯化方法获得纯度较高且免疫原性良好的目的蛋白,为进一步研究IBD亚单141河南农业科学第49卷位疫苗和建立IBDV检测方法提供参考㊂参考文献:[1]㊀MAHGOUB H A.An overview of infectious bursal disease[J].Archives of Virology,2012,157(11):2047-2057.[2]㊀韩玉婷,何勇,许革学,等.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展[J].河南农业科学,2016,45(3):20-23.HAN Y T,HE Y,XU G X,et al.Research progress onchicken infectious bursal disease virus VP2protein andits vaccine[J].Journal of Henan Agricultural Sciences,2016,45(3):20-23.[3]㊀QIN Y,ZHENG S J.Infectious bursal dsease virus-hostinteractions:Multifunctional viral proteins that performmultiple and differing jobs[J].International Journal ofMolecular Sciences,2017,18(1):161.[4]㊀EBRAHIMI M M,SHAHSAVABDI S,SHAYAN P,et al.Recombinant VP2expressed in baculovirus and adjuvan-ted with TIR-TLR7:A vaccine candidate against infectiousbursal disease virus[J].Comparative Clinical Pathology,2018,27(4):1-6.[5]㊀QI X L,LU Z,WANG N,et al.Analysis of the function ofD279N mutation of VP2of infectious bursal disease virus[J].Journal of Integrative Agriculture,2015,14(12):2618-2625.[6]㊀QIN X L,ZHANG L Z,CHEN Y M,et al.Mutations ofresidues249and256in VP2are involved in the replica-tion and virulence of infectious 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疫苗的工作原理及其种类(原创)
疫苗的工作原理及其种类疫苗是接种动物后能产生自己免疫和预防疾病的一类生物制剂，包含细菌性菌苗、病毒性疫苗和寄生虫性虫苗。
比如我们企业生产的传染性鼻炎苗就是细菌性菌苗，新支减脑四联苗就是病毒性疫苗。
现代疫苗除用于预防传染性疾病外，已扩展到预防非传染性疾病，出现了治疗性疫苗及生理调控疫苗等新式疫苗。
一、疫苗的工作原理：当疫苗接种到动物机体后，刺激动物机体免疫系统，动物机体的抗原提呈细胞将疫苗进行办理、加工和递呈给特异性淋巴细胞（ T 和 B 淋巴细胞），而后淋巴细胞对疫苗的辨别、活化、增殖、分化最后产生免疫效应分子（抗体和细胞因子）及免疫效应细胞，并最后将疫苗从动物机体中消除，这个过程称为免疫应答，免疫应答有三大特色，一是特异性，即我们用什么样的疫苗只好产生针对这种疫苗的免疫效应分子和免疫效应细胞，比如：我们用鸡新城疫疫苗免疫鸡，鸡体内只会产生针对新城疫病毒的抗体，不会产生针对其余病毒的抗体。
二是拥有必定的免疫期，就是当我们用疫苗免疫动物后，刺激体内产生的免疫应答会在必定的期间内保护动物不受这种病原的侵袭，不一样的疫苗免疫保护限期不一样，从数月至数年，甚至终生。
三是拥有免疫记忆，当疫苗刺激动物机体产生免疫应答的过程中，产生了一类细胞叫免疫记忆细胞，这种细胞拥有记忆能力，能辨别与注射的疫苗同样的抗原。
比如，我们用传染性支气管炎疫苗免疫鸡后，鸡体内就会产生针对传染性支气管炎病毒的免疫应答，在此过程中鸡体内会产生一类免疫记忆细胞，这种细胞能辨别传染性支气管炎病毒，平常在体内处在潜藏状态，当鸡群遇到外来传染性支气管炎野毒侵袭时，这种细胞就会很快的辨别野毒，使鸡体内很快的产生大批的针对野毒的特异性抗体与免疫效应细胞，最后将入侵的野毒予以消除，使机体防止野毒的侵袭。
接种疫苗就是运用免疫应答的三大特色，使免疫机体免受病原的侵袭。
二、依据疫苗的抗原性质和制备工艺，疫苗又分为活疫苗、死疫苗和基因疫苗三大类。
1．活疫苗的特色：活疫苗能够在免疫动物体内生殖；能刺激机体产生全面的系统免疫反响和局部免疫反响；免疫力长久，有益于消除局部野毒；产量高、生产成本低。
传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定
［ ４ ３ Ｅ ｓ ］
Ｔａ ｔ Ｓ Ｕ Ｏ Ｈ， Ｏｎ ｏ Ｎ， Ｔ ａ ｎ ｋ ａ Ｋ ，ｅ ｔ ａ １ ． Ｓ ＬＡＭ （ ＣＤｗｌ ５ ０）ｉ ｓ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｒ
ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ｆ ｏ ｒ ｍｅ ａ ｓ ｌ ｅ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ［ Ｊ ］ ． Ｎａ ｔ ｕ ｒ ｅ ， ２ ０ ０ ０ ， ４ ０ ６ ： ８ ９ ３ — ８ ９ ７ ．
Ｔ ａ ｔ ｓ ｕ ｏ Ｈ。 （ ） ｎ ｏ Ｎ 。Ｙａ ｎ ａ ｇ ｉ Ｙ． Ｍｏ ｒ ｂ ｉ ｌ ｌ ｉ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｅ ｓ ｕ ｓ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｉ ｎ ｇ ｌ ｙ ｍ—
及免疫 原性测 定。将传 染性 法 氏囊病 病毒 ＨＢ株 Ｖ Ｐ ２基 因亚克隆到 原核表 达 载体 ｐ Ｅ Ｔ － ３ ２ ａ － ｃ （ ＋） 中并对 其进 行 了诱 导表 达 。Ｓ Ｄ Ｓ － Ｐ ＡＧ Ｅ电泳和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 分析表 明 ， 表 达的 重组蛋 白约 ５ ５ ｋ ｕ ， 以包涵体形式存在 。重组
动物 医 学进展 。 ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ ２ ） ： ７ １ — ７ ４
Ｐｒ ｏ ｇｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
传 染 性 法 氏 囊病 病 毒 ＨＢ株 ＶＰ ２蛋 白的表 达及 免 疫 原 性 测 定
杜 冬 华 ， 周 静 ， 王 爱 华 ， 王 磊 ， 孙 继 国。
基 因组共编码 ＶＰ １ 、 Ｖ Ｐ ２ 、 Ｖ Ｐ ３ 、 Ｖ Ｐ ４和 ＶＰ ５ ５ 种 蛋 白，
至今 ， 新 的变异 株 及 超强 毒 株 不 断 出现 ， 使 得 传 统 活 其 中 ＶＰ ２蛋 白是 宿主保护性免疫 原 ， 可诱导产生 中和
【江苏省自然科学基金】_重组疫苗_期刊发文热词逐年推荐_20140815
科研热词 dna疫苗 猪链球菌 质粒稳定性 谷氨酸脱氢酶 评价研究 联合免疫 真核表达 疫苗,dna 灭活油乳苗 新城疫 抗原 投药途径 减毒鼠伤寒沙门氏菌 减毒沙门氏菌 减毒大肠杆菌 免疫效力 免疫应答 信号肽 体外抗原提呈试验 h9亚型禽流感 gdh基因 elispot cd8+t细胞表位
科研热词 原核表达 2型猪链球菌 肿瘤疫苗载体 宫颈癌 减毒李斯特菌 免疫应答 免疫保护 保护性效力 鸡补体c3d 鞭毛蛋白 间接elisa 锌转运蛋白a 血凝素 组氨酸三聚体蛋白 疫苗 猪链球菌2型 基因免疫 分子免疫佐剂 免疫保护作用 传染性法氏囊病病毒 vp2基因 ssu2100 mrp
推荐指数 4 3 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
推荐指数 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
科研热词 推荐指数 传染性法氏囊病病毒 3 抗原表位 2 vp2基因 2 高亲和力锌吸收蛋白 1 间接elisa 1 重组鸡痘病毒 1 表达 1 血凝素类 1 芽胞表面展示 1 绿色荧光蛋白 1 组合基因 1 病毒样颗粒 1 疫苗 1 猪链球菌2型 1 猪链球菌 1 流感病毒a型 1 枯草芽胞杆菌 1 嵌合体 1 原核表达 1 包涵体样结构 1 免疫效力 1 免疫实验 1 免疫保护 1 克隆 1 乙肝病毒核心抗原(hbcag) 1 ssu2099 1 h5亚型aiv 1 h3n8亚型 1 dna 1 cotx 1
历年(2019-2023)高考生物真题专项(免疫调节)练习(附答案)
历年（2019-2023）高考生物真题专项（免疫调节）练习 考点1 免疫系统的组成与功能〖2023年高考真题〗1．（2023ꞏ山西ꞏ统考高考真题）人体内的免疫细胞是体液免疫和细胞免疫过程的重要参与者。
下列叙述正确的是（）①免疫细胞表面的受体可识别细菌、病毒等入侵机体的病原体②树突状细胞能够处理和呈递抗原，淋巴细胞不能呈递抗原③辅助性T细胞参与体液免疫过程而不参与细胞免疫过程④体液免疫可产生记忆B细胞，细胞免疫可产生记忆T细胞⑤某些致病细菌感染人体既可引发体液免疫又可引发细胞免疫A．①②④B．①④⑤C．②③⑤D．③④⑤2．（2023ꞏ全国ꞏ统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。
乙肝病毒是一种DNA病毒。
重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。
回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。
重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是。
能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取进行DNA 分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
〖2022年高考真题〗3．（2022ꞏ辽宁ꞏ统考高考真题）下列关于人体免疫系统功能的叙述，错误的是（）A．抗体能消灭细胞外液中的病原体，细胞毒性T细胞能消灭侵入细胞内的病原体B．首次感染新的病原体时，B细胞在辅助性T细胞的辅助下才能被活化C．若免疫监视功能低下，机体会有持续的病毒感染或肿瘤发生D．“预防”胜于“治疗”，保持机体正常的免疫功能对抵抗疾病非常重要4．（2022ꞏ北京ꞏ统考高考真题）人体皮肤损伤时，金黄色葡萄球菌容易侵入伤口并引起感染。
【国家自然科学基金】_传染性法氏囊病病毒(ibdv)_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
2011年 科研热词 推荐指数 鸡传染性法氏囊病病毒 2 跨膜区敲除 2 原核表达 2 传染性法氏囊病病毒 2 vp5 2 鸡胚导入 1 鸡传染性法氏囊病病毒(ibdv) 1 鸡 1 高效可溶表达 1 重组禽腺联病毒 1 进化 1 致病力 1 法氏囊病病毒 1 毒力 1 小干扰rna(sirna) 1 复制 1 基因组 1 反向遗传 1 免疫组织化学 1 传染性法氏囊病病毒抑制 1 传染性法氏囊病病毒(ibdv) 1 vp3基因 1 vp2基因 1 vp1基因 1 sumo 1 rna干扰(rnai) 1 mirna 1 he染色 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
科研热词 vp2基因 鸡胚成纤维细胞 雏鸡 鉴定 真核表达 病毒样颗粒 杆状病毒 抗菌肽 弱毒株 传染性法氏囊病病毒 传染性法氏囊病毒 传染性法氏囊病 ibdv受体 gal-13 biotin streptavidin
2014年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2014年 科研热词 推荐指数 传染性法氏囊病病毒(ibdv) 2 重配病毒 1 细菌展示 1 病毒演化 1 序列分析 1 夹心elisa 1 单链抗体 1 单克隆抗体(mab) 1 中和活性 1 vp2 1 ibdv 1
推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
蛋鸡无抗健康养殖上课讲义
环境
消毒 目 标 消毒
少得病、不得病
带鸡消毒
消毒药的选择
有囊膜病毒
无囊膜病毒
禽流感病毒 新城疫病毒 传支病毒 鸡痘病毒 马立克病毒
法氏囊病毒 传贫病毒 呼肠孤病毒 脑脊髓炎病毒 轮状病毒
消毒药的选择
消毒剂作用 醛类
杀灭无囊膜 +++
病毒的活性
杀灭有囊膜 +++
病毒的活性
季铵盐 碘制剂 类
无
++
氧化剂 ++
门卫 .针头 .脚盆.洗
手盆.全进全出,局部
与全场消毒 .预留空
栏挑鸡 淘汰 净化
环境控制系统-----设备使用
环境控制的心脏——环境控制器 电控设备——总电源、电表箱、配电箱、主控制
箱、副控制箱、报警箱 风机——横向风机、纵向风机 进风小窗 水帘 供暖设备 自动喷雾设备
鸡舍环控的心脏----环境控制器
当前养蛋鸡最大的困惑：
不是种和料的问题，而是病
的问题
病
为何家禽疫病越来越严重？ 免疫疫苗的鸡群为何还频繁发病？ 为何鸡发病后治疗忽好忽坏？ 细菌性疫病如何选择药物？ 等等
蛋鸡处于亚健康状态
保健养鸡已成为趋势 由于蛋鸡的高密度饲
养，及饲料的霉菌毒 素的存在，使蛋鸡长 期处于亚健康状态。
鸡群疫病的免疫程序应根据本地区、本场疫病发生情况（疫病流 行的种类、发病季节、易感日龄等）及抗体监测水平，制定适合 本单位的免疫程序。免疫程序是根据抗体消长规律，适时对鸡群 进行免疫，使鸡群产生足够的特异性抗体，增强鸡群对传染病的 抵抗力，是疫病防制工作中的重要手段。
适合濮阳市蛋鸡的免疫程序（2015
精品课程《禽病学》09鸡传染性贫血
免疫程序优化
根据疫苗的免疫效果和地区疫情情况，对免疫程序对现有疫苗的不足之处，通过改进生产工 艺、添加免疫佐剂等方法对疫苗进行改进， 以提高其免疫效果和安全性。
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鉴别诊断
与其他鸡病如鸡法氏囊病、 鸡球虫病等进行鉴别，排 除其他病因。
预防措施
免疫接种
使用鸡传染性贫血疫苗进行免疫接种，提高鸡群 免疫力。
生物安全措施
加强鸡场卫生管理，定期消毒，减少病毒传播。
隔离饲养
发现病鸡及时隔离治疗，防止病毒扩散。
治疗策略
对症治疗
对于出现贫血、黄疽等症状的病鸡，可采用输血、补充维生素等 对症治疗措施。
水平传播
CIAV主要通过口腔、呼吸道和消化道 等途径在鸡群中水平传播，也可通过 污染的环境、饮水、饲料、用具等传 播。
03
鸡传染性贫血的诊断与防治
诊断方法
临床观察
观察鸡群的精神状态、食 欲、体重、羽毛等，以及 贫血、黄疽、出血等症状。
实验室诊断
采集病鸡血液进行血常规 检查，观察红细胞数量减 少、血红蛋白水平降低等 指标。
鸡球虫病
患病鸡出现贫血、黄疸和肝脏病 变等症状，可通过抗生素治疗和 加强饲养管理进行防治。
患病鸡出现贫血、腹泻和消瘦等 症状，可通过抗球虫药物治疗和 加强饲养管理进行防治。
与其他传染性禽病的鉴别
鸡新城疫
01
患病鸡出现呼吸困难、神经症状和死亡等症状，可通过免疫接
种进行预防。
鸡法氏囊病
02
患病鸡出现呼吸困难、腹泻和死亡等症状，可通过免疫接种进
基因组
CIAV的基因组为单链DNA，由一个 主要开放读码框架组成，编码病毒 复制和感染过程中所需的蛋白质。