牛血清蛋白-吸光度标准曲线
1.牛血清蛋白-吸光度标准曲线制作：
摇匀，3分钟后开始测，20分钟内测完。
2.取样品1ml样品，加入5ml考马斯亮蓝试剂，测ＯＤ值。附：1.考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
2.纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析(ELISA)
牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛血清白蛋白残留检测的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛血清白蛋白残留检测水平。用纯化的牛的牛血清白蛋白残留检测抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛血清白蛋白残留检测，再与HRP标记的类牛血清白蛋白残留检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的类牛血清白蛋白残留检测呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存 说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存 标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
标准曲线绘制
标准曲线绘制 calfstone 任何科学实践必须有科学理论的支撑。在这个意义上讲，经验有时候是一种误导。在寻求某个困扰自己的问题答案的时候，我提倡用理论支撑的观点来表达自己和说服自己。任何的盲从和权威都是不可取的。标准曲线的做法问题也是如此。 1、标准曲线的本质。标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。建立标准曲线的目的是推导待测物质的理化属性。如果有不需要标准曲线的方法，比如绝对校正，我想大家都会高兴。 2、标准曲线的适用性。这是做标准曲线的重要前提，这个问题实际很简单，就是这样一个问题：我的样品的仪器响应能否用我们所建立的标准曲线来推导其理化属性？答案建立在仪器响应的特异性和标准系列和样品的匹配性上面。一方面我们总是力求仪器的响应对于标准和样品是一视同仁；同时我们也要求我的样本跟标准基体匹配。所以最好的标准是基体匹配标准，最好的标准曲线是工作曲线。这样，我们也很好理解为什么大多数分析要求标准曲线和样品同批测定（除非经过实验，标准曲线的变化不大），同样的道理也可以理解为什么我们在做大批量检测的时候要插入QC检验样本，以考察仪器的稳定性。即使在任何信息未知的情况下，我们还是要做我们的分析测试的（要不，我们都失业了），因为大家都是用同样的方法做，要错大家一起错；同时也因为我们相信伴随科学的进步，我们所测试的结果的准确性就越接近真理。 3、简单的标准曲线----单点校正。对于分析成本高的测试，单点校正是不得以的选择。现在应用最多的是色谱分析，很多国家标准或国际标准都采用单点校正，实际是建立在色谱分析的高选择性上面：我们的空白一般都很小，我们的线性一般都很好。在有这么多验前概率的支撑下，色谱分析中大量的单点校正不失为一个合理的选择。但单点校正要丢失很多的信息量，这个信息量就是不确定度。 4、标准曲线的点的分布。从不确定度理论推算样本的不确定度时，有二个重要的结论：一、标准曲线的重心点处，所查出来的样品不确定度最小。二、标准的点数越多，样品的不确定度越小。基于这两个结论的标准曲线的做法应该是：在样品浓度的附近尽量的多布标准点。点做多做少，点分布如何，影响的是标准曲线所查出来的样品的理化属性的不确定度。好的测量应该是不确定度小的测量，这在判断样品的结果是否超标或符合限值的时候至关重要。 bingfan56 国标方法的话一般是五个点（不包括零浓度）； 一般以检出限的5~10倍为第一个点，以后根据1倍（或接近一倍）递增，最高浓度是最低浓度的10~20倍为宜。当然，要根据仪器的灵敏度来调整。 一般方法要求线性大于0.99，其实〉0.99是判断是否为线性相关的一个标准，实际应用中线性〉0.999才是比较理想的。线性在0.99到0.999之间的监测结果只用接近最高浓度一半（中间浓度）的位置才比较准确，如果线性大于0.999的话，在整个线性范围内都会有一个比较满意的结果。 如果检测的线性不好，可以减少标准的覆盖范围，将标准的浓度调整到待测样品浓度附近，这样结果也是非常准确的。例如，样品的浓度约20ppb,但在0~50ppb范围建立标准曲线，但线性非常不理想，这时可以将标准范围调整到15~25ppb之间，作五个标准。 loacao 1.范围：如前面的朋友们所说不能跨度太大，因为标准曲线的高浓度延长线通常是曲线，那样定量会不准。最小点当然可以从LOQ开始。
考马斯亮蓝标准曲线制作
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl （0.9%NaCl）配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、
40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
标准曲线的绘制样本
标准曲线绘制 在分析化学实验中， 常见标准曲线法进行定量分析，一般情况下的标准工 作曲线是一条直线。 标准曲线的横坐标（X）表示能够精确测量的变量（如标准溶液的浓度）,称为 普通变量，纵坐标（Y）表示仪器的响应值（也称测量值，如吸光度、电极电位 等）, 称为随机变量。当X取值为X1, X2,……Xn时，仪器测得的丫值分别为丫1, 丫2,……Yn。将这些测量点Xi, Yi描绘在坐标系中,用直尺绘出一条表示X 与丫之间的直线线性关系，这就是常见的标准曲线法。用作绘制标准曲线的标准物质，它的含量范围应包括试祥中被测物质的含量，标长准曲线不能任意延。用作绘制标准曲线的绘图纸的横坐标和纵坐标的标度以及实验点的大小均不能太 大或太小，应能近似地反映测量的精度。 由于误差不能完全避免，实验点完全落在工作曲线的的情况是极少的，特别是在误差较大时，实验点比较分散，它们一般并不在同一条直线上，这样凭直觉很难判断怎样才能使所连接的直线对于所有实验点来说误差是最小的，当前较好的方法是对实验点（数据）进行回归分析。 研究随机现象中变量之间相关关系的数理统计方法称为回归分析，当自变 量只有一个或X与丫在坐标图上的变化轨迹近似一直线时，称为一元线性回归。 甦2.6.1 —元线性回归方程的求法 确定回归直线的原则是使它与所有测量数据的误差的平方和达到极小值 设回归直线方法为 9 (2 - 15)
式中a表示截距，b表示斜率 9 (2 - 15)
假设Xi和Yi （i=1,2,3, ……,n）是变量X和Y的一组测量数据。对于每一个Xi值,在直线（卩“+^ ）上都有一个确定的旳“从X】值。但哲值与X 轴上Xi处的实际测定值Yi是不相等的, 与Yi之差为： 筈厂& +返AY’F-碍（2—佝 上式表示与直线（）的偏离程度，即直线的误差程度。如果全部n个测定引起的总偏差用￡（节厂印'表示,则偏差平方和s为 (2 - 17) 在所有直线中，偏差平方和s最小的一条直线就是回归直线，即这条直线 的斜率b和截距a应使s值达到最小，这种要使所有数据的偏差平方和达到最小 的求回归直线法称为最小二乘法。 根据数学分析的极值原理,要使s达到最小,对式（2 —17）中的a、b分别 求偏微分后得到 (2 —18) (2 —19) 是所有变量Xi和Yi的平均值。由于计算离均差较麻烦，可将式（2 — 18）变换为 n是测量的次数，也就是坐标图中实验点的数目。 (2 —20)
应用EXCEL绘制ELISA标准曲线及计算样本浓度
应用EXCEL绘制ELISA标准曲线及计算样本浓度 整体思路：在ELISA实验结束后，我们得到的是经酶标仪读出的标准品以及样本的OD值。其中，标准品的浓度已知，我们可以利用标准品的OD值及其相对应的浓度，以OD值为横坐标，浓度为纵坐标，做一条标准曲线，并用公式表示出来。这样，我们把样本的OD值以X值代入，便可求出Y值，即样本浓度。 下面我们就一步步来实现这个目标: 1. 首先，将数据整理好输入Excel，分别为经酶标仪读出标准品的OD值及其对应的浓度值。 2. 拖动鼠标选取完成的数据区，并点击图表向导，在图表类型中选“XY散点图”，并选择子 图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。如下图所示。
3. 点击“下一步”，出现如下图界面。如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如 果是纵向列表就改选“列”。
在做ELISA标准曲线，并通过此曲线求样本浓度时，因样本OD值是已知的，因此，我们需要将OD值设为X。根据上图我们可以看到，横坐标X值为OD值，纵坐标Y为标准品浓度，这正是我们想要的。 4.有时需要我们手动选择X值，这时可以点击“系列”来更改，如下图。
如果要对横坐标和纵坐标进行掉换，我们可以就点击X值和Y值文本框右边的小图标，结果如下图：
出现上图后，拖动鼠标选取正确的数据区域以调整X或Y。 5.调好之后，然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图。 6.点击“下一步”，在弹出的窗口再点击“完成”现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。
7.到了这一步，散点图便完成了。我们可能会问，曲线在哪里啊？ 其实很简单，先点击图上的标准值点（记住一定要点选上)，然后单击右键，点击“添加趋势线”。如下图:
实验1 高吸光度示差分析法
实验二高吸光度示差分析法 一、目的： 通过标准曲线的绘制及试样溶液的测定，了解高吸光度示差分析法的基本原理，方法优点。掌握721型分光光度计的使用方法。 二、原理： 普通吸光光度法是基于测量试样溶液与试剂空白溶液（或溶剂）相比较的吸光度，从相同条件下所作的标准曲线来计算被测组份的含量，这种方法的准确度一般不会优于1～2%，因此，它不适合于高含量组份的测定。 为了提高吸光光度法测定的准确度，使其适合于高含量组分的测定，可采用高吸光度示差分析法。示差法与普通吸光光度法的不同之处，在于用一个待测组份的标准溶液代替试剂空白溶液作为参比溶液，测量待测量溶液的吸光度。它的测定步骤如下： (1)在仪器没有光线通过时（接受器上无光照射时）调节透光率为0，这与比色法或普通分光光度法相同。 (2)将一个比待测溶液（浓度为C＋△C）稍稀的参比溶液（浓度为C）放在仪器光路中，调节透光率为100%。 (3)将待测量溶液（或标准溶液）推入光路中，读取表现吸光度A f。 表观吸光度A f实际上是由△C引起的吸收大小，可表达为： A f=ab△c 上式说明，待测溶液（或标准溶液）与参比溶液的吸光度之差与这两次溶液的浓度差成正比。 无论普通吸光度或高吸光度示差法，只要符合比尔定律，而且测量误差仅仅是由于透光率（或吸光度）读数的不确定所引起的，则可以方便地计算出分析的
误差。 仪器刻度上透光率读数改变数（dT ）所引起的浓度误差dc 为绝对误差，它与透光率有关，其关系式容易由比耳定律推得： A f =ab △c=k △c lgT=-A f =-k △c 0.43lnT=-k △c KT dc 43 .0 ·dT 式中k 为标准曲线（A ～C ）的斜率。实验中三条曲线的三个k 很接近。根据k 值及上述关系可以计算出实验中各点的绝对误差（假设透光率读数误差为l%，即dT=0.01）。 对于化学工作者来说，更有意义的是浓度的相对误差(c dc )，或者相对百分误差(c dc ×100)。浓度相对百分误差与参比溶液的浓度关系密切。随着有色参比溶液浓度的增加（或A 的增加），相对百分误差也随之减小。当所用参比溶液的A=1.736时，最低的相对百分误差也可减小至0.25%。由此可见了，差示法中高吸光度法可达到容量分析和重量分析的准确度。 三、仪器与试剂 721型分光光度计（附2只1厘米比色皿） 0～10ml 微量滴定管1支（刻度准确至0.005ml ） 25ml 容量瓶×16 0.2500M Cr （NO 3）3 四、实验步骤
如何用EXCEL绘制标准曲线
Excel是Microsoft offices系统的重要组成，它是界于WORD字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。 现就先介绍一下如何使用Excel绘制标准曲线。 首先，将数据整理好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导，如下图所示。 点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。 点击“下一步”，出现如下图界面。如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如果是纵向列表就改选“列”。 如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改，如下图。 如果是X值错了就点击它文本框右边的小图标，结果如下图： 出现上图后，如图在表上选取正确的数据区域。然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图，上应调整选项，以满足自己想要的效果。 点击“下一步”，现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。 完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。如下图。 由于本例是线性关系，在类型中选“线性”如下图 点击“确定”，标准曲线就回归并画好了。 标准曲线是画好了，可是我们怎么知道回归后的方程是什么样呢？这了简单，点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，如下图： 在显示公式和显示R平方值（直线相关系数）前点一下，勾上。再点确定。好了，现在公式和相关系数都出来了。如图：呵R的平方达0.996，线性相当好。 可是有时候有的项目是成指数增加的，散点图如下图， 从上图看并不值关，除了最大的一个点外其余的几乎都成了直线。这不难理解，对于10000000而言，10与10000都差不了多少。因此我们平时常使用半对数坐标纸画图。对于Excel也可以，先点中Y坐标轴，再按右键，选“坐标轴格式”如下图
牛血清蛋白标准曲线定制
00.20.40.60.8 2 4 6 8 10 12 14 牛血清蛋白的显色浓度μg/ml A 595处吸光度 A595nm处测得的吸光度 回归方程对应的吸光度 表一 考马斯亮兰G250染色法测定牛血清蛋白标准曲线家养表及样品595nm 处测得的OD 值 项目 试管 编号 1 2 3 4 5 6 7 样1 样2 100μg/mL 牛血清蛋白溶液 /ml 0.00 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 1.00 1.00 各管中血清蛋白显色浓度 μg/mL 0.00 3.33 5.00 6.67 8.33 10.0 11.67 13.33 考马斯亮兰试剂ml 各加 入5ml 后摇匀 3分钟后 开始测 定20分 钟测完 A595处测定各管OD 值 0.000 0.186 0.277 0.365 0.451 0.527 0.596 0.664 0.398 0.404 表二 考马斯亮兰G250染色定制牛血清蛋白标准曲线数据处理统计表 项目 试管 编号 1 2 3 4 5 6 7 牛血清蛋白标准显色浓度 μg/mL 0.00 3.33 5.00 6.67 8.33 10.0 11.67 13.33 A595处测定的OD 值 0.000 0.186 0.277 0.365 0.451 0.527 0.596 0.664 回归方程对应浓度下的OD 值 0.0192 0.185 0.269 0.352 0.435 0.518 0.602 0.684 线性回归方程斜率 0.0192 线性回归方程截距 0.0499 线性回归方程 y=0.0499x+0.0192 实验数据的相关因素 0.9960
紫外可见分光光度计的曲线绘制(特选参考)
一、测定溶液中物质的含量 可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。 含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处： ⑴灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异； ⑵可以避免其它物质的干扰。 二、用紫外光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线开关一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。 选几个体积梯度，然后稀释成相同的体积，得到了不同浓度C的几个标准溶液样组，用紫外分光光度计分别测得相应的吸光度A1、A2、A3……，然后要以浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制曲线。当然有时候根据实际需要，也会有小小的变动。 配制标准溶液，用紫外可见分光光度计测量，得到浓度与吸光度的曲线，并且利用线性拟合得到回归方程，直接利用Origin的线性拟合功能得到的方程往往截距不等于零，即方程的形式为y=A+Bx。那是否需要强制令A=0，再来进行拟合呢？如果y=A+Bx这样的形式可以，那么A需要多小才是可以接受的？ 答：如果用样品空白溶液做参比，一般可以设置强制过零点；如果用蒸馏水做参比，一般不能强制过零点。 做曲线时一是要带双空白并减去空白A0, 二是应加0回归。减去A0是希望消除试验方法固定偏倚对校准曲线的影响，当用校准曲线来估计未知样的浓度时，要考虑到试样的测量吸光度也会受到固定偏倚的影响，如果校准曲线和试样测定过程中出现的偏倚一样，偏倚是无需校正的，可有时两者的操作往往不是同时同批进行的，如由于时间或批次不同，固定偏倚有所变化，那么两者的吸光度就要做不同的校正。即在每批分析时带空白，并对相应的信号进行校正。试验证明加零回归的校准曲线与不加零回归校准曲线比较，两者的r和b值均无差异，但加零回归校准曲线截距a的绝对值明显变小，因此在作校准曲线的回归计算时必须加零回归，使回归线接近原点。
Excell软件绘制ELISA标准曲线
怎么用Excell软件绘制ELISA标准曲线 许多试剂检测都涉及到标准曲线的问题,究竟如何绘制或制作标准曲线呢? 用Excell和SPSS的软件能做出来吗?,怎么操作?能一起求出计算公式吗? 有没有专门的软件来处理呢?介绍几种? 希望有这方面经验的介绍自己的经历,与大家分享,“与众同乐才是真的快了” 的确,标准曲线做的好与坏会直接影响到实验的结果,甚至是关系到实验的成败。 首先,做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意: 1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起。 2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度,并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度,即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内,包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段,即曲线几乎成直线的范围内。 3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。 4、检测标准样品时,应按浓度递增顺序进行,以减少高浓度对低浓度的影响,提高准确性。 5、标准曲线的样品数一般为7个点,但至少要保证有5个点。 6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动,但一般来说,相关系数R至少要大于0.98,对于有些实验,至少要0.99甚至是0.999.
怎样绘制标准曲线? 标准曲线浓度得到后,可通过计算器、Excell或SPSS统计软件进行绘制,并得到相关的回归方程(即计算公式和相关系数(回归系数,个人认为,Excell 软件比较好用一些;SPSS也行,不过是英文的,初学者不是很容易掌握;计算器嘛太麻烦了,所以现在一般不用。 双抗夹心法ELISA拟和曲线: 拟和曲线: 打开EXCEL软件;在工作表中 输入第一行:浓度值,如0 10 50 100 400 输入第二行:该浓度下的调整后的od值,如0 0.586 1.397 1.997 3.42 选择这些输入的数据,用插入里的图表按钮,进入图表向导,在“标准类型”中选择“xy散点图”;在“子图表类型”中选择“折线散点图”,按“下一步”;选择“系列产生在行”,按“下一步”;数据标志,可以填写:如数据y 轴,OD值;数据x轴,浓度;按下一步,点击完成。可得曲线图。 单击曲线,按右键,选择“添加趋势线”,在类型中,选择多项式;在选项中,选择显示公式,选择显示R平方值。得到公式和R平方值。 也可以用上面说的方法,在公司已经提供的图表上,双击图表,把它输入到图表的数据中,就可以拟和新的曲线。 计算浓度: 举例:第一次实验: 标准曲线为:
标准曲线的制作方法
标准样品的准备 由于你做的是基因表达分析，样品的准备就比较简单了，因为你要知道都是相对的数值（你的对照样品和实验样品中基因表达的比值），这样就不需要知道精确的拷贝数，所以标准品也就无须知道精确的拷贝数，只需知道稀释的倍数就可以了。 你实验中的标准品可以是来源比较丰富的细胞或组织的RNA转录得到的cDNA。将这种cDNA进行梯度的稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（具体到你的实验要根据具体的情况来调整稀释倍数。最好能作一个预实验来看看什么样的稀释倍数比较适合你的这种基因的扩增）。而对于各个稀释倍数我们要对它的拷贝数进行赋值，这个值当然不是标准品中真实含有的基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是我们根据稀释倍数给每一个稀释度人为赋予的拷贝数，这只是为了方便实验最终结果的计算而已。比如我们把前面稀释十倍的样品赋值为10000个拷贝，100倍的赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍的赋为10等。要注意，赋值的数目的倍数差异和你稀释的倍数是一样的，比如前面是10稀释，后面赋值也是10倍变化。 如何做标准曲线 在定量实验中标准品是要和你的未知样品一起进行定量实验的，这样在实验结束，无论是标准品还是未知样品都将跑出曲线，获得Ct值。那么我们先可以把未知样品放到一边，对于标准品来说，我们既获得了Ct值，还知道他们的拷贝数（虽然这个拷贝数是我们自己赋予的）。这样我们可以通过标准品的Ct值和拷贝数做一条标准曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了标准曲线，而未知样品的Ct值我们知道（通过实验求得的），这时候就在标准曲线上进行定位，就可以得到未知样品的拷贝数了。 事实上，操作起来没有那么复杂，你只需要告诉软件你的哪个孔是标准品，哪个是未知样品，以及标准品的拷贝数等必要信息，软件会自动帮你把标准曲线和未知样品的拷贝数计算出来。 举例来说如何进行设置 先进入软件，在板设置中选择所放样品的位置，并标上unknow或standard等信息。 选择要使用的荧光染料。
荧光定量PCR之绝对定量分析标准曲线的绘制
荧光定量P C R 之绝对定量分析——标准曲线的绘制 1. 绝对定量定义 绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。 将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。 * Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系 *由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量 2. 绝对定量标准品 标准品的一些标准 * 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同 *标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数） *在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值 标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA也可以是比扩增片段长的纯化 后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA甚至cDNA但前提是所有的作为标准品的核酸
都必须保证稳定。 3. 标准品的制备 一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的 准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。倍比梯度稀释方法： 1v 原液(标准品i ) +9v 稀释缓冲液，得标准品ii 1v 标准品ii+9v 稀释缓冲液，得标准品iii 1v 标准品iii+9v 稀释缓冲液，得标准品iv 1v 标准品iv+9v 稀释缓冲液，得标准品v 依次倍比稀释 拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算 4. 实例 标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700测得其拷贝数1.55 X 108copy /ul 标准曲线的绘制( 1cycle=1min ) 设置对照：浓度为 1.55X107、1.55X106、1.55X105、1.55X104、1.55X103、1.55X102、1.55 X 101的标准样品各一个，设空白对照
标准曲线法与标准加入法的区别
1 标准曲线法 1.1标准曲线法的计算公式 在一定条件下，标准曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。现在好多仪器软件都能自动生成标准曲线，所以一小部分版友不清楚标准曲线的具体计算方法。本人查找了一些资料，找到标准曲线的斜率和截距的计算方法，和大家分享。 工作曲线可以用一元线性方程表示： y=a+bx （1） 式中，x为标准溶液的浓度，y为相应的吸光度。 使用最小二乘法确定的直线称为回归线，a,b称为回归系数。 b 为直线的斜率，可由下式求得：
1.2 灵敏度 灵敏度是指该方法对单位浓度或单位量的待测物质的变化所引起的响应量变化的过程。一般用标准曲线的斜率b为方法的灵敏度，b越大，灵敏度越高。 不要小看灵敏度，用处可大了。灵敏度由于仪器的不同，实验条件等的不同，在不断的变化。但在一定的实验条件下，灵敏度相对还是比较稳定的。所以，建议对灵敏度也做个质量控制图，具体做法见我另一个帖子。 每次标准曲线做好以后，观察灵敏度是否在一定的范围内维持稳定。如果发现灵敏度突然降低，就需要考虑，是否是仪器出问题了。火焰首先考虑雾化器是否堵塞，石墨炉首先考虑石墨管是否是烧坏。解决方法是用通丝清理雾化器，更换石墨管后继续测定标准曲线，带灵敏度稳定后进行样品测定。还有，在打开一瓶新的标准溶液的时候，在仪器进行维修以后，一定要注意灵敏度的变化。 1.3线性范围 线性范围这个大家都比较清楚，主要从相关系数r看，一般要求r大于等于三个九。我在这里和大家分享的是，我想了好久才想开的一个问题。之前看好多书上
后来专门做了好多次实验，还是一直是直线在，只是有时候浓度高时，线性不好，高浓度点不在标准曲线上，而是在标准曲线的下面，而且离拟合的标准曲线比较远。遇到这种情况，标准曲线的线性相关系数就很差，有时候才一个九，如图2所示。最后我终于想明白了，如果自己用手动拟合的话，用平滑的曲线去连接所有点的话，你就会发现，如果在线性范围内，连接起来就是直线，如果超出了线性范围，连接起来就是一条弯曲的曲线。从弯曲的拐点开始，就已经超出了线性范围，如图3所示。 所以，判断是否超出线性范围，个人觉得不是看是否弯曲，软件用最小二乘法拟合的一次曲线，永远是直线。要看你的高浓度点是否在拟合的标准曲线上或离得比较近，相关系数是否在三个九以内。如果不在，从拐点开始的那个点，就超出了线性范围，应该删除，从新拟合。 1.4检出限 检出限是指对某一特定的分析方法在给定的置信水平内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。
【2017年整理】标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量
【2017年整理】标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 (一)、试剂: 1、考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% HPO，34 加蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝 乙醇，8.5%(W/V)HPO。 G—250,4.7%(W/V)34 2、标准蛋白质溶液: 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同 0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 (二)、器材: 1、722S型分光光度计使用及原理 2、移液管使用
(三)、标准曲线制作: 1、 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白(ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 2、以A为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、595nm 40 ug、50 ug、60 ug)，在坐标轴上绘制标准曲线。 1)、利用标准曲线查出回归方程。 2)、用公式计算回归方程。 3)、或用origin作图，测出回归线性方程。即A=a×X( )+6 595nm一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4)、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 (四)、蛋白质含量的测定: 样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内)，依照操作步骤1操作，测出样品的A，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 595nm 一般被测样品的A值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A值太595nm595nm 大，可以稀释后再测A值，然后再计算。 595nm (五)、注意事项: 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。
运用Ecel做标准曲线
E x c e l绘制标准曲线全图片教程 随着计算机的日益普及，越来越多的检验工作者希望能从一些烦琐的工作中解脱出来，如：绘制标准曲线、绘制质控图、计算检测值等等。当然借助检验科办公系统理论上是最方便的，但很多单位是没有检验科办公系统的。其实借助Microsoft的Excel电子表格工具对检验工作也会带来很大的便利。 Excel是Microsoft offices系统的重要组成，它是界于WORD字处理软件与ACCESS数据库软件之间的电子表格工具，功能十分强大，特别适合于日常工作使用。使用得好，完全比目前所有的检验科办公系统优秀。 现就先介绍一下如何使用Excel绘制标准曲线。 首先，将数据整理好输入Excel，并选取完成的数据区，并点击图表向导，如下图所示。 点击图表向导后会运行图表向导如下图，先在图表类型中选“XY散点图”，并选了图表类型的“散点图”（第一个没有连线的）。 点击“下一步”，出现如下图界面。如是输入是如本例横向列表的就不用更改，如果是纵向列表就改选“列”。 如果发现图不理想，就要仔细察看是否数据区选择有问题，如果有误，可以点击“系列”来更改，如下图。 如果是X值错了就点击它文本框右边的小图标，结果如下图：
出现上图后，如图在表上选取正确的数据区域。然后点击“下一步”出现图表选项界面，如下图，上应调整选项，以满足自己想要的效果。 点击“下一步”，现在一张带标准值的完整散点图就已经完成，如下图。 完成了散点图，现在需要根据数据进行回归分析，计算回归方程，绘制出标准曲线。其实这很简单，先点击图上的标准值点，然后按右键，点击“添加趋势线”。如下图。 由于本例是线性关系，在类型中选“线性”如下图 点击“确定”，标准曲线就回归并画好了。 标准曲线是画好了，可是我们怎么知道回归后的方程是什么样呢这了简单，点击趋势线（也就是我们说的标准曲线）然后按右键，选趋势线格式，如下图：在显示公式和显示R平方值（直线相关系数）前点一下，勾上。再点确定。好了，现在公式和相关系数都出来了。如图：呵R的平方达，线性相当好。 可是有时候有的项目是成指数增加的，散点图如下图， 将左下方的对数刻度选中，确定。完整的一个半对数标准曲线就做好了。 利用Excel制作标准曲线简单吧如果认真调整参数可以得到不同的效果，大家多研究一下吧。 有人说标准曲线是拿来用的，要是能输入信号值就可以得出浓度那就好了，其实使用Excel也能很自如的处理。具体请听下回分解。
蛋白质标准曲线测试方法
试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。 二、标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用9gl/L NaCl配制成 0.1 mg/mL蛋白溶液。 三、器材 试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。 操作方法 一、制作标准曲线 取7支试管，按下表平行操作。 试管编号0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白溶 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 液（mL） 9gl/LNaCl 0.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 （mL） 考马斯亮蓝 4mL 试剂 蛋白质浓度 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ug/ml 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595 nm处比色 绘制标准曲线：以A595 nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取1样品，加4ml考马斯亮蓝溶液，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(ug/mL)。（超出范围应稀释样品。） 注意事项 在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量 实验目的： 学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 实验原理： 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要仪器 （1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）具塞试管、试管架 （4）研钵 （5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）微量取样器 （8）分光光度计 3．试剂 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 （3）乙醇 （4）磷酸（85％） 四、操作步骤 1．标准曲线制作 （1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
HPLC标准曲线的制作
HPLC标准曲线的制作 你可以随便弄一个浓度进一针样品看一看你这个样品的吸收度如何，再根据你样品的吸收度配置适当的底浓度样品逐个稀释这样可以连检测线定量限一起做了，一举3得(最后将你得到的峰面积根据你的进样浓度做一个线性回归就行啦，线性好的话R的平方一般接近于1 。 请问下各位在上样的时候是进同浓度的不同体积的样液绘制标准曲线好还 是先配好不同浓度的样液再以相同体积进样好呢, 这2个有什么区别吗, 请你看看分析化学书，有关精密度和线性的关系就知道了，实在不行，可以查看2005版药典一部附录新药质量标准的技术要求项下。自己看看就知道了。 我觉得进不同浓度相同体积好.因为你进样体积不同.在同样的方法下,系统的 各项参数可能会发生变化.而且你要通过进样体积的变化来控制浓度范围,这样也不大可行.一般我们进样的体积是5到20微升.而这个狭小的范围我们能调控的浓度线性范围非常窄.而通过事先调配不同浓度的话,就简单可行,而且浓度范围可以任意去控制.在实际操作中,老师也一直是教我们通过控制不同浓度来制作标准曲线的.以上只是个人的粗浅看法,欢迎高手们前来批评指正!!!!!!!!!! 前面几个站友说得都很好。我简单再补充一点自己的看法。 一般而言，还是不同浓度进相同体积做标曲是最规范的做法，而且可以有效避免人为误差。比如说，你的一个浓度配错了，如果以这个浓度为基准进不同的体积，会导致你最后的结果会整体偏大或偏小。所以要特别注意。 但实际工作中，如果你们的产品做得比较成熟了，而且做实验的经验比较丰富，大家为了省事还是多采用配一个浓度进不同的体积。 以进样量做标准曲线和以不同浓度进样相同体积做标准曲线差别不大。
生物化学实验报告ALT与其吸光度的标准曲线绘制
采集样本：广西医科大学口腔医学2009级13班四个组中7组生物化学实验数据采集时间：2010年11月15日2010~2011上学期第十一周周一下午 采集人：何洁梅 一、几组ALT与其吸光度的标准曲线数据记录 ALT活力单位0285797150200 A520吴修团1组00.1180.3160.2860.3640.498 A520黎丁菱1组00.1320.2070.2570.2830.334 A520杨璇璇1组00.2090.2560.2940.3480.405 A520谢晓兰2组00.0520.1010.2180.3070.388 A520莫雪玲2组00.0660.1420.2180.2490.39 A520李文良3组00.0790.1880.310.4690.365 A520文全海4组00.0320.1440.1850.1980.206 二、各采集样本汇总图 （1）样本1测定得待测血清ALT活力单位为50U/L
（2）样本2测定得待测血清ALT活力单位为97U/L （3）样本3测定得待测血清ALT活力单位为135U/L （4）样本4测定得待测血清ALT活力单位为70U/L
（5）样本5测定得待测血清ALT活力单位为148U/L （6）样本6测定得待测血清ALT活力单位为45U/L （7）样本7测定得待测血清ALT活力单位为98U/L
四、采集数据处理结果分析 1．数据总结 样本编号1234567平均值 测定的ALT活力单位509713570148459892是否大于40U/L是是是是是是是均为“是” 正常/非正常非正常非正常非正常非正常非正常非正常非正常均为“非正常” 2.针对数据处理结果的分析 采集的7组数据经标准曲线测量后，得到的ALT活力单位值均大于40，即均为非正常值， 综上，认为待测血清中ALT含量超于正常值。 3.针对源数据的分析 采集的7组数据中样本4、5、6的数据经画图后可基本分布呈过原点的线性关系，符合理论 规律，但其他的数据误差较大。另外，比较符合理想标准曲线的4、5、6样本的三个ALT 活力单位值也存在较大的出入。 4.经分析，总结可能的误差来源如下 （1）配置丙酮酸标准溶液、底物溶液、磷酸缓冲液的混合溶液时，丙酮酸标准溶液的剂量 都很小（如0.05ml0.10ml），容易造成误差。 （2）加入2,4—二硝基苯肼的时间可能有误差，保温的时间，以及加入NaOH以停止反应 的时间都有可能有偏差，容易造成较大。