乳制品中L-羟脯氨酸的测定

乳制品中L-羟脯氨酸的测定

1 引言

皮革水解蛋白是由皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量。对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为含有皮革水解蛋白，即为“皮革奶”。本实验提供两种L-羟脯氨酸衍生方法，利用氨基酸分析柱，对L-羟脯氨酸进行分析检测，可根据实际情况进行选择。

2 仪器与试剂

2.1 仪器、器皿

2.1.1 HPLC+紫外检测器

2.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱（CAT#: 99751）。

2.1.3 11 mL水解瓶（CAT#: 55354）

2.1.4 1.5 mL塑料离心管。

2.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管。

2.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管。

2.1.7 0.22 μm针式过滤器（CAT#:37177）。

2.1.8 2 mL样品瓶（瓶：CAT#:5323，盖CAT#:5325）

2.2 试剂

2.2.1 甲醇（CAT#:50102）。

2.2.2 乙腈（CAT#:50101）

2.2.3 正己烷（CAT#:50115）

2.2.3 三乙胺（CAT#:50131）

2.2.4 冰醋酸（CAT#:50132）

2.2.5 三乙胺（CAT#:50131）

2.2.6 磷酸氢二钠（CAT#:50158）

2.2.7 磷酸二氢钠（CAT#:50157）

2.2.8 L-羟脯氨酸（CAT#:46587）

2.2.9 蛋白水解试剂：称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L），然后加水定容至100 mL。

2.2.10 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL浓盐酸，然后用纯水定容至1000 mL。

2.2.11 衍生剂PITC溶液：将250 μL异硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。

2.2.12 三乙胺溶液：将1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。

2.2.13 衍生剂DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯（DNFB）溶于50 mL乙腈。

2.2.14 Na2B4O7缓冲溶液：称取1.91 g Na2B4O7·10 H2O，用50 mL纯水溶解。

2.2.15 氨基酸储备液：称取一定量L-羟脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到浓度为0.05 mol/L的储备溶液。

2.2.16 氨基酸使用液：将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释，得到浓度为0.0003 mol/L的L-羟脯氨酸溶液。

2.2.17 磷酸盐缓冲溶液：0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。

3 实验方法

3.1 样品水解

(1) 称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（2.1.3），加入蛋白水解试剂（2.2.9），

旋紧盖子，振荡混匀，110 °C下反应24 h。

(2) 反应完毕，将反应液全部转移至100 mL蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。

(3) 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液（2.2.10）分三次溶解残渣，并转移到20 mL玻璃具塞

刻度试管（2.1.5），再用纯水定容至20 mL，待衍生。

3.2 样品衍生

3.2.1 异硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法

（1）样品水解溶液衍生

量取200 μL样品水解溶液，置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液（2.2.12）和100 μL衍生剂PITC溶液（2.2.11），混匀，室温反应1h，加入400μL正己烷（2.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL水混合，经0.22 μm 针式过滤器（2.1.7）过滤，待分析。

（2）标准溶液衍生化

量取200 μL L-羟脯氨酸使用液*（2.2.16），置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液（2.2.12）和100 μL衍生剂PITC溶液（2.2.11），混匀，室温反应1h，加入正己烷400 μL（2.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL 水混合，经0.22 μm针式过滤器（2.1.7）过滤，待分析。

*根据实际情况，氨基酸使用液浓度可进行调整，本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。

3.2.2 2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生方法

（1）样品溶液衍生

取0.5 mL样品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度试管（2.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7

缓冲溶液（2.2.14）和0.5 mL衍生剂DNFB溶液（2.2.13），具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（2.2.17）定容至5 mL，混匀后经0.22 μm针式过滤器（2.1.7）过滤，待分析。

（2）标准溶液衍生

取0.5 mL L-羟脯氨酸使用液（2.2.16）置于5 mL玻璃具塞刻度试管（2.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液（2.2.14）和0.5 mL衍生剂DNFB溶液（2.2.13），具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（2.2.17）定容至5 mL，混匀后经0.22 μm针式过滤器（2.1.7）过滤，待分析。

3.3 色谱条件

3.3.1 异硫氰酸苯酯（PITC）衍生色谱条件

色谱柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm，5 μm（Cat.#：99751）

mol/L乙酸钠水溶液（冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05）

流动相A: 0.05

流动相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20（V : V : V）

流速: 1.0 mL/min

检测波长: UV 254 nm

℃

柱温: 45

进样体积: 10 μL

梯度程序

时间/min 0 39 40 45 46 60

流动相A/% 95 52 0 0 95 95

流动相B/% 5 48 100 100 5 5

3.3.2 2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生色谱条件

色谱柱: Diamonsil AAA 250×4.6 mm，5 μm（Cat.#：99751）

流动相A: 0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液

流动相B: 甲醇 : 乙腈=10 : 90 （V : V）

流速: 1.0 mL/min

检测波长: UV 360 nm

℃

柱温: 35

进样体积: 10 μL

梯度程序

时间/min 0 39 44 44.0165

流动相A/% 86 60 30 86 86

流动相B/% 14 40 70 14 14