脯氨酸含量的测定

脯氨酸含量的测定

在逆境条件下，植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。

一、原理

当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即为红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料

待测植物叶片

（二）仪器设备

1. 722型分光光度计；

2.研钵；

3.100ml小烧杯；

4.容量瓶；

5.大试管；

6.普通试管；

7.移液管；

8.注射器；

9.水浴锅；

10.漏斗；

11.漏斗架；

12.滤纸；

13.剪刀。

（三）试剂

1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。

2. 3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

3.冰醋酸。

4.甲苯。

三、实验步骤

1.标准曲线的绘制

（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。

（2）系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。

（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶

液。

（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm 波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y ）依脯氨酸浓度（X ）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml 测定液中脯氨酸的含量（ug/2ml ）。

2.样品的测定

（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g ，分别置大管中，然后向各管分别加入3%的磺基水杨酸溶液5ml ，在沸水浴中提取10min （提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

（2）吸取2ml 提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml 冰醋酸及2ml 酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min ，溶液即呈红色。

（3）冷却后加入4ml 甲苯，摇荡30s ，静置片刻，取上层液至10ml 离心管中，在3000r/min 下离心5min 。

（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm 波长处比色，求得吸光度值。

四、结果计算

根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml 测定液中脯氨酸的含量（X ，ug/2ml ），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：

单位鲜质量样品的脯氨酸含量（%）=X×Vt

W×Vs×106 x100

式中：X 为从标准曲线查出的2ml 测定液中脯氨酸的含量（ug/2ml ）；

Vt 为提取液体积（ml ）；

Vs 为测定时取用的样品体积（ml ）；

W 为样品质量（g ）。

植物体内硝酸还原酶活力的测定

硝酸还原酶（NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO3-＋NADH ＋H+NR

→ NO2-＋NAD+＋H2O ）。产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以ug 氮/（g ·h ）为单位。NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法操作简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。

离体法

一、材料、仪器设备及试剂

（一）材料

水稻、小麦叶片、幼穗等。

（二）仪器设备

1.冷冻离心机

2.分光光度计

3.天平（感量0.1mg ）

4.冰箱

5.恒温水浴

6.研钵

7.剪刀

8.离心管

9.具塞试管

10.移液管

11.吸尔球。

（三）试剂

1.亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准液。

2. 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液：30.0905g Na2HPO4·12 H2O与2.4965g NaH2PO4·2 H2O加去离子水溶解后定容至1000ml。

3. 1%（质量浓度）磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100ml 3mol/l盐酸中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/l HCl）。

4. 0.02%（质量浓度）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶内。

5. 0.1mol/l KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液。

6. 0.025mol/l pH8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12 H2O，0.0570g K2HPO4·3H2O 溶于1000ml去离子水中。

7.提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/l pH8.7的磷酸缓冲液中。

8. 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液中（临用前配制）。

二、实验步骤

（一）标准曲线制作

取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0~2.0ug的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y）建立回归方程。

配置标准溶液时各物质加入量

试剂/ml 管号

1 2 3 4 5 6 7

亚硝酸钠标准液0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0

1%磺胺 4 4 4 4 4 4 4

0.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4

每管含亚硝态氮/ug 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

（二）样品中硝酸还原酶活力测定

1.酶的提取：称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置于冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转入离心管在4℃、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。

2.酶的反应：取粗酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml 0.1mol/l KNO3磷酸缓冲液和0.4ml NADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液代替。

3.终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心15min，取上清液在540nm下比色测定。根