羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒说明书 微量法
4种鱼肉羟脯氨酸含量的测定-论文
４种鱼 肌 肉样 品的 羟脯 氨酸含 量测 定 方法参 照 Ｇ Ｂ ／ Ｔ ９ ６ ９ ５ ． ２ ３ ２ ０ Ｏ ８ ／ Ｉ Ｓ ０ ３ ４ ９ ６ ：１ ９ ９ ４ ［ 略作 修 改 。
１ ． ３ ． １ 标 准 曲 线 制 作
４种 鱼 肉羟 脯 氨 酸 含 量 的 测 定
张 延 华 ，马 国红 ，王爱 英 ，王 秉 利 ，许 鹏 （ 山东省淡水水产研究所， 山东 济南２ ５ ０ １ １ ７ ）
［ 摘 要］ 采 用 比色 法 对 草 鱼 （ Ｃ ｔ ｅ ｎ ｃ ｐ ｈ ａ ｒ ｙ ｎ ｇ ｏ ｄ ｏ ｎ ｉ ｄ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ ） 、鲤 鱼 （ Ｃ ｙ ｐ ｒ ｉ ｎ ｕ ｓ ｃ ａ ｒ ｐ ｉ ｏ ） 、鳙 鱼 （ Ａｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｈ ｔ ｈ ｙ ｓ
下 式计 算 ：
Ｘ 一 ６ ． ２５ ｃ （ ／ Ｔ ／ × Ｖ）
式 中 ：Ｘ 为试 样 中羟脯 氨酸 的含 量 ， ；ｃ为 由标 准 曲线得 到的试 样溶 液 中羟脯 氨酸 的浓 度 ，￣ ｇ ／ ｍｌ ；ｍ
为试样 质量 ，ｇ ；Ｖ 为从 ２ ５ ０ ｍｌ 容 量瓶 中 吸取滤液 的体 积 ，ｍｌ 。
１ ０ ｍｌ 硫 酸溶 液分 ３次洗 涤 烧瓶 和滤 纸 ，合并 至上 述容量 瓶 中 。用水定 容 ，摇匀 。
用移液 管 移 取 一 定 体 积 （ Ｖ） 的 水 解 产 物 至 ２ ５ ０ ｍｉ 容 量 瓶 中 ，定 容 后 羟 脯 氨 酸 的 浓 度 在 ０ ． ５ ～
２ ￣ ， ｇ ／ ｍｌ 之 间 。移 取 ４ ． ０ ０ ｍｌ 上 述 溶 液 于 比 色 管 中 ，加 入 ２ ． ０ ０ ｍｌ氯 胺 试 剂 ， 混 合 后 于 室 温 下 放 置
小鼠羟脯氨酸(Hyp)ELISA Kit实验说明书
【产品编号】CSB-E08839m
【预期应用】ELISA 法定量测定小鼠血清、血浆、组织裂解液中 Hyp 含量。
【产品性能指标】
1、 检测范围：7.8 ng/ml-500 ng/ml
2、 灵敏度：1.95 ng/ml
3、 精密度：批内差 CV%<8%，批间差 CV%<10%
3、 生物素标记抗体工作液 生物素标记抗体液按 1:100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。如 10μl生物素标记抗体加
990μl生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。
4、 辣根过氧化物酶标记亲和素工作液 辣根过氧化物酶标记亲和素 按 1:100 倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。 如
溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间（比如每隔 10 分钟）。当肉眼可
见标准品前 3-4 孔有明显梯度蓝色，后 3-4 孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，
此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
7、 底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染，请避
辣根过氧化物酶标记亲和素
生物素标记抗体稀释液
有效期内2-8℃条件下最多可保存一个月。
辣根过氧化物酶标记亲和素
稀释液
样本稀释液
浓洗涤液
底物溶液
终止液
【所需试剂和器材】
标准规格酶标仪；高速离心机；电热恒温培养箱；干净的试管和离心管；容量瓶；
系列可调节移液器及吸头；多通道移液器；蒸馏水 等
【样本采集及保存】
如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4、 温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须覆上板贴，实验过程中酶标板应
辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书
辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书微量法100管/48样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS，同时NADH再生为NAD+。
糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。
NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。
较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。
此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。
另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理：分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。
需自备的仪器和用品：酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：酸性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；碱性提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体10 mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体3 mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，-20 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；试剂四：粉剂×1瓶，4 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；试剂五：液体3.6mL×1瓶，4 ℃保存；试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。
NAD+和NADH的提取：1 血清（浆）中NAD+和NADH的提取：NAD+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。
羟自由基清除能力测定试剂盒说明书
苏州科铭生物技术有限公司羟自由基清除能力测定试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：羟自由基作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病。
羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一，在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
测定原理：H2O2/ Fe2+ 通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+，导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。
自备实验用品：恒温水浴锅、酶标仪、96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制:提取液：液体100 mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体12mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体12 mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃保存。
样品的制备：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.血清、果汁等液体样品可直接测定。
3.提取物（或者药物）可配制成一定浓度，如5 mg/mL。
操作步骤：1、酶标仪预热30min，调节波长至536nm。
2、工作液配制：使用之前按照每管试剂一：试剂二：试剂三=100:50:100（µL）的比例配制，用多少配多少，混匀。
计算公式:羟自由基清除率D% =（A测-A对）÷（A空-A对）×100%A空、A对、A测：空白管、对照管和测定管的吸光值。
注意事项:为了比较不同样品羟自由基清除能力，对于同一批样品必须加入等量的样品，血清、组织匀浆、果汁等液体样品加入同样体积，提取物（或者药物）配制成同样浓度。
脯氨酸含量检测试剂盒说明书
脯氨酸（Pro ）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0290规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体45 mL×1瓶（自备）4℃保存试剂二液体45 mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1．试剂一：自备冰乙酸。
2．标准品：脯氨酸10 mg ，临用前加入1 mL 蒸馏水，配成10 mg/mL 标准品。
产品说明：脯氨酸（Pro ）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。
Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。
因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。
用磺基水杨酸（SA ）提取Pro ，加热处理后，Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色，在520nm 测定吸光度。
技术指标：最低检出限：0.1791 μg/mL 线性范围：0.5-40 μg/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器及用品：可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、冰乙酸、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细胞、细菌或组织样本的制备：细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min ；10000g ，常温离心10min ，取上清，冷却后待测。
组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；之后置沸水浴振荡提取10min，10000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。
CellBiolabs羟脯氨酸检测试剂盒分析原理
CellBiolabs羟脯氨酸检测试剂盒分析原理羟脯氨酸是一种由不可逆的翻译后酶合成的氨基酸脯氨酸经脯氨酰羟化酶羟化。
羟脯氨酸几乎只存在于细胞中蛋白质胶原蛋白，位于重复三肽Gly-X-Y的Y位置。
通过允许胶原蛋白螺旋，羟脯氨酸有助于稳定胶原蛋白的结构。
除了胶原蛋白，在转录因子缺氧诱导因子（HIF1）上观察到脯氨酸的羟基化。
在正常氧气条件下，蛋白质EGLN1在脯氨酸564处羟基化HIF-1α，允许von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子（pVHL）泛素化并导致靶向性通过蛋白酶体降解HIF-1。
由于羟脯氨酸仅存在于胶原蛋白以外的少数蛋白质中，因此羟脯氨酸已被用作量化胶原蛋白和/或明胶水平的标志物（部分胶原蛋白水解产生蛋白质和肽的混合物）。
据估计羟脯氨酸占胶原蛋白的13.5%。
此外，还使用了羟脯氨酸测量确定某些涉及胶原蛋白分解的疾病。
例如，增加了在佩吉特骨病患者的血清中测定了胶原蛋白。
此外，羟脯氨酸增加该水平与前列腺癌、骨转移、肝纤维化以及前列腺癌相关三聚氰胺和三聚氰酸引起肾毒性。
Cell Biolabs/羟脯氨酸检测试剂盒为检测提供了一种方便的比色方法从组织、血浆、血清或尿液酸水解物中提取总羟脯氨酸。
首先是未知将样品或羟脯氨酸标准加入96孔板中。
然后，加入氯胺T混合物添加以将羟脯氨酸转化为吡咯。
最后，4-（二甲氨基）苯甲醛（DMAB）将混合物（也被称为埃利希试剂）添加到与吡咯反应的孔中，以使其反应产生生色团（下图），并在540-560 nm处读取板的吸光度。
内容通过与预定值进行比较，确定未知样品中羟脯氨酸的含量羟脯氨酸标准曲线。
提供的试剂足以评估96次分析包括标准品和未知样品。
（分析原理）1. STA-670: Homocysteine ELISA Kit2. STA-671: S-Adenosylhomocysteine (SAH) ELISA Kit3. STA-672: S-Adenosylmethionine (SAM) ELISA Kit4. STA-674: Glutamate Assay Kit。
羟自由基测定试剂盒使用说明
羟自由基测定试剂盒使用说明货号：LA1950规格：50管/48样产品内容：试剂一：3%H2O2标准品贮备液0.5mL×1支，4℃保存3个月。
0.03%标准品应用液的配置：3%H2O2标准品贮备液：双蒸水=1：99稀释，现用现配。
试剂二：底物贮备液1mL×1支，4℃保存3个月。
底物应用液的配制：如果您的样本为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，则底物反应液的配制：底物贮备液：双蒸水=1：99稀释，现用现配。
如果您的样本为产生羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度高，则底物反应液的配制：底物贮备液：双蒸水=1：299稀释，现用现配。
试剂三：甲液贮备液2mL×1支，4℃保存3个月。
用时用双蒸水稀释至1：9稀释成应用液。
乙液7mL×2支，4℃保存3个月。
试剂三应用液的配制：甲液应用液与乙液等比列混合，按需配置，剩余的4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存3个月。
用时加双蒸水稀释至100mL制备应用液，4℃保存。
若有结晶，则放置37℃水浴至全部溶解后再稀释。
试剂五：液体30mL×1瓶，避光4℃保存3个月。
试剂六：液体30mL×1瓶，避光4℃保存3个月。
试剂七：分析纯的冰乙酸自备。
显色剂的配制：试剂四应用液：试剂五：试剂六：冰乙酸=8:3:3:2，现用现配。
抑制羟自由基的物质如：血清（浆）、各种组织匀浆液、口服液等产生羟自由基的物质如：中性白细胞、某些药物、部分植物等。
产品简介：Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的OH·量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH·的多少成正比列关系。
操作步骤：以上配制好的应用液，先在37℃水浴中温育3min，一下操作在37℃水浴中进行。
空白管标准管对照管测定管双蒸水（mL）0.40.20.20.03%H2O2标准应用液（mL）0.2底物应用液（mL）0.20.2样本（mL）0.2试剂三应用液（mL）0.40.40.40.4混匀，37℃反应1min（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到1min结束，立即加入显色剂终止反应，一次只能做一个管子。
原料中羟脯氨酸含量的测定
原料中羟脯氨酸含量的测定1.材料和试剂1.1材料秦宝雪花牛牛蹄筋：陕西秦宝牧业有限责任公司。
秦宝普通育肥牛、雪花牛肺：陕西秦宝牧业有限责任公司。
秦宝雪花牛棒骨：陕西秦宝牧业有限责任公司。
1.2试剂所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水，或相同浓度的水。
1.2.1硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L]量取750mL水于2L的容量瓶中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。
冷却至室温后用水定容。
1.2.3缓冲溶液（PH=6.8）包括下列组分：a）26.0g一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）；b）14.0g氢氧化钠；c）78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。
用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL 正丙醇，用水定容。
该溶液于4℃暗处可稳定保存几周。
1.2.4氯胺T溶液称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL 缓冲溶液溶解。
临用前配制。
1.2.5显色剂称取10.0g对甲氨基苯甲醛，用30mL高氯酸溶液[70%（质量分数）]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。
临用前配制。
1.3羟脯氨酸标准溶液1.3.1标准储备液称取50mg4-羟基-α-吡咯甲酸（羟脯氨酸）于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（1.2.1），用水定容。
该溶液于4℃下可稳定存放1个月。
1.3.2标准工作液移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。
分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度一次为0.5µg/mL、1.0µg/mL、1.5µg/mL、2.0µg/mL。
临用前配制。
2.仪器和设备3.试样制备用刀将原料在冷冻时（0℃以下）切成小块（约0.5cm3，边长约为8mm）。
将切好的试样装入密封样品盒中，或用耐热塑料袋真空包装，70℃以上保温30min后，冷却。
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羟脯氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书微量法
注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
货号：BC0255
规格：100T/96S
产品内容：
O（V/V）=1:1，室温保存。
提取液：6mol/L盐酸，自备。
浓盐酸：H
2
试剂一：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
标准品：0.5mL×1支，0.5mg/mL羟脯氨酸标准品，4℃保存。
产品说明：
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。
通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。
自备实验用品及仪器：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、6mol/L 盐酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、羟脯氨酸提取：
1、组织：称取约0.2g样品于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。
加入2mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块，16000rpm，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），用10mol/L NaOH（约1mL）调节pH值至6～8范围内。
蒸馏水定容至4mL，取上清待测。
（过程中可能有黑色物质生成，若长时间不能消化，可能为碳化的物质）
2.细胞：取500万个细胞，加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm，
25℃，离心20min，用10mol/L NaOH（约0.5mL）调节pH值至6～8范围内。
蒸馏水定容至2mL，取上清待测。
二、测定操作表：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。
2、将标准品稀释为30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234μg/mL的标准溶液。
3、操作表
空白管测定管标准管样本（µL）60
标准溶液（μL）60
试剂一（µL）606060
混匀，室温静置20min
试剂二（µL）606060
H
O（µL）180120120
2
混匀，60℃，20min水浴，取出后室温静置15min，取200µL于微量玻璃比色皿/96孔板中检测A
吸光值。
ΔA=A测定管-A空白管
560
三、羟脯氨酸含量计算公式：
1.标准曲线的绘制：
以标准溶液的浓度为x轴，∆A标准（∆A=A标准管-A空白管）为y轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。
将∆A（∆A=A测定管-A空白管）带入方程得到x。
2.羟脯氨酸含量的计算：
（1）按样本鲜重计算：
组织羟脯氨酸含量（µg/g鲜重）=x×V样品÷（W×V样品÷V组提）=4x÷W。
（2）按样本蛋白浓度计算：
组织羟脯氨酸含量（µg/mg prot）=x×V样品÷（Cpr×V样品）=x÷Cpr。
（3）按细菌或细胞数量计算：
细胞羟脯氨酸含量（µg/104cell）=x×V样品÷（细胞数量×V样品÷V胞提）=2x÷细胞数量。
V样品：加入的样品体积，0.06mL；V组提：组织提取液体积，4mL；
V胞提：细胞提取液体积，2mL；W：样本鲜重，g；
细胞数量：以104为单位，万个；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、OD值大于1.0，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。