脯氨酸含量的测定

植物组织游离脯氨酸含量的测定

（一）实验原理

植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520 nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

（二）实验材料、仪器设备及试剂

1 材料

植物叶片

2 仪器设备

分光光度计，恒温水浴锅，漏斗，具塞刻度试管(20 ml) ，移液枪（1 ml和5 ml），5 ml 和1 ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。

3 试剂

(1) 3％磺基水杨酸溶液：万分之一电子天平称取3 g磺基水杨酸，然后将称好药品溶于100 ml蒸馏水中。

(2) 甲苯

(3) 2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6 mol L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效（此步骤重要）。称取1.25 g茚三酮放入烧杯中用混合液50 ml 放入70℃水浴锅中溶解，冷却。

(4) 脯氨酸标准溶液：准确称取25 mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250 ml，其浓度为100 ug/ml。再取此液10 ml，用蒸馏水稀释至100 ml，即成10 ug/ml的脯氨酸标准液。

三．实验方法

1 标准曲线制作

（1）取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40 min。

试管号

0 1 2 3 4 5 6

脯氨酸标准溶液

0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2

/ml

水/ml 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0 冰乙酸/ml 2 2 2 2 2 2 2

茚三酮显色液

3 3 3 3 3 3 3

/ml

脯氨酸含量/µg 0 2 4 8 12 16 20 （2）取出冷却后向各管加入5 ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520 nm下比色。

（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。

2 样品测定

（1）脯氨酸提取：从-80℃冰箱中取出样品，放入事先装好液氮的保温桶中。每个样品均取0.2 g左右，分别置于大试管中，加入5 ml 3％磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10 min。

（2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2 ml，加2 ml冰乙酸和3 ml显色液，于沸水浴中加热40 min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色（向各管加入5 ml 甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520 nm 下比色）。

（3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度脯氨酸含量的百分数。

脯氨酸[μg.g-1(干或鲜重)]=(C·V)·(a·W)－1

式中：C一提取液中脯氨酸浓度，由标准曲线求得：

V －提取液总体积（ml）

A --- 测定时所吸取得体积（ml）

W----- 样品重（g）

数据统计表

海拔处理编号吸光度

标准曲

线斜率稀释倍数

提取液中脯氨

酸含量C（ug）

提取液总体积V

（ml）

测定时所吸取

的体积a（ml）

样品重（W）脯氨酸含量ug\g 平均值

2900 CK

1 1 1

1 1 2

1 1 3

1 1 4 PEG

1 2 1

1 2 2

1 2 3

1 2 4

3000 CK

2 1 2

2 1 3

2 1 4 PEG

2 2 1

2 2 2

2 2 3

2 2 4

3100 CK

3 1 1

3 1 2

3 1 3

3 1

4 PEG

3 2 1

3 2 2

3 2 3

3 2 4

3258 CK

4 1 1

4 1 2

4 1 3

4 1 4 PEG

4 2 1

4 2 2

4 2 3

4 2 4

3600 CK

5 1 1

5 1 2

5 1 3

5 1 4 PEG

5 2 1

5 2 2

5 2 3

5 2 4

3600 --1 CK

6 1 1

6 1 2

6 1 3

6 1 4 PEG

6 2 1

6 2 2

6 2 3

3700 CK

7 1 1

7 1 2

7 1 3

7 1 4 PEG

7 2 1

7 2 2

7 2 3

7 2 4

3800 CK

8 1 1

8 1 2

8 1 3

8 1 4 PEG

8 2 1

8 2 2

8 2 3

8 2 4

3900 CK

9 1 1

9 1 2

9 1 3

9 1 4 PEG

9 2 1

9 2 2

9 2 3

9 2 4

4000 CK

10 1 1

10 1 2

10 1 3

10 1 4 PEG

10 2 1

10 2 2

10 2 3

10 2 4

4100 CK

11 1 1

11 1 2

11 1 3

11 1 4 PEG

11 2 1

11 2 2