聚丙烯酰胺凝胶电泳
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳分离蛋白质
一、目的要求
1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电
泳分离蛋白质技术
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide， 简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N— methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N， N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N— tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催 化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8， 简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2， C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝 胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶 电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
3%
凝胶贮液
5.00 6.66 10.0
1.00
分离胶缓冲液
来自百度文库
(pH8.9 Tris-HCl) 2.50 2.50 2.50
—
浓缩胶缓冲液
(pH6.7 Tris-HCl) — —
—
1.25
10%TEMED
0.10 0.10 0.10
0.05
10％SDS
0.20 0.20 0.20
0.10
重蒸水
12.10 10.44 7.10
通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电
荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有 更高的分辨率。
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质
104 1-4×104
20-30 15-20
1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105
核酸(RNA)
10-15 5-10 2-5
15–20 5-10
105-2×106
2-2.6
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两 大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)， 两者电泳原理完全相同。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨 酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7
(2)浓缩胶pH6.7
(3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框
4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不
溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，
返回
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成 的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓 冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔 径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品 浓缩的主要因素。
(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝 隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙， 凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。
• 2 配胶
表 SDS–不连续体系凝胶的制备
配制20 mL不同浓度的分离胶 配制10 mL浓缩
试剂名称
所需试剂用量/mL
所需试剂用量/mL
7.5% 10% 15%
器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇 床
五、 操作方法
1.安装夹心式垂直板电泳槽
(1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中， 注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃 板应面对上贮槽。
(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双 手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
图5 不连续系统浓缩效应示意图
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时， 它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子 的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝 胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸 钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)， 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它 的分子量，而与所带电荷和形状无关。因 此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移 率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应
图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
三、试剂与器材
试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、 分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲 液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－ HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、 0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸
7.55
10%过硫酸铵
混匀后，置真空干燥器中，抽气10 min
一、目的要求
1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电
泳分离蛋白质技术
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide， 简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N— methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N， N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N— tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催 化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8， 简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2， C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝 胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶 电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
3%
凝胶贮液
5.00 6.66 10.0
1.00
分离胶缓冲液
来自百度文库
(pH8.9 Tris-HCl) 2.50 2.50 2.50
—
浓缩胶缓冲液
(pH6.7 Tris-HCl) — —
—
1.25
10%TEMED
0.10 0.10 0.10
0.05
10％SDS
0.20 0.20 0.20
0.10
重蒸水
12.10 10.44 7.10
通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电
荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有 更高的分辨率。
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质
104 1-4×104
20-30 15-20
1-5×104-1×105 1×105 5×105
104 104–105
核酸(RNA)
10-15 5-10 2-5
15–20 5-10
105-2×106
2-2.6
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两 大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)， 两者电泳原理完全相同。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨 酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7
(2)浓缩胶pH6.7
(3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框
4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不
溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，
则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，
返回
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液 为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成 的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓 冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、 2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔 径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品 浓缩的主要因素。
(5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝 隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙， 凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。
• 2 配胶
表 SDS–不连续体系凝胶的制备
配制20 mL不同浓度的分离胶 配制10 mL浓缩
试剂名称
所需试剂用量/mL
所需试剂用量/mL
7.5% 10% 15%
器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇 床
五、 操作方法
1.安装夹心式垂直板电泳槽
(1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
(2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中， 注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
(3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃 板应面对上贮槽。
(4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双 手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
图5 不连续系统浓缩效应示意图
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时， 它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子 的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝 胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸 钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)， 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它 的分子量，而与所带电荷和形状无关。因 此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移 率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应
图4 电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的
区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
三、试剂与器材
试剂：10%SDS、 凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)、 分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9Tris－HCl 缓冲 液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7Tris－ HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵、 10%TEMED、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 1%琼脂糖溶液、 0.05％考马斯亮兰R250 、7%醋酸
7.55
10%过硫酸铵
混匀后，置真空干燥器中，抽气10 min