焦磷酸测序技术的原理

Pyrosequencing技术的原理

Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下：

第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。

第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。

第2步图示(图片来自互联网)

第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成A TP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。

第3步图示(图片来自互联网)

第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。

第4步图示(图片来自互联网)

第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。