水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化研究进展
了可 育的转 基 因粳稻 和籼稻植 株 。从 此水稻转 基 因 研究褥 到 了飞 速 的发 展 ， 得 了大 量稳 定遗 传 的转 获
基 因水 稻植 株 ， 使水 稻 成 为单 子 叶植 物 遗传 转 化 的 模式植 物 ， 为其 它禾 本 科作 物 基 因转 化 和基 因 调控 研究奠 定 了 基础 。同 时 发 明 了 多 种 转 化 技 术 和方 法， 主要 有 基 因枪 法 、 Ｅ 法 、 融 合法 、 杆菌 介 ＰＧ 电 农 导法 、 花粉 管 通 道 法 、 光 介 导 法 和 Ｄ 激 ＮＡ 吸收 法 。
摘
要 ： 水稻遗传转化的主要方法 ， 包括农杆菌介导法 、 因枪 法、 基 电激法、 Ｅ Ｐ Ｇ法等。论述 了用于水稻转化
的各种外 植体 、 影响水稻遗传转化和植株 分化的各种 因素 、 各种标记 基 因及 相应 的选 择方法和 外源基 因在转基 因 水稻 中的遗传规律 ， 比较了常用启动子在水稻中的表 达强 度 ， 一些 已转 移到优 良水稻 品种中的有益农艺性 状基 因，
ａｉｎ．Ｅ ｅｔｏ ｏ ａ ｏ ＥＧ ｎ ∞ １ ｔ ｅ ｔｏ ｓ ｔ ｏ ｌｃｒｐ ｒｆ ｎＰ ｉ ａ ｄｓ ｅｏｈ ｒ ｍｅｈ ｄ Ｖａｉｕ ｘ ｌｎ ｒｄｆ ｒｎ ｅｉｅｙｍｅｈ ｄ ．ｆｅ ｒ ｆ ｃｉｇｒ ｅ ｒｏ ｓｅｐａ ｔｆ ｉ ｅｅ ｔ ｌ ｒ ｔｏ ｓ ￣ ｔ ｓａｆ ｔ ｉ ｏ ｆ ｄ ｖ ｏ ｅ ｎ ｃ
如抗病 、 抗虫 、 抗除草剂等 ， 介绍 了它们在水稻 品种改 良中所发挥的作用。 关键词 ： 水稻 基因 遗传转化
Ｔｈ ｖ ｌ ｐ ｅ ｔｏ ｃ ｎ ｔｃ Ｔｒ ｎ ｆ ｒ ａ ｉｎ ｅ Ｄｅ ｅｏ ｍ ｎ ｆＲｉｅ Ｇｅ ｅ ｉ ａ ｓ ｏ ｍ ｔｏ
Ｗ ａ ｇＪｎ ｕ Ｌ ｎ Ｘｉ 】 Ｌ ｉｇ ｈ ｇ ｎ ｉ ｇｙ ｉ ｕ ｌ ｖｎ ｉ ｎ ｓａ ｚ Ｍ ｎ
水稻遗传转化研究进展
物遗传转化技术迅 猛发展 ， 稻转基 因植 株始 于 １８ 水 ９８
年， 经过近 ２ ０年的发 展 ， 稻遗传 转 化体 系 已 比较 完 水
１２ 电激 法 （ ｌ ｔ ｐ ｒ ｉ ） ． Ｅｅ ｒ ｏａ ｏ ｃｏ ｔｎ
电激法 也 叫 电穿 孔法 ， ２ 是 ０世纪 ８ ０年代初 发展
起来 的一种遗 传转 化技术 ， 也是 以原生 质体为 受体 的
一
水稻转基 因于 ２ ０世纪 ８ ０年代 后期 获得成 功 ， 最 初转 化均采 用原生质体为 材料 的 Ｐ Ｇ介导法 ， Ｅ 后来相 继发展 了电击法 ， 因枪 法及农 杆 菌介 导法 等。这些 基
应用。
关键词 ： 水稻 ； 传 转 化 ； 响 因素 ； 用 遗 影 应
中 图分 类 号 ： ７４ Ｑ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６ ２ ２０ ）５—００ ０ １０ ９ ３ （０ ８ ０ ０ ５— ５
水稻（ ｒ ａｓｔ ａ 是世 界上分 布 最广 ， Ｏｙ ｉ ） ｚ ａｖ 作为 最重 要 的的粮食 作物之一 ， 其遗 传转化一直受 到广泛重视 。 但是传统 的水稻育种方法 主要是 利用远缘杂交 和 品种
第２ ５卷第 ５期 ２０ ０ ８年 １ ０月
生 物 学 杂 志
Ｊ ０ＵＲ ＮＡＬ ０ Ｉ Ｌ Ｆ Ｂ Ｏ ＯＧＹ
Ｖｏ ． ５ Ｎｏ ５ １２ ．
０ｅ ． ００ ｔ２ ８
水 稻 遗 传 转 化 研 究 进 展
（． 川华 业有限 任公司， ， ００； ， １四 丰种秦代锦 陈德西 ６ １ 晓 王小波 董友非 龚 责 ， 成都 胡 ０ ． １ ２ ， ， 桥
水稻 花粉管通道法
水稻花粉管通道法摘要水稻花粉管通道法是一种高效、实用的遗传转化方法，广泛应用于水稻遗传改良。
本文介绍了水稻花粉管通道法的原理、技术流程、优缺点以及应用前景，以期为相关研究提供参考。
一、引言水稻是全球重要的粮食作物之一，对人类生活和经济发展具有重要意义。
为了提高水稻产量和品质，科学家们不断探索新的遗传改良方法。
其中，花粉管通道法是一种具有广泛应用前景的遗传转化方法。
二、原理花粉管通道法的基本原理是利用植物的花粉管通道，将外源基因导入植物受精卵中，实现基因的转移和表达。
在花粉与卵细胞结合形成受精卵的过程中，花粉管会穿过卵细胞壁，与卵细胞融合。
此时，外源基因可以通过花粉管通道进入受精卵，并随受精卵的发育而表达。
三、技术流程1. 基因构建：首先，将目标基因与合适的载体连接，构建成表达载体。
2. 载体转化：将构建好的表达载体导入植物细胞或原生质体中，获得转基因细胞或原生质体。
3. 细胞培养：将转基因细胞或原生质体进行培养，筛选出转化成功的细胞或原生质体。
4. 植株再生：将转化成功的细胞或原生质体培养成植株，并进行表型鉴定和分子检测。
5. 遗传稳定性检测：对转基因植株进行多代繁殖，检测其遗传稳定性。
四、优缺点1. 优点：花粉管通道法具有操作简便、转化效率高、适用范围广等优点。
此外，该方法不需要组织培养和病毒载体等辅助手段，降低了实验成本和操作难度。
2. 缺点：花粉管通道法也存在一些缺点，如转化过程中可能存在基因沉默现象、转化植株的遗传稳定性有待进一步验证等。
此外，该方法对环境可能产生一定影响，需要加强安全性和可持续性方面的研究。
五、应用前景随着基因编辑技术的发展和应用，花粉管通道法在基因功能验证、新品种培育等方面具有广阔的应用前景。
未来，科学家们可以进一步优化花粉管通道法技术流程，提高转化效率和安全性，为水稻遗传改良提供更加高效、实用的方法。
同时，随着人们对食品安全和环境保护意识的提高，对转基因作物的监管和审批也将更加严格。
一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统
＋Ｏ５ｍｇＬ Ｋ ． ． Ｔ＋Ｏ２ｍｇＬ Ｚ ） ． ．～ Ｔ 。另外 ， 还分析 了影 响Ｔ Ｄ Ａ 移 的多种 因素， ｎ ｌ 体种 类 、愈 伤组织 预培养 基和愈 伤 －Ｎ 转 ￣＃植 － 组 织继代 次数等 。采 用优 化的转化 程序 ， 水稻愈 伤组织转 化率 和植 株转化 率可 达７ ％以上 。 ０
ａ．２ ０ ） 验证 了该 系统 的适 用性 、 １ ０ ７， ， 可靠 性 和高效性 。
收稿 日期 ： ０ ７０ － ０ 接受 日期 ： ０ ７ １ 一 ９ ２ ０ —６２ ； ２ ０ — １Ｏ 基金项 目：国家 自然科 学基金 （ ｏ ３ ６ ０ ５ Ｎ ．０７１ ） ８ ‘通讯作 者 。Ｅ ｍａｌ ｃ ｏ ｇ ＠ｉ ａ ．ｃｃ － ｉ ｈ ｎ ｋ ｂ ｓａ ．ｎ ： ｃ
２ ０ ； ｔ １ ２ ０ Ｚｈ ａ ｇ ｅ １ ２ ０ Ｊ ａ ｇ ｅ ０ ４ Ｘｕ ｅ ． ０ ５； ｕ ｎ ｔａ ． ０ ６； ｉ ｎ ｔ ａ ， ，
成熟胚 的取用 ： 取消毒 后的成 熟种子 ， 用无菌水 浸 泡 ， — 小时 后， １ １ ２ ６ 转移 到无菌 培养皿 中， 用无 菌纸吸干
关键 词 农 杆菌介 导 的遗 传转 化， 成熟 胚诱 导 的愈伤组 织， 稻 水
陈惠 ， 原，种康 （０ ８． 赵 ２ ０ ） 一种 改进 的水稻成 熟胚 愈伤组 织 高效转化 系统 ． 物学 通报 ２ ， ２ — ３ ． 植 ５ ３２ ３１
一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统
植物学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００８， ２５ （３）： ３２２−３３１， ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期： ２００７－０６－２０； 接受日期： ２００７－１１－０９基金项目： 国家自然科学基金（Ｎｏ． ３０６７０１８５）＊ 通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ： ｃｈｏｎｇｋ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ．技术与方法．一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统陈惠１， ２， 赵原１， 种康１＊１中国科学院植物研究所， 光合作用与环境分子生理学重点实验室， 北京 １０００９３２山西师范大学生命科学学院， 临汾０４１００４摘要 以成熟胚愈伤组织为材料的农杆菌介导水稻转化法虽已建立， 但转化频率仍有待提高。
本文以粳稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）品种（中花１０号和中花１１号）的成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料， 对组织培养体系及影响遗传转化的因素进行优化， 建立了一套改进的农杆菌介导的水稻高效遗传转化系统。
农杆菌菌株为ＥＨＡ１０５， 质粒载体是ｐＵＮ１３０１／ ＯｓＲＡＡ１， 其中含有标记基因ＧＵＳ 和筛选基因ＨＰＴ。
愈伤组织诱导培养基为ＮＢＤ２ （ＮＢ＋２ ｍｇ·Ｌ－１２，４－Ｄ）， 继代培养基为ＮＢＤ０．５， 预分化与分化培养基为ＲＥ１ （ＭＳ＋１ ｍｇ·Ｌ－１６－ＢＡ ＋ ０．２５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）和ＲＥ２ （ＭＳ＋ １ ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）。
另外， 还分析了影响Ｔ－ＤＮＡ转移的多种因素， 如外植体种类、愈伤组织预培养基和愈伤组织继代次数等。
采用优化的转化程序， 水稻愈伤组织转化率和植株转化率可达７０％以上。
农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论
农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论羧苄青霉素的作用羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。
根据前人的研究经验，浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。
本实验过程中我们发现，经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理，转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发，有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌，并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。
这有可能是在长期的实验过程和进化过程中，农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。
因此，在遵循不影响愈伤组织生长的原则下，可以适当增加羧苄青霉素的用量，或者与头孢霉素配合使用，可以达到很好的抑制效果。
潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度本实验采用潮霉素基因作为筛选标记，经过长期经验积累，发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选，假阳性最低，筛选效果最好，为最适筛选浓度。
各个阶段不同添加物的作用水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择，主要有葡糖糖，麦芽糖和蔗糖，糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。
根据转化受体的不同，碳源的种类和浓度也有区别。
本实验室研究中发现，粳稻作为转化受体时，蔗糖为最佳的碳源，而在籼稻的遗传转化中，麦芽糖和蔗糖配合使用，效果最好。
植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。
2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。
在籼稻的遗传转化中，2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。
潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。
适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长，潮霉素浓度过高，阳性愈伤组织也有可能被筛死，浓度过低，又会有较高的假阳性出现。
实验证明，只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤，在分化再生过程中有显著差异。
水稻基因遗传转化方法研究进展
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭 涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。
从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。
生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。
非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。
水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。
直播稻金粳818成熟胚遗传转化体系的建立
直播稻金粳818成熟胚遗传转化体系的建立作者：李军玲张红磊张融雪蔡昱萌汪颖佟卉刘燕清苏京平来源：《安徽农业科学》2022年第09期摘要 [目的]建立高效的金粳818成熟胚遗传转化体系。
[方法]以直播稻品种金粳818成熟胚为外植体，设计4种诱导培养基，筛选适合金粳818的诱导条件;设计5种分化培养基，筛选适合金粳818的分化条件;获得的愈伤组织用农杆菌介导法进行转基因再生。
[结果]最佳诱导培养基为4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D，诱导率为89.3%;最佳分化培养基为MS+5.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，分化率为81.1%，成苗率为52.1%;经PCR分子检测，再生幼苗100%为转基因阳性植株。
[结论]该研究建立了金粳818成熟胚遗传转化体系，为品种定向改良奠定了技术基础。
关键词金粳818;成熟胚;愈伤组织;遗传转化中图分类号 S 511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2022）09-0100-04doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.024开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Establishment of Genetic Transformation System of Mature Embryo of Direct Seeding Japonica Rice Variety Jingeng 818LI Jun-ling， ZHANG Hong-lei， ZHANG Rong-xue et al（Crop Research Institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding， Tianjin 300384）Abstract [Objective]To establish an efficient genetic transformation system of Jingeng 818. [Method]Using the mature embryo of direct seeding rice variety Jingeng 818 as explant， four induction medium schemes were designed to obtain the suitable induction conditions of Jingeng 818;five kinds of differentiation medium were designed to obtain the suitable differentiation condition for Jingeng 818; and the obtained callus was used to establish the transgenic regeneration system by agrobacterium mediated method. [Result]The results showed that the best induction medium was 4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D with the induction rate 89.3%. The best differentiation medium was MS+5.0 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA with the differentiation rate 82.1% and the seedling rate 52.1%. By PCR molecular detection， 100% of the regenerated seedlings were transgenic positive plants.[Conclusion] In this study， the genetic transformation system of mature embryo of Jingeng 818 was established，which laid a technical foundation for directional improvement of varieties.Key words Jingeng 818;Mature embryo;Callus;Genetic transformation水稻是我國第一大口粮作物，水稻生产事关国家口粮安全。
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,. 水稻遗传转化体系Protocol
Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80 年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源基因导入到水稻中并获得再生植株[1~3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中获得成功[4], 随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。 此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei 等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~13 个独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技,. 术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻 e. 转基因优质水稻 f. 转基因高产水稻 g. 转基因抗除草剂水稻 3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用 随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒基因工程上的广泛研究和应用[13~18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。目前，国内在这方面属于起步阶段，仅仅做了一些构建干扰载体和获得RNA干扰植株[19~27]，但并没有获得高抗植株，国外，特别是日本在这方面有着较大优势，Omura T实验室分别在2009年和2010已获得了对RDV、RSV高抗植株[28，29]，另外Himani在2007年也获得了对RTBV高抗的植株[30]。（重要是看以上文献，一定要认真体会）
Materials and methods 一、接种 ,. 步骤： 1、 保存在-20度的种子使用前取出（用多少取多少，用纸包好），置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右（最好过夜）。 2、 拨去种皮（1），尽量不要损害到种胚，拨皮后检查，将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉（2），用纸包好带入组培操作间。 3、 （以下操作均在超净工作台内进行）将种子倒入干净的100ml三角瓶中，加入75%乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml 2%的NaClO(3),覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min，将NaClO倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基（NB培养基）（5）上，每皿20粒（4），注明日期，封口膜封口，置于27℃恒温箱中暗培养（15）； 二、掐芽 种子在培养箱中培养7天后，长出可见的芽和遁片，根据种子的生长状态，将芽掐掉（16），继续在27°C恒温箱中暗培养。 三、继代 掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块（17），转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。 四、农杆菌介导的水稻遗传转化 共培养（整个操作过程需8天） 第一天：选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于,. 27度暗培养4天。 第三天：农杆菌划线28°培养，两天后农杆菌长满即可洗脱（18），用于转化。 第五天：悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮（AS）(19)20ML的AMM液体培养基(20)中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基（AS培养基（21）上27度暗培养3天。 第八天：等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。 五、抗性愈伤的继代筛选 当抗性愈伤在朝霉素30培养基（22）上生长15天后（23），将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基（24）上，筛选3-7天。 六、分化 从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基（25）上再生，成团而不是分散放置（26），一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出，当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基（生根培养基）上（27）。 分化间进行，25°（28），光14小时，暗10小时。 七、生根 ,. 超净工作台内进行，每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗（29），在生根培养基上生长10天。（30）分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。 八、炼苗 生根十天后开盖，加已晾两天或晒过的水，泡过培养基即可（28），2天后（28）用水洗掉生根培养基，加晾两天或晒过的水浸过根，3-7天后待生长状态好了后移栽大田。（期间每天要加水，确保根都泡在水中）。分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。 九、移栽大田 土、水提前晒上两天，移栽盆装4/5体积的土，用水浸透即可，不能太多水，刚好浸过土面最好。 移栽：在盆上标记好，盆宽移栽两株，长四株；移栽时不能插深，植株能站住即可。 10天后可以施一点肥，不能太多。20天后可以每10天施肥一次，同样不能太多，太多会烧苗（如烧苗，施肥3天后可以观察到，应马上将水换掉）。 要保证白天29°（30），晚上23°；光14小时，暗10小时。（31）
Notes (1) 不用一粒一粒用手拨皮，在桌上垫一些白纸，用书压。力道要掌握好，太用力把种子压碎了，用力不够只能去个别的种皮，效率低。 注意：接触种子的纸必须是全白色的，不能有印刷有子的，否则用力压时，墨就着黑色上种子。 ,. (2) 不正常的种子，一律丢弃。因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。 (3) a. 20ml 2%的NaClO的配制： 实验室买的是有效浓9%的NaClO，所以取4.5ml 9%的NaClO加16ml蒸馏水即配成2%的NaClO b. 2%的NaClO现用现配，因为NaClO见光分解，所以配了就要赶紧用。 (4) 20粒共三圈，外圈12粒，中圈7粒，里一粒。 (5) NB培养基的配置（800ml）： 实验准备：所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗 步骤：取一升三角瓶 → 加24g蔗糖 ↓ 依次加入80ml N6max（10×） (6) 16 ml 铁盐 （50×） (7) 8 ml 肌醇 （100×） (8) 4 ml B5miin（200×） (9) ↓ 加多点（勿超500）三蒸水摇使其溶解，倒入1升量筒中，再加三蒸水定容至780ml ↓此时PH应为4.2-4.3 PH调至5.8（用pH计，KOH调） ↓ 加2.1g植物凝胶 （10） ↓ ,. 高压灭菌（121°20min） ↓ 灭完前30min，拿出16ml有机，化为液态 加1.6ml2.4-D（1mg／ml）(11)至16ml有机(12)中 ↓ 待培养基稍烫手抽滤（13），倒培养基(14) (6) N6max（10×）的配制（配1L）： ① KNO3 28.3 g ② KH2PO4 4.0 g ③（NH4）2SO4 4.63 g ④ MgSO4·7H2O 1.85 g ⑤ Cacl2·2H2O 1.66 g 或Cacl2 1.25 g 注： a．①②③④一起溶解混匀成A， b．⑤单独溶解，再与A交替混匀，以免长期存放产生沉淀； c．4℃冰箱保存；
(7) 铁盐（50×）的配制（配500mL）： ① FeSO4·7H2O 0.695g g ② NA2EDTA ·2H2O 0.9325 g 注： a．①②分别溶解，再交替混匀，边加边摇匀； ,. b．棕色瓶装； c．4℃冰箱保存；
(8) 肌醇 （100×）的配制（配1L）： 10 g肌醇（Inositol）用双蒸水定容至1L； 4℃冰箱保存； (9) B5miin（200×）的配制（配500mL）： ① MnSO4.H2O 0.758 g ② H3BO3 0.3 g ③ ZnSO4·7H2O 0.2 g ④ CuSO4·5H2O 0.0025 g ⑤ CoCl2·6H2O 0.0025 g ⑥ KI 0.075 g ⑦ NaMoO4·2H2O 0.025 g 注： a．一起溶解，三蒸水定容至500mL； b．棕色瓶装； c．4℃冰箱保存；
(10) 非琼脂粉。 (11) 2,4-D（1mg/ml）配1100ml）： 加1ml无水乙醇用枪吸吹，可溶解。再用纯水定容至100ml； 4℃冰箱保存；