6-高等植物遗传转化系统

异常RNA模型(aberrant RNA model)
分子间(内)碱基配对模型
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克服转基因沉默的策略
1 对转基因进行修饰
利用氨基酸密码子的简并性，对核酸序列进行百度文库 饰，选择适合的密码子，如调整GC含量。
2 启动子选择
过强的或带有病毒感染特征的启动子往往导致基 因沉默，选择中等强度、组成型的启动子，避免带有 同源序列的启动子、终止子可有效避免基因沉默。

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一 基因枪转化法
又称微弹射击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道 微靶点射击，将载有外源DNA的金属（钨或金）经驱动后通 过真空小室进入靶组织的一种遗传转化技术。 采用的基因枪分为火药引爆、高压放电、压缩气体等。 1987年美国康奈尔大学的Sanford首次用于植物遗传转化。 可用受体范围广泛，单、双子叶植物均可，许多单子叶植物 遗传转化的主要方法。 基因枪价格昂贵，转化成本较高，轰击过程对细胞损害较大， 转化效率有待进一步提高。
叶绿体基因工程的优越性
1 高效表达目的基因 2 安全性好 (母系遗传，不可能通过花粉扩散) 3 消除位置效应（定点整合） 4 无基因沉默现象（无位置效应、甲基化少） 5 原核基因表达方式 6 适宜的表达环境 具双层膜的细胞器，形成独立的小环境；叶绿体对 物质积累具较强的承受能力；产物区域化，便于提取。
2 花粉介导法：收集成熟花粉，基因枪等转化 花粉，后用转化后的花粉授于成熟的柱头上， 最后搜集成熟的种子。 优点：避开组织培养再生的过程，技术简单， 不需要装备精良的实验室，适合于难以再生 的植物，常规育种工作者易于掌握 。 缺点：技术尚不成熟；筛选工作量大，转化效 率较低。
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植物病毒可以感染植物寄主细胞，并进行复制和表达植物外源 DNA。利用植物病毒的特性有希望发展成为一种有价值的植物 遗传转化体系。 优点： 部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，可扩散到寄主所有 细胞，故无需组培再生； 可对单子叶植物进行高效浸染； 病毒感染的植物能够繁殖大量病毒颗粒，有望大量生产外源 蛋白。
基因枪及动力源的类型
火药爆炸轰击载体
塑料子弹为载体，火药爆炸为动力，挡板阻挡塑料载体，而金属子弹高速 轰击靶细胞。
压缩气体冲击载体
以压缩氦气动力，可裂膜携带微弹高速运动，以阻网阻挡可裂膜，微弹轰 击靶细胞。
高压放电基因枪
高压放电使水气化产生动力，驱动微弹载体。
压缩气流直接传送
以氦气动力直接驱动微弹。
染色体包装对转基因沉默的影响
后修饰作用
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转基因沉默机制
转录后水平的基因沉默 (Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS) 转录后水平的基因沉默是指转基因在细胞核 里能稳定转录，但在细胞质里却无相应的稳定 态mRNA存在，例如共抑制(co-suppression) 。 RNA阈值模型(RNA threshold model)
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三 生殖细胞原位转化法
植物生殖细胞指雌雄配子体中形成的或参与生殖 过程的有关细胞，如大小孢母细胞、卵细胞与花粉。 生殖细胞原位转化法利用天然繁殖过程为转化系统 进行遗传转化。 1 花粉管通道法：周光宇（1981）首先提出，之后 有不少改良。使子房预先充分授粉，在授粉后至合 子分裂之前，通过花柱断面滴加或子房注射，使外 源DNA到达培囊，搜集成熟种子，筛选转基因植株。 我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉 管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组 2016/2/22 IMAU, Huo XW 9 织培养人工再生植株，
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二 电击法
又称电击穿孔法，80年代发展起来的遗传转化技术， 利用高压放电产生的脉冲使细胞膜产生可逆的“微 孔”，从而使外源DNA等进入细胞。 最早应用于原生质体，近来有直接转化带壁植物细胞 核组织的报道。
国际公认的一种成熟可靠转化法，对受体无限制， 可用于胚性愈伤组织、悬浮细胞、分生组织、器官等。 但需对转化参数进一步优化，转化效率低。
第六讲 高等植物遗传转化系统
The System for Plant Gene Manipulation
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高等植物遗传转化系统
农杆菌介导转化方法 直接转化（理化法） 病毒感染
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病毒载体介导的植物遗传转化
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烟草叶绿体转基因载体（图例）
叶绿体基因组
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表达载体
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八 转基因沉默
外源基因在转基因植物中表达受抑制的现象 为转基因沉默，表现为表达不稳定、表达量低 甚至完全不表达。 转录水平 transcriptional gene silenceing, TGS
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六 PEG介导法
PEG为化学渗透剂，通过改变细胞膜的通透性促 使外源DNA进入靶细胞。所引起的膜透性可以恢复， 但引起的外源DNA进入机制尚不清楚。 技术原理：首先获得原生质体，并有相应的组培再 生体系。在一定渗透压体系内将外源DNA直接导入。 改进的方法有（1）脂质体法，将外源DNA与脂质体 （磷脂双分子膜）的复合体用于转化；（2）电击法 与PEG法相结合等，可提高转化效率。 特点：由于原生质体及相应的组培体系的获得较难， 且培养周期长、细胞遗传背景易变异，故 PEG法使用 2016/2/22 IMAU, Huo XW 13 日趋减少。
微靶点射击
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无需载体，将DNA与金属颗粒混合为小液滴，压缩气体为动力轰击。 IMAU, Huo XW
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基因枪转化法的影响条件
1 DNA：高纯度的DNA；质粒或裸露DNA 片段大小在 2025 kb 以內都可以；DNA浓度2ug/mg钨粒；加入携带DNA （4-6kb小牛胸腺或鲑鱼精DNA）。 2 金属粒的选择：金粒、钨粒。钨粒子较小也较便宜， 但形状不规则，对某些细胞具毒性；金粒子呈圆球形， 大小均匀，在经费许可下，可使用金粒子。金属粒越大， 速度及穿透力也越大。 3 微弹速率：样品与微弹间距、压力、真空度。 4 DNA沉淀剂：氯化钙、亚精胺、聚乙二醇等。 IMAU, Huo XW 15 5 2016/2/22 植物材料受体:
转化方法 受体材料 宿主范围 组培条件 嵌合体比例 操作复杂性 设备要求 工作效率 单子叶植物应 用
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农杆菌法 完整细胞 有 简单 有 简单 便宜 高 少
PEG法 原生质体 无 复杂 无 简单 便宜 低 可行
电击法 原生质体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行
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影响基因枪法遗传转化的因素

根据植物的种类不同，所选择的最
佳轰击材料不同。

不同类型的品种，其转化频率也不相同。 同一品种来源的不同时期愈伤组织，转化频率也不尽相 同。

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轰击前后的培养条件

在对材料轰击前，进行预培养、高渗处理及轰击后 的继续高渗处理，延迟筛选都可以提高基因枪法的 转化频率。 轰击后的材料，在一定的时间内只进行抑菌培养而 不进行筛选，对转化频率有一定的影响，因为轰击 对材料造成的机械的损伤，轰击后需要一段时间的 损伤修复。
微针注射法 原生质体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行
基因枪法 花粉管通道法 完整细胞 无 简单 多 复杂 昂贵 高 广泛 卵细胞 有性繁殖植物 无 无 简单 便宜 低 广泛
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七 叶绿体基因工程
1. 叶绿体本身为半自主复制，大部分组分有核基因组编码。叶 绿体基因组为双链环状分子，约120-217kb，编码120-160个 基因。单个叶绿体中含20-900个拷贝。叶绿体基因组显著特 点为具反向重复序列，大小约6-67kb。
外壳蛋白基因及复制
细胞间传递
注射
DNA A-NPT II
双元表达载体
三周后
LB RB
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叶片组织产 生kan抗性
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农杆菌
高等植物细胞直接转化法
基因枪转化法 电击法 生殖细胞原位转化法（花粉管通道法） 显微注射法 激光微束穿刺法 PEG介导法（化学共培法）
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PDS-1000
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一种手持基因枪
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基因枪转化流程
表达载体构建
微弹制备
装弹
轰击
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转基因植株
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组培
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常用植物基因转化方法特点比较
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五 激光微束穿刺法
利用激光微束（0.3-0.5uM）射击靶细胞，引起可逆性穿孔， 从而直接导入外源DNA。首先在动物与人的细胞中获得成功， 80年代后期用于植物。 技术原理：激光照射系统产生高能量激光脉冲，照射经高渗处 理的材料，产生穿孔后，外源DNA向靶细胞渗入。然后培养靶 组织，产生转化植株。 优点：可瞄准靶细胞定位导入外源DNA，与其他方法比较对靶 细胞损伤小、恢复快。单、双子叶植物均可，受体细胞可以是 花粉、单细胞或组织、器官。 缺点：需要相应昂贵的设备，穿刺处理速度较慢。
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基因枪的轰击参数
DNA的浓度 DNA的沉淀剂 微弹的速度、射程和轰击次数 微弹的用量 培养基成分 微弹粒径 样品室高度 样品室内真空度 2016/2/22 IMAU, Huo XW 轰击前的辐照剂处理

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基因枪转化操作
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缺点：
目前对植物病毒分子生物学研究十分初浅，还 不能建立有效遗传转化体系。迄今为止，植物病毒 载体尚未发展到可以广泛使用的阶段。
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重组双子座病毒载体系统感染植物示意图
外壳蛋 白基因
DNA A
DNA B
NPT II
2. 叶绿体基因工程原理：通过一定方法使外源基因穿过细胞膜 和叶绿体双层膜进入叶绿体，在两端同源片段的介导下与叶 绿体基因组之间发生同源重组，以定点整合的方式插入到叶 绿体基因组，在其中表达。
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叶绿体基因工程内容 1 将外源DNA送入叶绿体
主要通过基因枪转化法
四 显微注射转化法
利用显微装置将大分子物质（DNA）或细胞器注 射到培养细胞中。最初主要由于动物，80年代中后 期开始用于植物遗传转化。用微毛细管在显微镜下 将外源DNA导入特定细胞，并使其成活、增殖。 技术要点：注射针直径要细（1uM）;选择生长旺盛 的胚性细胞；注射细胞核；进行微培养法。 优点：可精细选择受体细胞，并直接导入细胞核。 缺点：工作效率低，需要特殊显微操作系统，操作 复杂。 2016/2/22 IMAU, Huo XW
2 外源DNA整合到叶绿体基因组中
*在目的基因两侧各加一段受体叶绿体基因组同源片段，大小一 般1.5kb，过短降低转化效率，过长操作复杂； *选择合适插入位点，不影响受体； *如在反向重复区内，还需通过拷贝纠正作用才能完成。
3 筛选带有外源基因的转基因植株 4 经多轮筛选达到同质化
通常在一定筛选压下多代选择，获得同质系。筛选标记有： aadA基因（提供链霉素与壮观霉素抗性）、GFP（绿色荧光蛋白） 等。 2016/2/22 IMAU, Huo XW 25
转录后水平
post- transcriptional gene silenceing, PTGS
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转基因沉默机制
转录水平的基因沉默 Transcriptional Gene Silencing,TGS 转基因无法被顺利转录成相应的RNA而导致 基因沉默 转基因及其启动子甲基化 多拷贝重复转基因序列引起的转录水平基因沉默 同源基因间的反式失活 转基因位置效应