水稻遗传转化体系Protocol
水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族分析的开题报告
水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族
分析的开题报告
标题：水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族分析
背景：水稻是世界上重要的粮食作物之一，但受到各种胁迫因素的影响，如盐碱、干旱等，导致其产量下降。
因此，学者们致力于研究水稻的遗传转化和蛋白家族，以
求得提高其适应性和生产性。
研究内容：
1. S5-n基因由于其广泛亲和力和较强的耐盐性而备受关注。
本研究将运用CRISPR-Cas9技术将S5-n基因引入水稻，通过遗传转化分析，探究S5-n基因对水稻
的影响和提高水稻耐盐性的途径。
2. OsAP（Alkaline Phosphatase）是一类磷酸酶蛋白家族，参与了许多生物学功能。
本研究将会分析水稻中OsAP家族的成员及其功能，为深入研究水稻生长发育和
抗胁迫机制提供基础。
研究意义：通过本研究，可以探究水稻的遗传转化和蛋白家族，理解水稻的生物学机制，提高水稻的抗胁迫能力和产量，为粮食生产做出贡献。
研究方法：本研究将运用CRISPR-Cas9技术将S5-n基因引入水稻，对遗传转化的水稻进行生理生化指标测定和耐盐性测试。
对OsAP家族的成员和功能进行分析，
采用生物信息学手段进行序列分析和结构预测。
预期结果：本研究预计可以得出以下结果：S5-n基因可以增加水稻的耐盐性，
提高其适应性和生产性；对OsAP家族的成员和功能进行分析，可以为水稻的生长发
育和抗胁迫机制提供基础。
研究限制：由于技术和时间的限制，可能不能探究出水稻中所有的OsAP家族成员和功能，研究结果仅是初步探究水稻遗传转化和蛋白家族的机制。
水稻遗传转化与改良研究
水稻遗传转化与改良研究水稻是中国传统的重要粮食作物之一，也是世界上最重要的粮食作物之一。
在中国，种植水稻被认为是一项非常重要的农业工作，因为它涉及到亿万人民的生计。
水稻遗传转化与改良研究，就是在这一背景下诞生的。
下面，我将从水稻遗传变异、水稻遗传转化和水稻遗传改良的角度入手，谈论水稻遗传转化与改良研究的内容及其意义。
一、水稻遗传变异水稻的遗传变异是指水稻基因组内的基因序列多样性。
一个基因序列对应着一个或多个基因，它们的差异性共同组成了水稻的遗传多样性。
水稻遗传变异的产生原因很多，比如基因重组、突变、外源基因导入等等。
在自然条件下，水稻的遗传变异是非常缓慢的，甚至可能需要数十年乃至数百年的时间，才能形成明显的遗传多样性。
而在科学研究中，我们可以采用人工方式来诱发、加速水稻的遗传变异。
例如，通过辐射、化学物质等方式来加速水稻基因重组和突变，或者将外源基因导入水稻中，从而实现水稻遗传变异。
水稻遗传变异的意义：水稻遗传变异是实现水稻遗传转化和改良的前提。
种植业界的经验表明，在保证水稻的生产安全和品质的同时，保持一定的遗传多样性，能够让水稻对环境变化更有抵抗力，育种更容易取得成功。
此外，基因变异还是新基因发掘和利用的重要途径之一，也是进一步理解水稻基因功能的重要途径之一。
二、水稻遗传转化水稻遗传转化是指将外源基因和其他物质导入水稻细胞、组织或个体中，从而实现水稻基因型的改变或性状的增强。
水稻遗传转化是一项非常复杂而微妙的工作，需要兼顾技术、所需物质、对种植业的影响等多种因素。
因此，在进行水稻遗传转化之前，必须做好充分的前期准备工作，包括建立适宜的目标基因、筛选合适的携带者和接受者、合理设计导入方案、筛选鉴别基因等等。
水稻遗传转化的意义：水稻遗传转化是实现水稻遗传改良、提高水稻品质和产量的关键手段之一。
它可以帮助我们更快地选育出优良新品种，增加水稻并能力和适应性，同时也可以开拓水稻种植业的新路径和新区域，为全球化的水稻种植提供更为丰富的选择。
水稻的遗传转化
水稻的遗传转化1）种子消毒：用75%乙醇浸泡去皮的水稻种子1min（剧烈摇动），再用2.5%的次氯酸钠分别处理两次，每次15min，然后用无菌水冲洗3-5次后均匀铺于诱导培养基上，不宜过多，一个培养皿大概14-20粒。
2）水稻愈伤组织的诱导和继代培养：消毒好的成熟种子在诱导培养基上28℃暗培养25-28天。
待愈伤组织长至合适大小，在培养基中来回剧烈摇动几次，使一些小块愈伤从大的组织块上脱离，从中挑选光滑、淡黄色、较硬、大小在2-3mm的胚性愈伤，均匀铺放在继代愈伤培养基上，28℃避光培养7-8天，即可用于农杆菌转化。
3）农杆菌介导的水稻愈伤组织转化及共培养：刮取已活化3天的农杆菌，放入液体共培养培养基中，用力打散，置摇床摇培0.5-2h，使得菌液的OD600在0.1-0.15（0.125最宜）之间。
将挑选的愈伤组织小粒放入已加农杆菌的液体培养基中，轻轻摇动几次，放置15-20min。
倒去菌液，用无菌滤纸吸干均匀的铺在已加滤纸的共培养基中。
愈伤在共培养培养基中22℃条件下暗培养3天。
4）转化愈伤组织的选择培养：共培养后的愈伤先用灭菌水洗涤三次，后用含头孢500mg/L的灭菌水浸泡30min，期间轻轻摇动，之后用滤纸吸干，均匀铺放在选择培养基上，28℃暗培养10天，之后进行第二次筛选，挑选淡黄色、生长状态良好的愈伤，均匀铺放在含潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃暗培养15天。
5）愈伤组织的分化培养：挑选黄色、圆形的愈伤组织，均匀铺放在预分化培养基上，28℃暗培养7天。
之后挑选生长状态良好、淡黄色的胚性愈伤，放入分化培养基上，28℃光照培养30-60天左右，直至转基因小苗长出。
中间每隔25天左右将愈伤转移到新鲜的分化培养基上。
6）水稻的壮苗培养与移栽：将长出的小苗去掉周围的愈伤，在无菌条件下转移到1/2MS的壮苗培养基中，使根部浅插入培养基中，28℃光照培养（14h光/10h暗）。
当苗长至瓶口、约10cm以上时，打开瓶口所覆塑料膜，瓶内加入约1/3 的水，使苗暴露于空中炼化培养。
水稻遗传转化实验学习体会
水稻遗传转化实验学习体会
水稻（Oryzasativa）是世界上最主要的粮食作物之一。
近年来，DNA重组技术、遗传操作技术、水稻基因图谱的研究取得了显著发展，美国Monsanto公司2000年4月、Syngenta公司2001年2月先后宣告完成粳稻日本晴（Nipponbare）基因组测序草图。
我国也已宣布完成籼稻9311的序列框架图。
目前以大规模分离、鉴定基因组序列功能为特征的水稻功能基因组研究正在迅速发展，而这一研究之后必然是依托于高效的水稻遗传转化体系，因此水稻遗传转化研究越来越成为人们关注的焦点。
水稻遗传转化体系已比较完善，农杆菌介导法、基因枪法、PEG 法、花粉管通道法等方法均在水稻遗传转化中应用并获得转基因植株，但目前用的最多的方法是基因枪法和农杆菌介导法。
禾谷类作物由于不是农杆菌的天然宿主，曾一度限制了农杆菌介导法转化水稻。
基因枪法由于其没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效地转化，因而得到了很大的发展。
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立：以质粒PBI121和gfp作为外源DNA转化农杆菌EHA105，通过对EHA105生长状态的测定，并对重悬液Cacl浓度，速冻时间和热处理温度等实验条件逐一进行筛2选，以确定EHA105的最优转化条件。
然后，分别用被转化的农杆菌侵染水稻愈伤组织。
结果表明，农杆菌 OD值接近0.6经过20mmol/L Cacl2重悬细胞，液氮速冻5600分钟后于28?处理5分钟，农杆菌的转化效率最高。
愈伤组织经GUS染色或荧光观察，外源基因已经转入水稻种子中。
农杆菌；水稻愈伤组织；遗传转化: Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed by the plasmid PBI121 and gfp. To difine the best experimental conditions for transformationof A.tumefaciens the growth rate of the A.tumefaciens EHA105 was measured ,andthe concentration of resuspension solution,freezing time and the thawingtemperature were tested. And then infected mature rice in order to inducecallus with Agrobacterium tumefaciens respective .Result: By resuspended inCaclbuffer, frozen in liquid nitrogen for 5 min and thawed in 28? for 5 2min, the efficiency of transformation was the best. The callus was dyed byGUS or seen by fluorescence, which can testify that exterior gene has beentransferred into rice.Agrobacterium tumefaciens; rice callus; Genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物，并已为分子生物学研究的模式作物之一。
农杆菌介导水稻快速转化-Bio-protocol
农杆菌介导水稻快速转化Agrobacterium-mediated Rapid Transformation of Rice崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩*作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉*通讯作者邮箱：hchen@引用格式：崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩. (2018). 农杆菌介导水稻快速转化. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176.How to cite: Cui, Y., Cai, C. X., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated rapid transformation of rice. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. (in Chinese)实验原理：Toki等(2006)发现，水稻成熟胚在诱导愈伤1 d后可以被农杆菌侵染，诱导愈伤5 d后可以被高效转化。
Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下，水稻愈伤组织可以快速分裂。
在该条件下进行筛选培养，14 d可以得到明显的抗性愈伤组织。
本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上，参考Toki等(1997，2006)发表的部分实验参数，建立快速的水稻转化方法，以缩短遗传转化周期。
本实验在32 °C、光照条件下诱导愈伤，对诱导5 d的水稻愈伤组织进行侵染，随后在32 °C、光照条件下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养，14 d后获得了抗性愈伤组织，对抗性愈伤组织进行分化培养，获得稳定的转化植株。
从愈伤组织诱导到转化再生植株生根，整个实验周期约为50 d。
关键词：水稻成熟胚，农杆菌介导，快速转化材料与试剂1. 滤纸2. 水稻种子3. 75%酒精4. 吐温205. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体)6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)8. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)9. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)10. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)11. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)12. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)13. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC. catalog number: CDJ469)14. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)15. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)16. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)17. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)18. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)19. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)20. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)21. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)22. Agar powder (日本分装，catalog number: BM0212)23. Glycine (日本分装，catalog number: BA0802)24. Proline (进口分装，catalog number: A1122)25. D-sorbitol (上海生工，catalog number: SB0491)26. NH4NO327. KH2PO428. KNO329. MgSO4·7H2O30. CaCl2∙2H2O31. MnSO4·4H2O32. ZnSO4·7H2O33. H3BO334. KI35. Na2MoO4·2H2O36. CoCl2·6H2O37. CuSO4·5H2O38. (NH4)2SO439. FeSO4∙7H2O40. Na2EDTA∙2H2O41. KOH42. HgCl243. Glucose44. Sucrose45. LB培养基46. 封口胶47. MS max储备液(10x) (见溶液配方)48. MS min储备液(100x) (见溶液配方)49. N6max储备液(10x) (见溶液配方)50. N6min储备液(100x) (见溶液配方)51. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)52. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)53. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)54. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)55. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)56. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)57. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)58. 200 mM AS储备液(见溶液配方)59. 1 N KOH储备液(见溶液配方)60. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)61. 50% 葡萄糖(见溶液配方)62. 250 mg/ml Cn (见溶液配方)63. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)64. 诱导培养基(见溶液配方)65. 悬浮培养基(见溶液配方)66. 共培养基(见溶液配方)67. 筛选培养基(见溶液配方)68. 分化培养基(见溶液配方)69. 生根培养基(见溶液配方)仪器设备1. 超净台2. 酒精灯3. 镊子4. 平皿5. 三角瓶6. 生根管7. 摇床8.培养箱实验步骤1. 愈伤诱导选取成熟饱满的水稻种子，去壳；75%酒精消毒1~2 min，倒去酒精；用灭菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15%的升汞(含有0.1%的吐温20)浸泡15~18 min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。
水稻遗传转化步骤
实验流程：种子灭菌（ms+, 28天，暗培养，28℃）---愈伤继代（ ms,7天，28℃自然光照）--转化共培养（co,暗培养3天，上面放一层滤纸19℃，很重要！）---第一次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第二次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第三次选择（选抗性愈伤，S250，暗培养7天，28℃）---预分化（m,暗培养8天，28℃）---第一次分化（f,先暗培养2天，28℃，后光照13天）---第二次分化（ f，光照15天）---壮苗（1/2，光照，时间不定）种子灭菌：（1）用75%酒精泡5分钟，倒出酒精，加2.5%次氯酸钠摇10分钟以上（2）倒出次氯酸钠，再加2.5%次氯酸钠15-20分钟，猛烈摇动，在超净台上倒去次氯酸钠，用灭菌水洗10次以上，然后放于滤纸上吸干，接种于ms+培养基。
共培养处理：种子愈伤处理28天左右，挑优质愈伤继代培养一次，挑颗粒用农杆菌浸泡15分钟，共培养三天后，挑无褐色愈伤颗粒，用灭菌水洗三次，放入NBL中，摇床摇2小时（200rpm），滤纸吸干后放入筛选培养基S中。
培养基配制；接种培养基（ms+）MS大量，微量，有机，2，4-D（2mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸2.8g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l接种继代培养基（ms）MS大量，微量，有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Phytagel 3g/l共培养培养基（co，pH5.3）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l），蔗糖30g/l，葡萄糖10g/l，phytagel（3g/l），灭菌后加AS20mg/lNBL：就是co加上头孢500mg/l，不加AS选择培养基S500N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢500mg/l，潮霉素50mg/l抗性愈伤继代培养基（S250）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l成熟培养基（m）N6大量，B5微量，B5有机，NAA1mg/l，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l，ABA3mg/l，BA2mg/l分化培养基（f）N6大量，B5微量，B5有机，NAA0.5mg/l, Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l,水解酪蛋白0.3g/l, phytagel4.6g/l灭菌后加BA3mg/l壮苗培养基（1/2）MS大量，微量，有机，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Agar5.8g/l 注：2，4-D浓度为2mg/l，溶于0.1NNaOH或酒精硝酸银浓度为0.85mg/ml，避光保存。
水稻基因遗传转化方法研究进展
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭 涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。
从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。
生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。
非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。
水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。
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水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
目前，国内在这方面属于起步阶段，仅仅做了一些构建干27]，但并没有获得高抗植株，国外，特别是日扰载体和获得RNA干扰植株[19~本在这方面有着较大优势，Omura T实验室分别在2009年和2010已获得了对RDV、RSV高抗植株[28，29]，另外Himani在2007年也获得了对RTBV高抗的植株[30]。
（重要是看以上文献，一定要认真体会）Materials and methods一、接种步骤：1、保存在-20度的种子使用前取出（用多少取多少，用纸包好），置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右（最好过夜）。
2、拨去种皮（1），尽量不要损害到种胚，拨皮后检查，将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉（2），用纸包好带入组培操作间。
3、（以下操作均在超净工作台内进行）将种子倒入干净的100ml三角瓶中，加入75%乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml 2%的NaClO(3),覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min，将NaClO倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基（NB培养基）（5）上，每皿20粒（4），注明日期，封口膜封口，置于27℃恒温箱中暗培养（15）；二、掐芽种子在培养箱中培养7天后，长出可见的芽和遁片，根据种子的生长状态，将芽掐掉（16），继续在27°C恒温箱中暗培养。
三、继代掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块（17），转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。
大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。
四、农杆菌介导的水稻遗传转化共培养（整个操作过程需8天）第一天：选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于27度暗培养4天。
第三天：农杆菌划线28°培养，两天后农杆菌长满即可洗脱（18），用于转化。
第五天：悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮（AS）(19)20ML的AMM液体培养基(20)中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基（AS培养基（21）上27度暗培养3天。
第八天：等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。
五、抗性愈伤的继代筛选当抗性愈伤在朝霉素30培养基（22）上生长15天后（23），将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基（24）上，筛选3-7天。
六、分化从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基（25）上再生，成团而不是分散放置（26），一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出，当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基（生根培养基）上（27）。
分化间进行，25°（28），光14小时，暗10小时。
七、生根超净工作台内进行，每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗（29），在生根培养基上生长10天。
（30）分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。
八、炼苗生根十天后开盖，加已晾两天或晒过的水，泡过培养基即可（28），2天后（28）用水洗掉生根培养基，加晾两天或晒过的水浸过根，3-7天后待生长状态好了后移栽大田。
（期间每天要加水，确保根都泡在水中）。
分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。
九、移栽大田土、水提前晒上两天，移栽盆装4/5体积的土，用水浸透即可，不能太多水，刚好浸过土面最好。
移栽：在盆上标记好，盆宽移栽两株，长四株；移栽时不能插深，植株能站住即可。
10天后可以施一点肥，不能太多。
20天后可以每10天施肥一次，同样不能太多，太多会烧苗（如烧苗，施肥3天后可以观察到，应马上将水换掉）。
要保证白天29°（30），晚上23°；光14小时，暗10小时。
（31）Notes(1) 不用一粒一粒用手拨皮，在桌上垫一些白纸，用书压。
力道要掌握好，太用力把种子压碎了，用力不够只能去个别的种皮，效率低。
注意：接触种子的纸必须是全白色的，不能有印刷有子的，否则用力压时，墨就着黑色上种子。
(2) 不正常的种子，一律丢弃。
因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。
(3) a. 20ml 2%的NaClO的配制：实验室买的是有效浓9%的NaClO，所以取4.5ml 9%的NaClO加16ml蒸馏水即配成2%的NaClOb.2%的NaClO现用现配，因为NaClO见光分解，所以配了就要赶紧用。
(4) 20粒共三圈，外圈12粒，中圈7粒，里一粒。
(5) NB培养基的配置（800ml）：实验准备：所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗步骤：取一升三角瓶→加24g蔗糖↓依次加入80ml N（10×） (6)6max16 ml 铁盐（50×） (7)8 ml 肌醇（100×） (8)（200×） (9)4 ml B5miin↓加多点（勿超500）三蒸水摇使其溶解，倒入1升量筒中，再加三蒸水定容至780ml↓此时PH应为4.2-4.3PH调至5.8（用pH计，KOH调）↓加2.1g植物凝胶（10）↓高压灭菌（121°20min）↓灭完前30min，拿出16ml有机，化为液态加1.6ml2.4-D（1mg／ml）(11)至16ml有机(12)中↓待培养基稍烫手抽滤（13），倒培养基(14)(6) N6max（10×）的配制（配1L）：① KNO3 28.3 g② KH2PO4 4.0 g③（NH4）2SO4 4.63 g④ MgSO4·7H2O 1.85 g⑤ Cacl2·2H2O 1.66 g 或Cacl2 1.25 g注：a．①②③④一起溶解混匀成A，b．⑤单独溶解，再与A交替混匀，以免长期存放产生沉淀；c．4℃冰箱保存；(7) 铁盐（50×）的配制（配500mL）：① FeSO4·7H2O0.695g g② NA2EDTA·2H2O0.9325 g注：a．①②分别溶解，再交替混匀，边加边摇匀；b．棕色瓶装；c．4℃冰箱保存；(8) 肌醇（100×）的配制（配1L）：10 g肌醇（Inositol）用双蒸水定容至1L； 4℃冰箱保存；(9) B（200×）的配制（配500mL）：5miin①MnSO4.H2O 0.758 g②H3BO3 0.3 g③ZnSO4·7H2O 0.2 g④CuSO4·5H2O 0.0025 g⑤CoCl2·6H2O 0.0025 g⑥KI 0.075 g⑦NaMoO4·2H2O 0.025 g注：a．一起溶解，三蒸水定容至500mL；b．棕色瓶装；c．4℃冰箱保存；(10) 非琼脂粉。
(11) 2,4-D（1mg/ml）配1100ml）：加1ml无水乙醇用枪吸吹，可溶解。
再用纯水定容至100ml；4℃冰箱保存；(12) 有机（50×）的配制（配1L）：①盐酸硫胺素（VB1）0.5 g②盐酸吡哆醇（VB6）0.05 g③尼克酸（烟酸）0.05 g④水解酪蛋白15 g⑤谷氨酰胺12.5 g⑥脯氨酸25 g⑦甘氨酸0.1 g注：a．以上药品均要求Sigma的，一起溶解，三蒸水定容至1L；b．再分装，每个16mL；c．用滤纸、漏斗过滤分装；d．-20°冰箱保存；e．用时提前拿出来；（13）抽滤：在超净台中把有机倒入一培养皿中，抽滤（先要试下过滤膜有没有装好：注射器抽一些有机并抽入些空气，打出有机，若弹起，才可以进行抽滤。
所以通常过滤的应多准备几个；若使用一次性过滤器则直接抽滤即可；过滤膜为0.2um）,摇荡三角瓶（混匀），酒精灯烧瓶口再倒培养基。
(14) 倒培养基：a．六皿培养皿一摞，从下至上倒培养基b．每皿倒一半稍多厚（水稻组培要厚点）,800ml倒22皿左右。