目的基因的遗传转化
转基因的基础知识
转基因的基础知识目录1. 转基因概述 (2)1.1 转基因的定义 (2)1.2 转基因技术的发展历史 (3)1.3 转基因技术的分类 (4)2. DNA及基因的介绍 (5)2.1 DNA的结构与功能 (7)2.2 RNA和基因表达 (8)2.3 基因的识别和分离 (9)3. 转基因的方法学 (10)3.1 直接基因运输法 (12)3.1.1 显微吸管法 (13)3.1.2 电穿孔法 (14)3.1.3 粒子轰击转化法 (15)3.2 载体介导的转基因技术 (16)3.2.1 病毒载体 (17)3.2.2 细菌载体 (18)3.2.3 人工染色体载体 (19)3.3 基因编辑与基因驱动 (20)4. 转基因伦理与法律考量 (22)4.1 转基因伦理争议 (24)4.2 转基因法律法规现状 (25)4.3 公众认知与消费者权利 (26)5. 转基因在农业中的应用 (27)5.1 转基因作物开发 (28)5.2 转基因农作物的益处与风险 (30)5.3 转基因作物的常见类型 (31)6. 转基因在生物医药领域的应用 (32)6.1 基因治疗 (33)6.2 基因工程用于疫苗与药物 (34)6.3 转基因动物模型 (36)7. 转基因的未来趋势 (37)7.1 新基因编辑工具的发展 (38)7.2 转基因技术的精确性与安全性提升 (40)7.3 生态系统平衡与生物多样性保护 (41)7.4 全球化与转基因的国际合作 (42)1. 转基因概述又称基因工程，是一项革新性的生物技术，通过基因操作改变生物遗传物质，赋予其新的特性或增强现有特性。
核心原理是将目标基因（如抗病基因、抗虫基因、提高营养价值等）从一个生物体（供体生物）分离并插入到另一个生物体的基因组中（受体生物），从而改变受体生物的基因组成。
这一过程能够使受体生物获得新的功能，例如抵抗特定病害、耐受农药、提高产量、增强营养价值等。
转基因技术广泛应用于农业、医药、环境保护等领域，对人类生活产生了深远影响。
第五章 植物基因的遗传转化
主讲：胡银岗植物科学系农学院植物科学系西北农林科技大学农学院西北农林科技大学植物基因受体系统质粒介导基因转化直接导入的基因转化第四节花粉管通道法介导基因转化第五节病毒介导的基因转化第六节植物基因转化系统的选择第七节单子叶植物的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。
用于转化的外植体（如发苗产生子叶、胚轴等）通过组织培养途径或其它非组织培养途径能高效、稳定地再生无性系接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感植物基因转化受体系统的条件（一）高效稳定的再生能力（二）较高的遗传稳定性（三）具有稳定的外植体来源（四）对选择性抗生素敏感（五）对农杆菌侵染有敏感性（一）高效稳定的再生能力从理论上讲，植物的任何体细胞都具有再生完整植（totipotency）但在组织培养的实践中，并不是所有的体细胞都能再生出完营养生长中心（分生组织）和薄壁细易再生出植株。
再生频率必须具有好的稳定性和重复性。
植物转化频率一般情况下只有0.1%。
基因转化操作，如农杆菌侵染，使用抗菌素筛选及继代培养，都会使转化外植体再生频率降低，有的甚至不能分化，或只能分化形成芽，而难以形成植株。
若只有10%再生率，则转化率10% ×0.1% = 0.01%后不影响其分裂和分化，并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性，尽量减少变异。
不因导入优良性状的目的基因，使原有的目的性状（优良性状）在后代发生了变异。
注意组培过程（组培方法，再生途径及外植体基因型）引稳定的外植体来源，即外植体容易得到并且可以大量提供。
因基因转化的频率很低，需要多项反复地实验，所以就需要大量的外植体材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等，或采用快速无需复杂的培养和繁殖操作过程，数量亦多；接种前的无菌处理简便易行；一些植物可由无菌幼苗形成愈伤组织和再生植株；无需保持无菌苗的无性系，只要有种子，随时可大量培养已适应组织培养条件，有利于外植体转化生长；可直接采用、无需消毒；材料来源量大而稳定。
基因工程中的遗传转化技术
基因工程中的遗传转化技术随着科技的不断进步和人类对于基因的深入研究，基因工程开辟了一个全新的领域，为我们带来了更多的可能性和前景。
而在基因工程中，遗传转化技术作为其中一项重要的技术之一，具有不可忽视的意义。
本文将重点介绍遗传转化技术在基因工程中的应用以及其相关的技术和问题。
一、什么是遗传转化技术遗传转化技术（Genetic transformation）是指将异物（如DNA）导入生物细胞内，使其成为一个新的功能基因，从而改变生物的遗传特征。
遗传转化在某种程度上实现了跨物种的融合，使得基因改良的范围变得更加宽广。
而在基因工程中，遗传转化技术一般指在体外进行转录（in vitro transcription）并随后在体内转化（in vivo transformation）。
二、遗传转化技术在基因工程中的应用1、传统农业领域经过遗传转化技术改良后的农作物，可以更好的适应环境和提高产量，同时具有抗病性和适应性等优势。
比如水稻的基因改良使得其极大地提高了产量和抗病性，而通过向玉米引入拟南芥的基因能够增加玉米与蚜虫之间的抗性。
2、生物医学领域遗传转化技术在生物医学领域中也有着广泛的应用，可以通过改良基因来治疗疾病。
例如将带有缺陷的基因进行修复或替换，帮助治疗一些罕见病并降低复发率。
另外，通过编辑细胞的基因，可以改变细胞自身的功能，使得细胞在特定情况下具有特定的特性和生物活性。
3、环境保护领域利用遗传转化技术对环境中的生物进行改良，具有一定的环保效果。
如将某些细菌的功能进行改良，使其能够对特定的毒物或有害气体进行处理，达到降低污染的目的。
三、遗传转化技术中的问题及其解决方法1、基因流失目前，遗传转化仍然存在基因流失的问题，即将转基因物种与外部环境中的野生物种杂交，导致转基因物种的基因流入野生物种中。
这种基因流失的现象往往会对生态系统造成一定的影响。
为了解决这个问题，应该通过对外部环境中野生动植物的监测和分析，以及对生态链的探究，来规避基因流失这个风险。
总结遗传转化过程各个环节的要点及注意事项
总结遗传转化过程各个环节的要点及注意事项
应用重组DNA技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获得新植株的技术第一类：外源裸露基因的直接导入法；通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物基因组中。
基因枪转法第二类：载体介导的转化方法；通过将目的基因连接在植物表达载体上，随着载体DNA的转移而将外源目的基因整合到植物基因组中。
农杆菌介导转化法，病毒介导的转化法第三类：种质转化系统法；包括植物原位真空渗入法和花粉管通道法。
（一）基因枪法；（1）原理：基因枪法把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器。
气体基因枪可在广泛的细胞型中得到瞬时的、稳定的和高效率的转化作用，气体基因枪有一个产生冲击波的特殊结构，在恰当的气压范围内从3.5MPa-10MPa，具有相应不同的可破裂膜，将包覆DNA的粒子穿越，射入在轰击室底部的靶细胞中。
（2）程序与方法：（1）轰击微弹的制备（2）基因枪轰击参数（3）受体材料（4）轰击样品。
高中生物4章基因工程2节基因工程的操作程序2课时目的基因的导入和检测
第2课时目的基因的导入和检测[目标导读] 1.结合教材P77～81图文，阐明目的基因的导入的四种方法。
2.分析教材P81～83内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。
[重难点击] 1.目的基因的导入方法。
2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、目的基因的导入1．花粉管通道法(如图)(1)概念：是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。
常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。
(2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序①原理：授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。
②操作过程a．提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01%的溶液。
b．用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。
c．第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
园艺植物遗传转化载体的构建
03
终止子是位于目的基因 下游的一段DNA序列， 能够终止目的基因的转
录。
在园艺植物遗传转化中， 常用的终止子有
CaMV35S终止子和花椰 菜花叶病毒（CaMV）
35S终止子等。
终止子的选择对于目的 基因的表达水平和转录
效率具有重要影响。
复制子
01
复制子是用于在转化细胞中复制目的基因的元件， 通常来源于病毒或质粒。
02
在园艺植物遗传转化中，常用的复制子有来自SV40 的复制子和来自pBR322质粒的复制子等。
03
复制子的选择对于目的基因的拷贝数和表达水平具 有重要影响，同时也应考虑安全性因素。
03
园艺植物遗传转化载体的构建方法
质粒DNA的制备
提取质粒DNA
从宿主细胞中提取质粒DNA是构 建转化载体的第一步，常用的方 法有碱裂解法、煮沸法和高盐沉 淀法等。
纯化质粒DNA
提取的质粒DNA需要进行纯化， 去除杂质和核酸酶，以保证后续 酶切和连接的顺利进行。
检测质粒DNA质
量
通过电泳和紫外分光光度计等方 法检测质粒DNA的质量，确保其 纯度和浓度满足后续实验要求。
限制性酶切和连接
选择限制性内切酶
01
根据目的基因和载体的大小选择合适的限制性内切酶，以确保
酶切位点的准确性和后续连接的效率。
限制性酶切
02
将质粒DNA和目的基因分别进行限制性酶切，获得具有相同黏
性末端的片段。
连接反应
03
将酶切后的目的基因和载体进行连接，形成转化子。连接反应
的条件和时间对转化效率有重要影响。
转化子的筛选与鉴定
转化子筛选
将连接产物转化到受体细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定等方法 筛选阳性转化子。
基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤
巩固练习
1为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱 节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其 水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理 是 A．基因重组 B．基因突变 C．基因复制 D．基因分离点点生物学教学Fra bibliotek巩固练习
2利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是 否成功，最好检测 A．是否有抗生素产生 B．是否有目的基因表达 C．是否有抗虫的性状出现 D．是否能分离到目的基因
等⑤mRNA⑥核糖体
A、①②③④
B、②③④⑤
C、①③
④⑤ D、①②③⑥
点点生物学教学
巩固练习
6 获取目的基因的方法有多种，下列不属于含目的基因生物细胞中获取 D、利用PCR技术获取
点点生物学教学
巩固练习
7 下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的 是（ ）
白基因等。
点点生物学教学
3.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分 析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导 入小麦中,理论上讲你应该怎样做? ①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都 可以侵染单子叶植物； ②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使 农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌 的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA 上。
点点生物学教学
寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如
果这么做，结果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中 的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物， 没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气， 也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严 格来讲不算基因工程。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验十目的基因的遗传转化一、目的基因的表达载体构建1. 实验目的本实验以强化植物基因工程平台技能训练为目的，涵盖PCR分离克隆全长目的基因、Gateway 技术构建目的基因的表达载体、农杆菌介导目的基因的转化、转基因植株的驯化和移栽等系列实验。
此外，还就如何利用新型的反向遗传学技术RNAi（RNA interfere，RNA 干涉）进行基因功能研究进行试验指导。
为从事相关领域的科学研究奠定基础。
通过本实验，要求学生理解和掌握Gateway 技术构建目的基因的表达载体的基本原理和具体实验步骤。
2. 实验原理利用高保真聚合酶，采用PCR方法在克隆基因两侧引入attB重组位点，然后将含有attB 位点的PCR产物与含有attp位点和Gateway BP Clonase混合，之后转化E. coli。
在两对att 位点之间的位点特异性重组过程中产生一个融合载体，融合载体随即分解成两个分子，重组位点在结构上重新分配，目标基因进入新的载体骨架，通过筛选阳性克隆，获得此重组产物，称为“entry克隆”。
在得到的entry克隆中目标基因位于att重组位点之间。
将此重组产物与选定的Gateway载体和Gateway LR Clonase酶混合，在entry克隆中的attL位点间的序列取代表达（目标）载体的attR位点之间的序列即目标基因进入表达载体，形成表达（目标）克隆（图）。
Gateway技术构建植物表达载体原理3. 仪器设备微量取液器、制冰机、微型离心机、PCR仪、凝胶成像系统、毛细管自动测序仪、电子天平、高速冷冻离心机、振荡器、恒温金属浴、干燥箱、紫外分光光度计、电泳仪、-80 ℃冰箱、-20 ℃冰箱等。
4. 实验试剂克隆全长基因，pDONR TM221 载体（Invitrogen，12535-019），目标载体（购自Invitrogen，类型可选）。
（1）核酸和质粒提取试剂，测序试剂，T-vector，DNA片段回收试剂盒，Taq聚合酶，反转录试剂盒，DNA marker，氨苄青霉素，X-gal，IPTG等试剂的配方和购买公司见模块一中相应章节。
（2）BP Clonase TM Enzyme Mix（11789-013）*12、LR Clonase TM Enzyme Mix*13（11791-019）均购自Invirtrogen公司。
5. 实验方法克隆含有B序列的目标基因：（1）设计B序列引物，用于扩增带有B序列接头全长基因。
（2）利用上面第一组引物，进行PCR反应。
（3）以在全长基因上加入一半B序列的扩增产物为模板，进行第二次PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测。
（4）纯化含有B序列PCR产物（磁珠回收纯化法）。
（5）克隆产物与Ｔ载体的连接。
连接产物的转化。
（6）阳性克隆的筛选及质粒提取。
（7）DNA序列测定。
BP反应：（1）BP反应的目的在于将含有线性attB表达克隆或attB接头的PCR产物克隆到含有attP 的donor载体上以产生entry克隆。
attB-PCR 产物或线性attB表达克隆0.5 µLpDONR221 1 µL5ХBP Clonase TM Reaction Buffer 4 µLTE Buffer（pH 8.0）10 µLBP ClonaseTM enzyme mix 4 µLTotal 20 µL25 ℃温育16 hr，之后向体系中加入2 µL蛋白酶K溶液，37 ℃温育10 min，以终止BP反应。
（2）BP反应产物的转化。
（3）阳性克隆的鉴定。
LP反应：（1）LR反应的目的在于将已经重组入entry载体的目标基因再克隆到表达（目标）载体，以产生表达（目标）克隆。
表达（目标）载体1µL Entry clone （100-300 ng ）1 µL5ХLR Clonase TM Reaction Buffer 4 µL TE Buffer （pH 8.0） 10 µL LR Clonase TM enzyme mix 4 µL Total20 µL25 ℃温育16 hr ，之后向体系中加入2 µL 蛋白酶K 溶液，37 ℃温育10 min ，以终止LR 反应。
（2）LR 反应产物的转化。
（3）对阳性克隆可采用PCR 和酶切结合进行鉴定。
EcoRV 酶切后电泳见左下图。
重组质粒图谱见右下图。
6. 注意事项attB 上下游PCR 引物的设计在遵循引物设计原则的基础上，还必须满足以下条件： （1）5’末端具有4个G 残基。
（2）4个G 残基与25 bp 的AttB 1位点相连。
（3）至少有18-25 bp 的特异基因序列或模板序列。
（4）attB 上游引物位点末端连有T 残基。
（5）如果需要PCR 产物与N 末端标签框架结合，引物必须包括另外两个碱基，使得在AttB 1区域保持正确的读码框。
这两个碱基不能是GA 、AA 或AG ，以防形成终止密码子。
（6）对于下游引物而言，如果需要PCR 产物与C 末端标签框架结合，引物必须包括另外一个碱基，使attB2区域保持正确的读码框。
同时，任何存在于attB2位点和目的基因之间的 终止密码子必须被去除。
如果不需要PCR 产物与C 末端标签框架结合，则克隆基因或引 物必须包含终止密码子。
7. 作业（1）Gateway 技术原理是什么？2000bp1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp816bpM DREB1A酶切电泳图pH2GW7-DREB1A 重组质粒图谱（2）载体上具备ccdB 基因的意义是什么？二、愈伤组织的遗传转化及转基因植株的检测 1. 实验目的掌握诱导水稻胚性愈伤组织方法；掌握农杆菌介导的遗传转化及转基因植株检测的原理及实验步骤。
2. 实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阳性菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
当农杆菌通过植物伤口进入细胞后，可将农杆菌细胞中的一段T-DNA 插入到植物基因组中，是一种天然的植物遗传转化体系。
将目的基因插入到经过改造的T-DNA 区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物基因组的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术再生出转基因植株。
近年来，农杆菌介导法广泛地应用在一些单子叶植物（尤其是水稻）的遗传转化中。
3. 仪器设备机械脱壳机，50 mL 无菌试管（若干），灭菌培养皿，灭菌烧杯（若干），灭菌滤纸，灭菌镊子。
灭菌滤纸、烧杯、镊子、吸水纸、无菌三角瓶、培养皿。
4. 实验试剂（1）1.5 % 次氯酸钠消毒液。
（2）70 % 酒精，无菌水，蔗糖。
水稻愈伤组织遗传转化流程图2-3周种子(2N6)农杆菌(AB ) OD 600=0.15-0.2愈伤组织前培养(2N6)（3）N6 Basal Salt mixture ：（4）2,4-D （2,4-dichlorohenoxyacetic acid ），琼脂糖（Agarose type Ⅰ；sigma, A-6013）。
（5）琼脂糖。
（6）潮霉素（Hygromycin ）溶液 （50 mg/mL ）。
（7）乙酰丁香酮（AS ）溶液。
（8）农杆菌培养（AB ）母液。
（9）农杆菌悬浮液（AAI ）母液。
5. 实验方法（1）诱导愈伤组织。
（2）培养农杆菌。
用接菌环从农杆菌（PIG121）原液中蘸取少许菌液，在AB 培养基上划线。
28 ℃黑暗培养2-3 d 。
配置AAI 培养基，调pH 至5.2。
分装，每管100 mL ，高压灭菌，使用前加入10 µL/100 mL AS （乙酰丁香酮）。
在无菌的试管中加入25 mL 含有AS 的AAI 培养基，收集步骤3中的农杆菌（用药匙刮取平板上的农杆菌），混匀，25 ℃黑暗条件下振荡培养2-3 hr 。
测OD 600值。
用加入AS 的AAI 培养基稀释菌液至OD 600= 0.15-0.2。
（3）侵染和共培养：取500 µL 菌液于1.5 mL 离心管中，4 ℃、4 000 rpm 条件下离心2 min ，弃上清。
用含200 µmol/L AS 的30 mL AAM 侵染液制成悬浮液（菌液OD 600的终浓度为0.01）；挑选一定大小的水稻愈伤组织，放入农杆菌悬浮液中侵染5 min ；取出愈伤组织，置于无菌的滤纸上沥干30-40 min ；将愈伤组织置于共培养培养基（N6-CO ）上，在25 ℃暗培养2.5-3 d 。
（4）选择性培养基的配制：1000 × N6 维生素 1mL Glycine 2 g Nicotine acid 0.5 g Piridoxine HCl 0.5 g Thiamine HCl 1 g 定溶至1 L1000 × N6 维生素 1 mL Cassmino acids 0.3 g Proline 2.8 g 蔗糖 30 g 2,4-D 2 mg 定溶至1 L调pH到5.7，加入4.0 g Gelrite，高压灭菌。
当培养基的温度下降到60 ℃时，加入Carbenicillin（500 mg/L）和Hygromycin（50 mg/L），混匀，倒平板。
（5）抗性愈伤组织的选择：取出愈伤组织，无菌水清洗5-6次，其间需不停地振荡。
再用含500 mg/ L Carbenicillin的无菌水清洗1-2遍。
最后置于无菌滤纸上沥干2 hr。
凉干的愈伤组织转入选择性培养基上进行第一轮选择，30 ℃，3000 Lx光照条件下，培养14 d。
具有抗性的初始愈伤组织继代到选择性培养基上进行第二轮选择，30 ℃，3 000Lx光照条件下培养，直到颗粒状抗性愈伤组织生成为止。
（6）配制再分化培养基（MS）：Kinetin 2.0 mg/LNAA 0.2 mg/LSorbitol 20 g/LSucrose 30 g/L定溶至 1 L定溶至1 L，调pH至5.7，加入4.0 g Gelrite，高压灭菌，当培养基的温度下降到60 ℃时，加入Carbenicillin（300 mg/L）和Hygromycin（40 mg/L），混匀，倒平板。
（7）配制生根培养基（1/2MS）：Sucrose 10 g/LN6 vitamins 5 mL定溶至 1 L调pH至5.7，加入4.0 g Gelrite，高压灭菌，当培养基的温度下降到60 ℃时，加入Carbenicillin（300 mg/L）和Hygromycin（50 mg/L），混匀，倒平板。
（8）抗性愈伤组织的诱导分化：挑取颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，继代到含有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中，用封口膜封好，恒温培养室中分化培养15-30 d。