第二章 目的基因连接及导入.
生物技术制药课后思考题
第一章：绪论思考题1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。
答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。
（具体定义见P1）。
2.生物技术药物的概念及分类。
答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。
2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。
3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。
答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。
4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。
答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。
第二章：基因工程制药思考题1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。
答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
生物技术制药课后思考题
第一章：绪论思考题1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。
答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。
（具体定义见P1）。
2.生物技术药物的概念及分类。
答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。
2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。
3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。
答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。
4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。
答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。
第二章：基因工程制药思考题1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。
答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1。
什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程(Genetic engineering）原称遗传工程.从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素.1。
分离目的基因2。
限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养5。
选择、筛选含目的基因的克隆6。
培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
➢具有合适的筛选标记.➢分子量小，拷贝数多.➢具有安全性。
2。
质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1。
克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4。
穿梭质粒5.探针质粒6。
表达质粒3。
质粒的构建(1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量.一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定.(2)灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker)，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点,使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5)根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
目的基因的连接、转化、涂板培养ppt
感2.受态质细胞粒分的装成质10量0μ和l的小浓份度,暂:且不用用的于贮转存于化-7的0℃质可保粒存D半N年A。应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情
细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时
)p,M并D用T况超M1纯下8水-T,配DV制eNc,At最o溶r好分液装的保0.存体于积干燥不的应冷暗超处。过感受态细胞体积的5％。
转---转入宿主细胞
感受态细胞 感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化
学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成 为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
实验原理 ---CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细 菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时 处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌 膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA 酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作 用促进细胞对DNA的吸收。
当这种载体转入的宿主细胞是含有β-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（称为α互补），产生具有酶活
性的蛋白质（β-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG（强诱导剂）,X-gal（生色底物）的培养基上呈蓝色。
取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.
目的
掌握目的基因的重组连接原理及方法。 理解蓝白斑筛选鉴定的原理 熟悉重组DNA分子转化受体细胞的基本思路
和方法
实验总设计
分---PCR分离目的基因 切 接---目的基因与载体相连 转---转入宿主细胞 筛---筛选阳性重组体
接---目的基因与载体相连
高中生物必修2《遗传与进化》重要知识点汇总
高中生物必修2《遗传与进化》重要知识点汇总第一章遗传因的发现1、相对性状：一种生物的同一种性状的不同表现类型。
控制相对性状的基因，叫做等位基因。
2、性状分离：在杂种后代中，同时出现显性性状和隐性性状的现象。
3、假说-演绎法：观察现象、提出问题→分析问题、提出假说→设计实验、验证假说→分析结果、得出结论。
测交：F1与隐性纯合子杂交。
4、分离定律的实质是：在减数分裂后期随同源染色体的分离，等位基因分开，分别进入两个不同的配子中。
5、自由组合定律的实质是：在减数分裂后期同源染色体上的等位基因分离，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
6、表现型指生物个体表现出来的性状；与表现型有关的基因组成叫做基因型。
第二章基因和染色体的关系1、减数分裂是进行有性生殖的生物在产生成熟生殖细胞时，进行的染色体数目减半的细胞分裂。
在减数分裂过程中，染色体只复制一次，而细胞分裂两次。
减数分裂的结果是，成熟生殖细胞中的染色体数目比精(卵)原细胞减少了一半。
减数分裂过程中染色体数目的减半发生在减数第一次分裂。
2、一个卵原细胞经过减数分裂，只形成一个卵细胞(一种基因型)。
一个精原细胞经过减数分裂，形成四个精子(两种基因型)。
3、对于有性生殖的生物来说，减数分裂和受精作用对于维持每种生物前后代体细胞染色体数目的恒定，对于生物的遗传和变异，都是十分重要的。
4、同源染色体：配对的两条染色体，形状和大小一般都相同，一条来自父方，一条来母方。
同源染色体两两配对的现象叫做联会。
联会后的每对同源染色体含有四条染色单体，叫做四分体，四分体中的非姐妹染色单体之间经常发生交叉互换。
5、减数第一次分裂与减数第二次分裂之间通常没有间期，或者间期时间很短。
6、男性红绿色盲基因只能从母亲那里传来，以后只能传给女儿，叫交叉遗传。
7、性别决定的类型有XY型（雄性：XY，雌性：XX）和ZW型（雄性：ZZ，雌性：ZW）。
第三章基因的本质1、艾弗里通过体外转化实验证明了DNA是遗传物质。
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工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA 分 子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。
几种重要的工具酶
限制性核酸内切酶
活性
识别特异碱基序列，切割DNA
DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转录酶 碱性磷酸酶3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键
T-A克隆
• T-vector两条链的5’端含有一个游离的T
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A
随堂闯关
1.用一定的_________ 限制酶 切割 质粒，使其出现一个切 黏性末端 口，露出____________ 。
同一种限制酶 切断目 2.用_____________ 相同 的基因，使其产生_____ 的黏性末端 ____________。 切口 处， 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ，形成了一个重组 再加入适量___________ DNA分子（重组质粒）
基因工程之
第五节 目的基因与载体连接
二、 目的基因与载体的连接（接）
质粒 同一种 限制酶 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA分子
DNA 连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。
（主要有以下4种连接方式）
1)
粘性末端连接
2） 平头末端连接
⑵ 双向插入 经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因 和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反 应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表 达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连 接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达 为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目 的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转 录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不 能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选 用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体 的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆。(YL)
（2） 同聚物加尾法
5’特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平末端， 移去几个末端核苷酸。运用末端核苷酰转移酶，
能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加 到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基因上,它并 不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸, 构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷 酸。在载体中加入dTTP和末端核苷酸转移酶，在载
质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和 防止自我环化和提高连接效率？
目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如 EcoRI）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 ⑴ 高背景 载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自 我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克 隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体 的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的 5’-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中, 具有5’-P的目 的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性 末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有 两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低 于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。
体3’－OH末端延伸形成单链PolyT尾巴。将两者混合 发生互补连接，缺口用DNA连接酶封闭。
3）用化学合成的衔接物连接 DNA分子用化学合成法合成一段10－12个核苷 酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸 化后，通过T4DNA连接酶，将片段分别于载体5’ 端和目的基因片段5’连接起来。用相应的限制性 内切酶处理，产生互补的粘性末端。 4）T-A克隆法： TagDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时，还能 不依赖模版在产物3’末端加上两个游离的A。只 要载体切口除人工加上的游离T，PCR产物即可于 载体连接。
以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA 切除5－末端磷酸 催化核酸5'-羟基磷酸化
催化3'-端合成同聚尾
DNA连接酶
DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在 一起的3‘-OH 末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使 末端连接。
E. coli DNA 连接酶 只能催化互补粘性 末端之间的连接
T4 DNA 连接酶 催化互补粘性末端和 平末端之间的连接， 但平末端之间连接的 效率比较低 。
（一） 粘性末端连接
将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘
性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组
DNA分子。 质粒 目的基因 用同一种或两种 限制性内切酶酶切
DNA连接酶
本法适用于在质粒和 目的基因上有相同单 或双酶切位点
用接头连接
目的基因 质粒
+
+
接头(linker)
DNA连接酶 用同一种 限制性内切酶酶切
DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！
（ 四 ） 同 源 多 聚 尾 连 接 法
尾接法
质粒
内切酶 末端转移酶 +dGTP
目的基因
末端转移酶 +dCTP
DNA连接酶
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点
基因与载体的平末端连接方法有哪些？
(1)T4DNA连接酶法 连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4D NA连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给 平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶 进行连接。T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接 酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P 末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度 酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末 端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。
重组质粒
（二）平头末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此 时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。
质粒
产生平末端的 内切酶
核酸酶S1 目的基因
DNA连接 酶 重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！
（三） 人工接头法
合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割, 产生粘性末端→连接，构建重组DNA。