第四章 病毒的遗传和变异

第四章病毒的遗传与变异

1、遗传：亲代与子代相似

2、变异：亲代与子代或者子代不同个体之间不完全相同。

遗传决定了物种的延续，变异有利于物种的进化。

核酸传递遗传信息的基础在于其碱基的排列顺序，病毒核酸复制时能够产生完全等同于原核酸的新的核酸分子，从而保持遗传的稳定性。

病毒的突变机率较高，决定了病毒遗传的变异性。

遗传和变异是对立的统一体，遗传使物种得以延续，变异则使物种不断进化。

流感病毒的抗原性会因为核酸的复制、装配等各种因素而发生变化，有了这些变化，流感病毒就可以有效地逃避宿主的免疫清除。

第一节病毒的突变

病毒的突变(Mutation)：基因组中核酸的组成或结构发生改变。

点突变（狭义突变）:少数几对碱基的缺失、插入或置换。

大段染色体的缺失、重复、移位和倒位等较大范围内可遗传结构的改变（广义突变）。

突变体：携带突变的生物个体或群体、株系。

突变基因：包含突变位点的基因。

基本概念

病毒株(strain)：同一种病毒的不同分离株或不同来源的病毒系

病毒型别(type)：同种病毒的不同血清型别

病毒野生型( Wildtype): 从自然宿主中新分离出的, 或者是实验室采用的

病毒突变体(mutant)：与野生病毒株的不同表型的变异株,已清楚其机理

病毒变异体(variant)：与野生病毒株的不同表型的变异株, 并不清楚其机理

病毒准株(quasispecies):在一个宿主体内，子代病毒出现了与原始感染株不一致，该变异个体称为病毒准株。

第二节自发突变和诱发突变

病毒变异除自发、诱发突变外，还可能因混合感染引起的遗传重组。

病毒的变异主要源于其基因组的突变和重组。

1.自发突变：在无任何已知诱变剂的条件下产生的突变。

DNA病毒和RNA病毒的自发突变有明显区别:

DNA：有一整套完整的DNA复制、核对、修正系统

RNA：不能自动修复（RNA复制酶中缺少校正阅读活性）病毒复制比自发突变快得多，野生型种群处统治地位

突变效率：DNA 10-8～10-11

RNA 10-3～10-6

2.诱发突变：野生型病毒在各种理化因子存在的条件下提高突变力的措施(适当的剂量、获得单一突变的突变体)

根据诱发突变的本质和途径分为：

①体外诱变剂(静态)

通过一些化学物质对核苷酸进行化学修饰→碱基配对发生改变→（a.转换 b.颠换）亚硝酸、羟胺、烷化剂等

②体内诱变剂(动态)

a.碱基类似物：通过互变异构效应造成碱基的转换和颠换

b.插入剂：吖啶类染料插入到核酸分子之间，引起碱基堆积畸变，在下一步复制时造成核酸移码（碱基增加或缺失）→移码突变

这两种物质所引起的核酸的变异，都需要病毒细胞处于代谢活性状态，此时核酸处于复制阶段，对处于静止状态的病毒无作用。

③紫外线：对生物体的损害主要是形成嘧啶二聚体

↗链间形成的嘧啶二聚体能破坏双链的拆分

↘链内形成的嘧啶二聚体导致碱基配对的错误

DNA：嘧啶二聚体被切除、修复，但碱基配对时错误结合发生突变；

RNA：UV诱变的机制不明。

第三节病毒突变体的类型

根据突变效应分为：同义突变、错义突变、无义突变和移码突变。

原序列5′-AUG CCU UCA AGA UGU GGG

Met Pro Ser Arg Cys Gly

（1）同义突变5′- AUG CCU UCA AGA UGU GGA

Met Pro Ser Arg Cys Gly

（2）错义突变5′- AUG CCU UCA GGA UGU GGA（又称为误义突变）

Met Pro Ser Gly Cys Gly

（3）无义突变5′- AUG CCU UCA AGA UGA GGA

Met Pro Ser Arg

（4）移码突变5′-AUG CCU UCA AGU GUG GG

Met Pro Ser Ser Val

Gly：甘氨酸。Arg：精氨酸。Ser：苏氨酸。Val：缬氨酸

根据突变效应背离或返回到野生型方向上来讲：

①正向突变：改变了野生型性状的突变

②回复突变

根据突变引起的遗传信息的意义改变：

①同义突变（氨基酸序列没变）

②错义突变（氨基酸序列改变）沉默突变

↗渗漏突变

↘中性突变

③无义突变（氨基酸密码子变为终止密码子）

根据突变所带来的表型分：

①形态突变体（宿主细胞形态改变）

②致死突变体（流产感染）

③条件致死突变体（温度敏感突变体←错义突变）

④生化突变体（营养缺陷型突变体、抗药性突变体、抗原突变体）：代谢途径变异

第四节病毒变异现象

4.1毒力变异:

“毒力”表示毒株或毒型间病原性的差异，具体表现为所能感染的动物、组织和细胞范围及其引起的症状、死亡率和病变的程度不同。分为强毒株和弱毒株，后者可制成弱毒活病毒疫苗（脊髓灰质炎疫苗）、由异种动物引用过来的毒株（牛痘病毒等）。

4.2抗原变异：病毒变异表现为表面抗原的变异。

如：流感病毒(血凝素和神经胺酸酶的变异)

通常所谓的病毒“型”，实质上是病毒抗原性差别的表现。它们主要是用补体结合反应、沉淀反应、红细胞凝集抑制反应以及中和试验等血清学方法鉴别出来的；

病毒各个型之间往往不能相互免疫，或者缺乏足够的交叉保护力。如：流感病毒、口蹄疫病毒

4.3培养性状的变异

病毒的所谓“培养性状”，主要是指其在培养细胞上形成的蚀斑的形态和性质(病毒引起的细胞病变的特征)

(1)蚀斑的大小：决定于病毒的弥散和吸附率以及病毒复制、成熟、释放的速度和在细胞内外的死亡率等。

蚀斑大小的变异与病毒对乙醚的敏感性之间存在着一定联系。对乙醚不敏感的病毒比对乙醚敏感的病毒更易发生此类变异。

蚀斑大小与病毒的毒力呈现一定的平行关系。(相对的)

(2)蚀斑的色泽：主要决定于蚀斑及其周缘的细胞的死亡与溶崩情况。（透明、混浊、有色）

(3)蚀斑的形状：与病毒的弥散率及其导致的细胞病变率有关（圆或不规则、边缘清晰或弥散）

蚀斑性状的改变，常被视作病毒变异的一个重要指标，而蚀斑选种就成为挑选病毒变异株的一个重要方法。

某些可能是暂时的、非遗传的蚀斑变异。

4.4对温度的感受性变异

应用适当的加热处理或低温培育的方法，常可由原毒株中分离获得耐热株。

温度敏感性突变株（即ts-变异株）：

ts-变异株可自然发生，几乎可从所有动物病毒中分离获得（只能在允许温度而不能在非允许温度中增殖）

4.5对化学药剂的感受性变异

将盐酸胍、5’溴脱氧尿核苷、盐酸金刚烷胺等病毒灭活剂或诱变剂添加于已经接种病毒的细胞培养物内，多次反复继代后，常可分离出抗甚至依赖该药剂的变异株。

在培养脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞的培养液内加入盐酸胍，获得了耐药性毒株。

应用类似方法甚至选育得到一株依赖胍的脊髓灰质炎病毒变异株，这类变异株不再能在无胍的细胞培养物内增殖。

病毒化疗药物增多，耐药现象需给予充分注意和研究解决

4.6营养变异：指病毒对某种营养物质的反应发生变异。

脊髓灰质炎病毒在猴肾细胞内增殖时，必须有胱氨酸存在才能形成蚀斑。应用培养液内不含胱氨酸的细胞培养这种病毒，迅速选育得到不需胱氨酸甚至可被胱氨酸抑制的变异株.

人们曾应用在培养液内添加色氨酸的方法，选育获得一株依赖色氨酸的脊髓灰质炎病毒变异株。

4.7重组现象

指两个不同性状的病毒株在混合感染时，由于基因组某个或某些片段的交换，形成新的基因组合而出现“杂交”性状的子代病毒。

同种病毒的不同毒株之间容易发生重组，但重组也可发生于不同种和不同群病毒之间。

交叉复活作用(cross reactivation)活病毒和灭活病毒→广义重组

多数感染复活作用(multplicity reactivation)灭活病毒↗

4.8互补现象(complementation)

同种(株)或异种(株)许多病毒粒子在混合感染同一细胞时，可能发生干扰现象，即一种(株)病毒的增殖抑制或干扰另一种(株)病毒的增殖。或一种(株)病毒的增殖促进另一种(株)病毒的增殖，甚至为另一种(株)病毒增殖所必需。

4.9表型混合

混合感染时由一种病毒的核酸与另一种或另一株病毒的衣壳(和囊膜)组合而成的病毒粒子，这一现象称为衣壳交换。

表型混合病毒的遗传性能与提供核酸的病毒相同，而其抗原特性以及对细胞的吸附特性等，则与提供衣壳(和囊膜)的病毒相同。

由于只是基因产物——蛋白质的混合或置换，所以表型混合的性状也只是暂时的，不能遗传给子代病毒。

病毒的突变率

病毒突变率在10-5～10-8之间（即每10万至1亿次复制过程中发生一次突变）。

决定病毒突变率的主要因素为复制酶的保真性，DNA聚合酶的编辑功能可切除错配的碱基，错配率为10-8～10-11，而RNA复制酶的错配率为10-3～10-6。RNA复制酶的低保真性决定了RNA病毒没有固定序列的基因组，而是相关基因组构成的异质性群体（准种，quasispecies）。

如：HIV的突变率可达到10-3～10-4，它的基因组长约9.7Kb，因此，每一次复制基因组拷贝中就有0.97～9.7处发生突变。

第五节病毒突变体

5.1无效突变株：完全丧失基因功能的突变体。

5.2条件致死突变株：在实验者所规定的某些条件下不能繁殖，但在允许条件下能够繁殖的病毒突变株。其中最主要的是：温度敏感条件致死突变株（Temperature-sensitive conditional lethalmutant），简称温度敏感突变株（ts株）。

相应的野生型在这两种条件下都能繁殖。其中比较有用的是温敏突变体，在较低温度下繁殖，但在较高温度下不能繁殖，而相应的野生型在这两种温度都能繁殖的突变体。研究表明：温敏突变是一种误义突变，即错义突变。

5.3蚀斑或痘斑突变株：又称为培养性状的变异主要是指其在培养细胞上形成蚀斑的形态和性质，实际上是病毒所引起的细胞病变的特征，包括蚀斑的大小、蚀斑的色泽（蚀斑是透明的还是混浊的，是有色的，还是无色的）、蚀斑的形状（蚀斑是圆的还是不规则的）。

5.4宿主范围突变株：与野生型相比，宿主范围有所改变。

比较有用的是适应新宿主的突变体，其意义是：①可通过在原宿主体内传代获得弱毒株以制备疫苗。②利用细胞代替原宿主实验动物进行病毒培养的研究。特点：对原宿主毒力减弱，对新宿主的毒力逐渐增强

5.5抗药性突变株：可提抗抗病毒药物如金刚烷胺等。

5.6抗原性突变株：突变后的病毒在抗原性上与野生型表现出差别。如流感病毒的变异，具体表现为表面抗原(血凝素HA和神经氨酸酶NA)的变异，它存在两种变化形式：抗原漂移和抗原转移。

（1）抗原漂移：是指病毒在自然宿主内频繁传代后，所出现的抗原性微小变化。一般认为这是在免疫反应的压力下，突变体选择的结果。

（2）抗原转移：是指病毒抗原性突发的巨大变化。一般推测这是基因重组的结果；也有认为这是由于量变的积累而导致质变的发生。

5.7回复突变株：突变株发生二次突变或者通过基因重组又恢复为野生性的基因型。

5.8冷适应突变株：能在比野生型通常的复制温度或复制的最适温度要低的温度下进行复制的突变体。通过病毒长期低温传代培养获得。

5.9毒力突变株：毒力增强或者减弱。

5.10营养突变株：是指病毒对某种营养物质反应的变异。如一种病毒必须胱氨酸的存在才能形成蚀斑，当他们采用培养液中不含胱氨酸的细胞培养这种病毒时，可以选育得到不需胱氨酸甚至可被胱氨酸抑制的变异株。

5.11同变体（共变体）：多种表型同时改变的突变株。

病毒的如何保持病毒遗传性状的稳定：

①采用分离纯化的病毒克隆：挑取单个噬菌斑获得较纯的病毒粒子；

②将已纯化的病毒粒子保存在严格的条件下；

③尽量地减少传代的次数。

第六节病毒的基因重组

当两种或多种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为基因重组（Genetic recombination）。

5.1动物病毒的基因重组

特征：

具分段基因组的RNA病毒：在不同毒株间的混合感染时，重组的频率非常高，有时甚至达到50%。

具单组分基因组的病毒：大分子物质积聚在前体池中，一定浓度下进行装配过程中往往是随即分配，因此重组频率较低，多组分的频率较高。

逆转录病毒：是一种非常特殊的病毒，只有它是二倍体，在病毒混合感染中，重组频率特别高。

5.2植物病毒的基因重组

植物病毒混合感染：

除具有分段基因组的植物病毒与上述感染特征相似外，其他的植物病毒表现出不同的特征：

①感染过程中存在相互干扰现象；

②突变与重组难以区分：由于植物病毒都很少发生基因重组，频率低，很难判断。

5.3病毒的复活

①活病毒间的重组：流感病毒两个亚型之间可发生基因重组，产生新的杂交株，即具有一个亲代的血凝素和另一亲代的神经氨酸酶。

流感每隔一、二十年会引起一次世界性大流行，可能是由于人的流感病毒与某些动物（鸡、马、猪）的流感病毒间发生基因重组所致。

②灭活病毒间的重组（复感染复活）

用紫外线灭活的两株同种病毒，若一同培养后，常可使灭活的病毒复活，产生出感染性病毒体，称为复感染复活（Multiplicity reactivation）。

这是因为两种病毒核酸上受损害的基因部位不同，由于重组合相互弥补而得到复活。因此现今不用紫外线灭活病毒制造疫苗，以防病毒复活的危险。

③死活病毒间的重组（交叉复活）：

一株活性病毒与另一株具有不同遗传标记的灭活病毒复合感染细胞，由于重组产生具有灭活病毒某些遗传标记的活性病毒体，这类病毒复活现象称为交叉复活(Cross reactivation) 如：鸡胚中甲型流感病毒疫苗的选育

灭活甲型流感病毒（A0或A1亚型）疫苗株

亚洲甲型（A2亚型）活流感病毒

→→共培养，可产生具有前者特点的A2型流感病毒

第七节影响病毒表型的病毒间相互作用

7.1表型混杂（Phenotype mixing）：两种病毒混合感染后，一个病毒的基因组偶尔装入另一病毒的衣壳内，或装入两个病毒成分构成的衣壳内，发生表型混合。这种混合是不稳定的，传代后可恢复其原来的特性。

7.2基因型混合（Genotype mixing）：指两种病毒的核酸偶尔混合装在同一病毒衣壳内，或两种病毒的核衣壳偶尔包在一个囊膜内，但它们的核酸都未重新组合，所以没有遗传性。

7.3互补（Complementation）：指两种病毒通过其产生的蛋白质产物（如酶、衣壳或囊膜）相互间补助不足。如辅助病毒与缺损病毒间、两个缺损病毒间、活病毒与死病毒间都可以互补，互补后仍产生原来病毒的子代。

7.4增强（Enhancement）：指两种病毒混合培养时，一种病毒能促进增强另一种病毒的产量，可能是因为前者压制了产生干扰素所致。

7.5病毒间干扰（Interference）：同源干扰（homologous interference）发生在细胞中，仅在同源病毒或亲缘关系密切的病毒之间发生。（缺陷干扰病毒DI）

7.6缺陷病毒：其基因组在一个或多个病毒自我复制必需基因上缺乏功能，它的复制要求其他病毒基因组提供辅助活性。

整合缺陷基因组（Intergrated defective genomes）(整合病毒)

卫星病毒（Satellite virus）AVV、丁型肝炎病毒

依赖辅助因子的缺陷干扰病毒（Helper-dependent defective interfering virus，DI）缺陷性、干扰性、富集性

第八节病毒基因图的构建方法

第九节病毒变异的实际意义

9.1研制减毒活疫苗

ts株的研制: 由于在非特定温度下，突变基因所编码的蛋白缺乏其应有功能，因此大多数ts株同时又是减毒株。选择遗传稳定性良好的品系用于制备碱毒活疫苗。如：流感病毒和脊髓灰质炎病毒ts 株疫苗；

宿主适应性突变株的研制: 如狂犬病毒突变株适应在兔脑内增殖，由“街毒”变为“固定毒”，制成疫苗。

9.2应用于基因工程（Genetic engineering）目前病毒基因工程正沿着二个方向发展：

一是将编码病毒表面抗原的基因移植到质粒中去，在大肠杆菌中产生大量表面抗原物质，以制备疫苗或诊断用抗原。如：HBV编码表面抗原的DNA片段在酵母菌中表达；

二是探索病毒作为基因工程载体的可能性，以便将所需要的外源基因带入人体或生物体内，以治疗人类遗传疾病或创造动物新品种的目的。如：重组人p53腺病毒