蛋白组分测定
傅里叶红外光谱仪测蛋白质
傅里叶红外光谱仪测蛋白质傅里叶红外光谱仪是一种常规的蛋白质分析工具，广泛应用于不同领域的研究中，如生物医学、生命科学和化学等。
该技术通过测量分子的红外吸收光谱来确定样品中的官能团。
在本文中，我们将详细介绍傅里叶红外光谱仪测量蛋白质的原理、方法、注意事项和数据分析。
一、原理红外光谱技术基于分子的振动吸收特性，是检测蛋白质构象和结构的重要手段之一。
蛋白质中的氨基酸残基的主链振动和侧链振动吸收红外辐射，进而反映出样品的官能团特征。
主链振动位于1650-1550cm^-1，侧链振动位于1550-600cm^-1。
通过测量这些振动能量的减少，可以确定蛋白质中的官能团类型和数量，进而推断出它的结构。
二、方法1. 样品制备蛋白质的样品制备对傅立叶红外光谱仪测量结果的准确性至关重要。
在进行测量前需要对样品的制备进行严格控制。
需要纯化和浓缩蛋白质样品。
将浓缩的样品溶解在合适的缓冲液并充分混合。
通过紫外吸收测定蛋白质的浓度，确保在红外光谱测量期间样品中的成分保持一致。
2. 样品测量在进行傅里叶红外光谱仪测量之前，需要将样品溶液置于红外吸收样品池并使其干燥。
然后使用红外光谱仪扫描吸收光谱范围（4000-400 cm^-1），并记录样品的红外光谱。
三、注意事项1. 液态样品需要建立基线；2. 液态和固态样品的取样方式、时间要求不同；3. 确保样品处于充分干燥状态，否则会影响热胀缩系数的测量精度。
四、数据分析傅里叶红外光谱仪得到的红外光谱是一个复杂的图谱，需要进行数据处理和分析才能得出有用的结论。
在进行数据分析前，首先需要建立一个有用的基线和峰度校正。
可以通过比较样品与标准样品的红外光谱，确定蛋白质样品中的官能团组成和数量。
通过结合其他分析手段（如X射线晶体学、NMR等）来推断蛋白质的构象和三维结构。
傅立叶红外光谱仪是一种非常有用的蛋白质分析工具，可以用于检测蛋白质样品中不同官能团的振动吸收特性。
通过合理的样品制备、测量方法和数据分析，可以得到有价值的蛋白质结构信息，进而推断蛋白质功能。
植物蛋白质的提取和含量测定(“含量”相关文档)共8张
四、实验试剂
1.大豆干粉 2. 0.2%NaOH 3. 丙酮 （预冷） 4. 6M HCl，1M HCl 5 标准 BSA（0.5 mg/ml） 6. Folin—酚试剂甲（用前组分一: 组分二 = 50:1） （1） 1克 Na2CO3和0.2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。 （2） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解100毫升 1%酒石酸钾钠 （ KNaC4H4O6•4H量测定
1. 制作标准曲线
按照下表操作，以A500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。
2. 测定提取第2步稀释后样品的蛋白浓度 按上表中样品列操作，根据A500nm查找含量，并计算原始浓度。
（先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min，于4000r/min离心7min ,小心留取上清液，弃脂层和沉淀
，如上清得液到有漂白浮色物粉，再末经状过滤的；大豆蛋白粉，用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，
待整个实验结束后，再称重并计算产率（即3克大豆干粉中蛋白含量）。
按照下表操作，以A500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。 测定提取第2步稀释后样品的蛋白浓度 2%NaOH 30毫升。 留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步） 留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步） 留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步） 植物蛋白质的提取和含量测定 植物蛋白质的提取和含量测定 2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。 2克 NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。 （1） 1克 Na2CO3和0. 5 标准 BSA（0. 6M HCl，1M HCl 5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解100毫升 1%酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6•4H2O）中。 量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L的HCl调pH至，再用1mol/L的HCl小心调pH至，于4000r/min离心15min，(留取沉淀物)， 并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。
蛋白质谱结果解读
蛋白质谱结果解读蛋白质谱技术被广泛应用于生命科学研究中，可以用于鉴定和定量蛋白质以及分析蛋白质修饰等。
但是，对于非专业的用户来说，解读蛋白质谱结果可能会存在一定的困难。
本文将介绍蛋白质谱结果解读的几个关键步骤，帮助用户更好地理解和应用蛋白质质谱技术。
一、蛋白质质谱结果基本组成蛋白质谱结果通常包括三个部分：谱图、谱表和数据库比对结果。
1. 谱图谱图是蛋白质质谱分析中最常见的结果之一，它是指将分离出来的蛋白质样品在质谱仪中产生的峰图。
这些峰代表了不同的蛋白质，而峰的高度和面积则反映了不同蛋白质的数量及在样品中的相对浓度。
根据不同的检测方法，谱图可以分为不同的类型，如二维蛋白质谱图、MALDI-TOF蛋白质谱图、LC-MS/MS蛋白质谱图等。
2. 谱表谱表是对蛋白质谱图的定量分析结果，通常给出每一个峰的质量、电荷数等基本信息，并定量给出每一个蛋白质的含量。
与谱图相比，谱表更多的是一个数值化的结果，是对谱图信息的进一步加工和分析。
3. 数据库比对结果在蛋白质质谱分析中，通常会将实验结果与数据库中已知的蛋白质序列信息进行比对，以实现蛋白质鉴定。
比对结果通常通过以下几个参数来描述鉴定的结果：蛋白质名称或标识符、分子量、酶切位点、修饰信息等。
二、蛋白质质谱结果解读的几个关键步骤1. 对谱图进行初步的数据处理在对谱图进行初步的数据处理之前，需要了解不同的检测方法对样品进行了怎样的处理。
例如，在蛋白质中常常伴随着多种修饰，如磷酸化、乙酰化等，这些修饰对于谱图的解读可能存在一定的影响。
除了修饰信息之外，还需要注意信噪比、基线平滑度等信息的处理。
2. 对谱图进行峰的鉴定和定量在对谱图进行峰的鉴定和定量之前，需要进行质量校准以及校正内外标等工作。
在鉴别和定量峰时，需要关注峰的相对高度、面积、形态，以及电荷数等因素。
对于定量的结果，需要对实验的重复程度、准确性以及可重复性进行评估。
3. 对比对结果进行进一步的鉴定和分析在将实验结果与数据库中已有的蛋白质序列进行比对时，需要注意数据库的选择以及比对算法的优化。
蛋白质的测定方法比较
蛋白质的测定方法比较一、分光光度法1、测定原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。
在波长400 nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。
2、测定步骤：①试样消解：称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g（精确0.001g）、半固体试样0.2g～1g（精确至0.001g）或液体试样1g～5g（精确0.001g），移入干燥的100 mL 或250 mL 定氮瓶中，加入0.1 g硫酸铜、1 g 硫酸钾及5 mL 硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。
缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热半小时。
取下放冷，慢慢加入20 mL 水，放冷后移入50 mL 或100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
按同一方法做试剂空白试验。
②试样溶液的制备：吸取2.00 mL～5.00 mL 试样或试剂空白消化液于50 mL 或100 mL 容量瓶内，加1 滴～2 滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。
③标准曲线的绘制：吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL 氨氮标准使用溶液（相当于0.00μg、5.00μg、10.0μg 、20.0μg、40.0μg、60.0μg、80.0μg 和100.0μg 氮），分别置于10 mL 比色管中。
加4.0 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL 显色剂，加水稀释至刻度，混匀。
牛奶中酪蛋白含量的测定
牛奶中酪蛋白的提取及含量测定一、实验原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%）牛奶中的糖主要是乳糖。
乳糖是一种二糖，它由D-半乳糖分子和D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。
乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。
牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。
酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。
而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。
2、等电点沉淀法：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂来增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。
同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pI偏离了4.7，通常偏酸。
3、酪蛋白的提纯根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙醚洗涤，由于乙醚很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。
4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm。
在一定范围内，考马斯亮蓝G520-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。
SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术学习SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术实验原理SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)：1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。
2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。
此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，其电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验设备与试剂垂直板型电泳槽直流稳压电源微量注射器移液器水浴锅染色槽烧杯试管滴管分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl, pH8.8)：称取Tris 18.15g，加约80ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至8.8，无离子水定容至100ml，4℃保存浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl液, pH6.8)：称取Tris 6g，加约60ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至6.8，无离子水定容至100ml，4℃保存凝胶贮液：称取丙烯酰胺(Acr) 29.2g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，重蒸水定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中并定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%SDS溶液：10g SDS加重蒸水定容至100ml，室温保存(低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)1%TEMED (四甲基二乙胺)10%过硫酸铵(AP)：配制后分装，-20℃保存电泳缓冲液(Tris-Gly缓冲液pH8.3)：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454ml 50%甲醇溶液和46ml冰乙酸即可脱色液：75ml冰乙酸，875ml重蒸水与50ml甲醇混匀实验步骤1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。
实验二_两水相系统中蛋白质分配_
6、选择以下三种操作中正确的吸出上、下相操作方法： (1) 吸管小心插入下相，吸出下相→换吸管，吸出上相。 (2) 吸管小心吸出上相 →插入下相，吸出下相。 (3) 吸管小心吸出上相 将多余上相和少量下相弃去 →换吸管，
2. 标准蛋白溶液-牛血清蛋白溶液配制（已配好） ： 精确称取0.012g左右的牛血清蛋白，加入0.105gNaCl,溶 于少量蒸馏水中，然后，稀释定容至100ml，配成 120g/ml的牛血清蛋白原液。
三. 实验操作
（一）蛋白质在两相中的分配：
1、取1只10ml的刻度离心管，用电子台秤称取硫酸铵1.30g， PEG液体2.00g，用吸管加入已稀释的糖化酶2.0ml，然后 加入蒸馏水，直到总量为8.00g，盖上离心管盖并压实。 用力振摇10min，使硫酸铵完全溶解，并使两相充分混合， 使酶在两相中的分配达到平衡。
求相比 R =V上/V下
求蛋白质分 配系数
K = C上/ C下
三. 实验操作
• （二）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 • 1 . 标准曲线制作方法：见下表 • 2. 两相中总蛋白的测定： • 上相液：吸取1ml，蒸馏水定容至50ml，按下表操作。 • 下相液：上相完全吸掉，并吸掉部分下相，再取样。
表1. 标准曲线和样品的测定
PEG/(NH4)2SO4两水相系统进行分配。
糖化酶为生物大分子蛋白，是黑曲霉经发酵制得的 ,糖化酶
广泛用于酒、醋、味精等发酵工业中起糖化作用，能将淀 粉转化为葡萄糖 。
用考马斯亮兰(CBB G-250)比色法分别测定上下相中总蛋
白的含量。
考马斯亮兰是一种染料，酸性溶液中呈棕红色，与蛋白质
蛋白质分子量测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较梁永达（复旦大学药学院，上海）摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。
该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。
关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法Comparison of the methods of molecular weightdetermination of proteinsLiangYongda(School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai)Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages.Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
氨基酸组分测定
氨基酸组分测定氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，它们通过肽键连接在一起形成多肽链。
测定氨基酸组分可以帮助我们了解蛋白质的组成和结构，对于研究蛋白质功能以及疾病诊断与治疗具有重要意义。
测定氨基酸组分的方法有多种，其中比较常用的是离子交换色谱法和高效液相色谱法。
离子交换色谱法是利用氨基酸带有离子性的特点，通过树脂上的离子交换作用实现氨基酸的分离。
高效液相色谱法则是利用不同氨基酸在移动相和固定相之间的相互作用力的不同，实现氨基酸的分离。
这两种方法都能够实现对氨基酸组分的快速、准确测定。
在氨基酸组分测定中，需要注意的是样品的制备和前处理。
样品制备的方法通常包括酸水解和酶解两种。
酸水解是将蛋白质样品用稀酸处理，使其断裂形成氨基酸。
酶解则是通过加入适当的酶，将蛋白质降解为氨基酸。
选择合适的方法取决于样品的性质和需要测定的氨基酸类型。
测定氨基酸组分的过程中，还需要考虑到一些因素的干扰。
例如，某些氨基酸在酸性条件下会发生伪肽键形成，导致其含量被低估。
此外，样品中其他化合物的存在也可能对测定结果产生影响。
因此，在测定氨基酸组分时，需要进行适当的样品处理和对照实验，以排除这些干扰因素。
测定氨基酸组分的结果可以用于多个领域的研究。
在食品科学中，测定蛋白质中氨基酸的含量和比例可以评估其营养价值和品质。
在医学领域，测定体液中氨基酸的浓度可以用于诊断某些遗传代谢病，如苯丙酮尿症和甲基丙二酸尿症。
此外，氨基酸组分的测定还可以用于研究蛋白质的结构和功能，以及药物设计和合成中的蛋白质工程。
测定氨基酸组分是研究蛋白质的重要手段，可以帮助我们了解蛋白质的组成和结构，为研究蛋白质功能、疾病诊断和治疗提供重要依据。
离子交换色谱法和高效液相色谱法是常用的测定方法，需要注意样品制备和前处理过程中的干扰因素。
测定结果可以应用于食品科学、医学和药物研发等领域，具有广泛的应用前景。
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大麦籽粒蛋白质组分含量测定
根据溶解度分类法，大麦籽粒中的蛋白质可分为四类：水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶蛋白和碱溶性蛋白。
根据其电泳迁移率和氨基酸组成，醇溶蛋白可分为四种，即B 醇溶蛋白、C 醇溶蛋白、D 醇溶蛋白和γ醇溶蛋白。
1．蛋白组分的提取
成熟籽粒在80℃烘箱中烘干至恒重，用样品粉碎机粉碎，过0.5mm 筛。
水溶蛋白：0.5g 样品加10mM Tris-HCl(pH7.5, 10ml)室温下置于连续振荡器上提取2 h ，离心(4000 g)10min ，连续提取两次，将得到的上清液混合保存。
盐溶蛋白：0.5g 样品加5ml 提取液1在室温下置于连续振荡器上提取1 h ，离心(1000 g ≈3900rpm)8min 。
醇溶蛋白：0.5g 样品加1.5ml 提取液2在60℃下置于连续振荡器上提取1 h ，离心(14000 rpm)10min 。
碱溶蛋白：0.2g 样品加10ml0.24％五水合硫酸铜，1.68％KOH ，0.5％酒石酸钾钠和50％(v/v)异丙醇提取显色液在室温下置于连续振荡器上提取1.5 h ，再在60o
C 恒温水浴震荡5min ，离心(4000g)10min ，550nm 比色测定。
提取液配置顺序参考后面的双缩脲试剂配制。
2．蛋白组分含量测定
清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量利用考马斯亮蓝法以牛白蛋白做标准曲线测定，谷蛋白用Biuret法测定。
清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白含量测定(考马斯亮兰法Bradford，1976)：
（一）实验原理
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
（二）操作方法
染色剂配制：考马斯亮蓝G-250（100mg）溶于50 ml 95%乙醇，加入100ml，85% (w/v)磷酸，稀释至1L。
最终浓度为： 0.01% (w/v)考马斯亮蓝G-250, 4.7% (w/v)乙醇, 8.5% (w/v)磷酸。
蛋白质含量测定：称取样品蛋白M1（10-100μg）用缓冲液稀释至0.1ml,移至12 x 100 mm 试管。
加入5ml以上染色剂。
摇匀后 2min-1h 时间内测595 nm波长下的吸光值（3ml比色皿）。
空白对照为0.1 ml缓冲液+5 ml染色剂。
样品蛋白质含量可以根据其吸光值在标准曲线上定位。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
谷蛋白测定（双缩脲法，Biuret法）
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10mg/ml。