siRNA沉默CXCR4基因的实验研究

３３６　第１３卷３期　２００７年９月　天津医科大学学报　

ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＴＩＡＮＪＩＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　Ｖ０１．１３．Ｎｏ．３　

Ｓｅｐ．２００７　

ｓｉＲＮＡ沉默ＣＸＣＲ４基因的实验研究　张霖　，史玉荣　，魏熙胤　，杨毅　，牛瑞芳　，姚智　（１．天津医科大学肿瘤医院中心实验室，天津３０００６０；２．天津医科大学免疫学教研室）　

［摘要】目的：设计和构建趋化因子受体４（ＣＸＣＲ４）基因的小干扰ＲＮＡ质粒，并初步验证其对靶基因的抑制作用。　方法：选择高表达ＣＸＣＲ４受体的人乳腺癌细胞系Ｔ４７Ｄ作为研究对象　将预先设计的３段ｓｉＲＮＡ分别连人质粒载　体，然后转化大肠杆菌，经过克隆、扩增、纯化后转染到Ｔ４７Ｄ细胞中，Ｇ４１８筛选稳定表达细胞株，采用流式细胞术从　蛋白水平检测ＣＸＣＲ４的表达率，实时定量ＰＣＲ从基因转录水平检测ＣＸＣＲ４基因的表达率。结果：流式细胞术检测　结果显示，Ｔ４７Ｄ细胞经特异性ｓｉＲＮＡ作用后ＣＸＣＲ４的表达率由６９．００％分别下降到４．９５％、１　１．３０％、５．５３％。实时相　对定量ＰＣＲ检测结果显示，ｓｉＲＮＡ作用的细胞其ＣＸＣＲ４基因转录的抑制率分别为９５．６７％、８５．９４％、９８．２５％。结论：　ｓｉＲＮＡ能够引发人乳腺癌细胞系Ｔ４７Ｄ的ＣＸＣＲ４基因沉默，为进一步探讨ＣＸＣＲ４基因在乳腺癌转移中的作用奠定　前期实验基础，也为ｓｉＲＮＡ作为一种可能的治疗手段提供了理论依据　［关键词】乳腺癌；ＣＸＣＲ４；／ｉｘ干扰ＲＮＡ；基因表达　［中图分类号】Ｒ３９４．８　［文献标识码】Ａ　［文章编号】１００６—８１４７（２００７）０２—０００１—０３—０３３６—０４　

Ａ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｓｉＲＮＡ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ＣＸＣＲ４　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＺＨＡＮＧ　Ｌｉｎ　，ＳＨＩ　Ｙｕ—ｍｎｇ　，ＷＥＩ　Ｘｉ－ｙｉｎ　，ＹＡＮＧ　Ｙｉ　，ＮＩＵ　Ｒｕｉ—ｆａｎｇ　，ＹＡＯ　Ｚｈｉ　（１．Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００６０，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）　

ＡＢＳＴＲＡＣＴ　ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅｉｒ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ＣＸＣＲ４　ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｔ４７Ｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ＣＸＣＲ４　ｇｅｎｅ．Ｔｈｒｅｅ　ｓｉＲＮＡ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＣＸＣＲ４　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｃａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＳｉｌｅｎｅｅｒＴＭ　３．１一Ｈ　１　ｎｅｏ　ｖｅｃｔｏｒ．　Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅｃｏｌ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｙ．Ａｆｔｅｒ　ｖｅｒｉｆｉｅｄ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｓｅ．　ｑｕｅｎｃｅ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｔ４７Ｄ　ｃｅＵｓ．Ｆｉｎａｌｌｙ，　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＣＸＣ　Ｒ４　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｒｅａｌ——ｔｉｍｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＣＸＣＲ４　ｏｆ　Ｔ４７Ｄ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｆｒｏｍ　６９．ＯＯ％ｔｏ　４．９５％．　１１．３Ｏ％．５．５３％ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｔｈｒｅｅ　ｓｉＲＮＡ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＣＸＣＲ４　ｗｅｒｅ　９５．６７％，８５．９４％，９８．２５％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ａｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｗｈｉｃｈ　ｐａｖｅｓ　ｔｈｅ　ｗａｙ　ｆｏｒ　ｆｕｔｕｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ＣＸＣＲ４　ｇｅｎｅ　ｏｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｅｔａｓ—　ｔａＳ　Ｓ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　Ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ；ＣＸＣＲ４；Ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ；Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　

内源性或外源性双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）诱发的序列特异的转录后基因沉默　基金项目：天津医科大学科研基金资助项目（２００５ＫＹ４１）　作者简介：张霖（１９７２一），男，助理研究员，博士在读，研究方向：乳腺　癌发病机制；牛瑞芳（ｉ９６４一），女，研究员，硕士，研究方向：乳腺癌靶　向研究。　（ｐｏｓｔ—ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ），使细胞　表现出特定基因缺失的表型，称为ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ），这是生物体内抵御转座子和病　毒感染的重要保护机制，也是生长发育过程中调节　内源基因表达的重要途径【１１。ＲＮＡｉ被发现不到１Ｏ年　的时间，由于其高效性和高度特异性，成为颇为理想　

维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　张霖．等．ｓｉＲＮＡ沉默ＣＸＣＲ４基因的实验研究　３３７　的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时　代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段。近年　来，趋化因子受体在肿瘤转移中的作用得到广泛关　注．基质细胞衍生因子一１（ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆａｃ—　ｔｏｒ一１，ＳＤＦ一１）与其特异性受体趋化因子受体４（ＣＸＣ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４．ＣＸＣＲ４）构成的生物学轴激活　的特殊信号传导途径，对癌细胞在转移好发部位种　植、存活和增殖起关键的作用ｌ２１。很多研究已经证明，　干预阻断ＳＤＦ一１／ＣＸＣＲ４生物轴的措施在一定程度　上能减少乳腺癌远处转移的发生率［３－－６］。因此，ＣＸＣＲ４　可能是人类肿瘤治疗的一个潜在的靶位，对其进行　更加广泛的研究显示出极为重要的意义。本实验以　高表达ＣＸＣＲ４受体的人乳腺癌细胞系Ｔ４７Ｄ为体　外实验模型．采用ｓｉＲＮＡ方法对ＣＸＣＲ４基因进行　封闭．从而为进一步探讨ＣＸＣＲ４基因在乳腺癌转移　中的作用奠定前期实验基础，为今后采用ｓｉＲＮＡ进　行基因治疗作出初步探索。　１材料与方法　１．１主要试剂　Ｇ４１８、Ｔｒｉｚｏｌ、Ｍ—ＭＬＶ试剂为美国　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品：转染试剂为Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ产品：　ＦＩＴＣ荧光标记ＣＸＣＲ４单克隆抗体为ＢＤ公司产品：　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ、ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ试剂盒为Ｑｉａｇｅｎ公司产品：载体ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ　３．１＿Ｈ１　ｎｅｏ为Ａｍｂｉｏｎ公司提供。　１．２细胞株和细菌　人乳腺癌细胞系Ｔ４７Ｄ和　ＭＣＦ一７为本室所藏．感受态大肠杆菌ＤＨ５ｏｔ购自大　连宝生物公司，用于质粒转染、扩增。　１．３定量ＰＣＲ筛选高表达ＣＸＣＲ４乳腺癌细胞系常　规培养Ｔ４７Ｄ和ＭＣＦ一７细胞．用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取细　胞的总ＲＮＡ，电泳检测质量，紫外分光定量。以相同　量ＲＮＡ作为起始模板，逆转录反应合成ｃＤＮＡ。用　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ试剂盒在定量ＰＣＲ仪　ＧｅｎｅＡｍｐ　５７００上进行实时定量ＰＣＲ，反应体系为　９５℃预变性１５　ｍｉｎ．９４℃变性１５　Ｓ，５０　ｏＣ退火３０　Ｓ，７２　℃延伸３０　Ｓ，循环４Ｏ次。用ＳＤＳ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ分析结果。　ＣＸＣＲ４的上游引物为５　一ＣＣＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣ．　ＣＡＴＧＴ一３　，下游引物为５　一ＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴ．　ＧＡＴＧＡ一３　：ＧＡＰＤＨ上游引物为５＂－ＣＡＴＧＡＧＡＡＧ．　ＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴ一３　，下游引物为５　一ＡＧＴＣ．　ＣＴＦＣＣＡＣＧＡＴＡＣＣＡＡＡＧＴ一３　。　１．４　ｓｉＲＮＡ表达载体的构建载体为ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ　３．１一Ｈ１　ｎｅｏ质粒载体，其结构为线性．两端分别为　ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点的粘性末端。ＣＸＣＲ４一　ｓｉＲＮＡ设计原则参见ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／　和Ａｍｂｉｏｎ公司ｐＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ　３．１一Ｈ１　ｎｅｏ产品（见图　１）。选定３条候选序列，通过设计软件将其转换成３　对ｓｉＲＮＡ模板（见表１），并由北京奥科生物技术公　司合成．５　端磷酸化。将每对模板退火．连人ｐＳｉ—　ｌｅｎｃｅｒＴＭ　３．１一Ｈ１　ｎｅｏ质粒载体中。转染感受态大肠杆　菌ＤＨ５ｏｔ，铺平板过夜培养。挑取转化菌扩增培养提　取质粒，酶切测序。　阴性对照Ｃｏｎｔｒｏｌ—ｓｉＲＮＡ载体由试剂盒提供．含　有一段与人类已知基因均不同源的ｓｉＲＮＡ。　

表１　ＣＸＣＲ４一ｓｉＲＮＡ序歹日　序列　转换为ｓｉＲＮＡ模板　ｓｉＲＮＡ１　ＡＡＣＣＣＴＧＴＩＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴ　５，－ＧＡＴＣＣＧＣＣＣＴＧＴＩＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡ　几℃ＡＡＧＡＧＡＴＩＴＣ３３＂ＣＡＣＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＴｒＩＴｒＩ’ｒＧＧＡＡＡ一３　ｓｉＲＮＡ２　ＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＴ丌ＧＡＧＡＡＣＡＣＴ　５　一ＧＡＴＣＣＧＧＧＴＧＴＧＡＧＴ丌ＧＡＧＡＡＣＡ　ＩＴＣＡＡＧＡＧＡＴＧ　ＩＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴ１’ＩＴｒＩＴＧＧＡＡＡ一３　ｓｉＲＮＡ３　ＡＡＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡ　Ｉ　ｒ℃ＡＴＣＴＧＴ　５，－ＧＡＴＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡ　ＩＴＣＡＴＣＴＩＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧＣＴ１’ＩＴｒＩＴＧＧＡＡＡ一３　

踟ｍＨ　１．　Ｓｅｎｓｅ　ｓｔｒａｎｄ　Ｃｏｏｐ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｔｅｒｍｉｎａ［ｏｒ　Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ　辫：　：Ｎ：　鬈