荧光定量PCR数据分析
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目的基因、管家基因分别作标准曲线， 然后从各自的标准曲线上求出初始模板 量 ，经管家基因均一化处理后，求出 目的基因的相对含量。
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双标准曲线法
运用RT-PCR数据分析软件
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软件介绍
主要特点：
简易的操作界面 流程化的数据分析 强大的数据质控检验 很高的数据挖掘能力 多样的数据分析结果
条件： 需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量 PCR扩增，利用获得的数据生成标准曲线，标准曲线以各靶点浓度及相 应的Ct值绘制。
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绝对定量要点：
标准品 标准曲线
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绝对定量标准品的选择
绝对定量分析的标准品选择很重要，尽量选择与实际检测样品结构近似 的样品。 以DNA为样品，则要选择基因组DNA作为标准品； 以RNA为样品，则选择 RNA(total RNA)或目的基因的cDNA为标准品； 如果目的基因丰度低，DNA样品则要构建质粒标准品，RNA样品则要构建 体外转录RNA。
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标准品
目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系 要求：
浓度已知；5点以上； 标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100% 仪器质量一致 试剂质量一致：模板浓度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓冲液成分； 反应条件一致：循环参数相同、同一次实验；
不要求： 标准品与目标基因使用相同的DNA；
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绝对定量方法解析
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1.2.1绝对定量
原理： Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的 标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系； 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量； 绝对定量——适合需要测定靶点实际拷贝数可采用此方法；
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假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂。 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
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ΔΔCt方法要求内参和靶基因的效率相同，但无疑明显的问 题是：可接受的偏差范围是多大？ 确定该范围的方法是采用同样的样本生成内参基因和目的靶 基因的标准曲线。可获得每个稀释度的内参基因和靶基因的 平均ΔCt。数值本身并不重要；重要的是各个稀释度的值的 一致性。对于一些研究人员而言，这些小的效率偏差仍可导 致数据不准确。 采用目的基因和内参基因校正可使扩增效率差异最小化。
由于系统误差的原因，不同的样品很难获得相同量的RNA，这时就有必 要引入管家基因来对所有样品进行归一化处理(RNA量校正)，然后再对 不同样品之间的目的基因表达量进行比较。
该技术适用于大多数基因表达研究，可分析对照 (正常) 样本和一个 或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。
采用该技术无需精确测定拷贝数，而是关注与对照样本相比的倍数变化；
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相对定量算法-ΔCt
这是最基本的相对定量形式。获取检测和对照样本的目的基因表达的Ct 值，两者之间的差异为ΔCt。倍数差异为2的ΔCt次幂。 倍数差异 = 2ΔCt 该方法不控制样本数量、样本质量或反应效率的差异，存在不足。
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相对定量算法-ΔΔCt
ΔΔCt法是一种非常普遍的技术，它比较了包括对照样品(如未处 理或野生型样本)和内参基因(如看家基因表达)在内的实验样本的结果。
这里有 2 个问题需要明确 ：
荧光阈值的设定：在定量 PCR 中，需要经过数个循环后荧光 信号才能够被检测到， 一般以前 15 个循环的荧光信号作为 荧光本底信号；
CT值为 PCR 过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所 经过的循环次数。
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重要概念： 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 熔解曲线
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标准曲线生成
采用绝对标准曲线分析法，目的靶点的拷贝数必须已知。 一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区 间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳 定使用的标准品可以适当减少重复的次数。 生成的标准曲线与每个特定的Ct的拷贝数相关。然后通过与该标准 曲线进行比较，推算出未知样本的拷贝数。定量的准确度与标准曲 线的质量直接相关
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标准品梯度稀释方法
选择目标----提取/PCR----纯化----测定浓度----调整浓度---- 梯度稀释 Ct值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 10倍连续梯度稀释方法： —1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii — 1v原液（标准品ii）+9v稀释缓冲液，得标准品iii — 1v原液（标准品iii）+9v稀释缓冲液，得标准品iv — 1v原液（标准品iv）+9v稀释缓冲液，得标准品v —切不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii，iii， iv，v
需要）。
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相对定量方法解析
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1.2.2 相对定量
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用，但在有些情 况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异 即可，如X基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了，这时只 需要用相对定量的方法就可以得到结果，而不需要对标准品进行定量来 确定浓度。
荧光定量PCR数据分析
上海启因生物科技有限公司
Http：//www.wcgene.com
1.1荧光定量PCR定量原理
RT-PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始 模板量，是定量基因表达最灵敏的方法，其准确性取决于扩增效率 以及数据的处理方法。 定量的原理： 靶基因初始拷贝数越多， 所产生的循环阈值越小。
1.2荧光定量PCR定量方法
目前最常用的两种分析荧光定量PCR实验数据方法：绝 对定量和相对定量；
绝对定量是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数； 相对定量方法是比较处理过的样品和未处理过的样品目
的基因之间的表达差异，相对定量又有双标准曲线法， 2 -ΔΔCt以及动力学法。
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定量方法的选择取决于实验的目标—— 绝对定量 可测定靶点的实际拷贝数，但也是最费力、最复杂的定量形式。此方法 要求周密的计划和高度准确的标准曲线。绝对定量常用于确定病毒载量。 相对定量 需要仔细规划，但生成的数据是相对丰度，而非确切的拷贝数。这是适 用于基因表达研究的方法； 可提供两种主要的定量方案：ΔΔCt和标准曲线定量法。
采用该方法，可根据检测样本和对照样本中的内参基因(正常)基因 的Ct调整同样两个样本中的目的基因(GOI)的Ct。其得出的ΔΔCt值可 用于测定表达的倍数差异， 倍数差异 = 2-ΔΔCt
△△CT=（CT未知样品- CT未知样品内参）-（ CT基准样品- CT基准内参）
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优点：无需作标准曲线 缺点：假定扩增效率为 100 %；
致力于多样品多基因的数据挖掘， 解读研究新意义
分析流程：上传实验/数据文件—— 数据质控/数据筛选/数据归一化 ——差异表达 /聚类分析
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高通量荧光定量pcr数据分析软件
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1. 创建实验文件 excel编写：编辑容易 csv格式：创建简单 多次实验：统一分析
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• 柱状图分析 • 多基因 • 2组样品 • 直观
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• 热点图分析 • 多基因 • 多样品 • 多重聚类 • 直观
E-mail：zhang@wcgene.com Http：//www.wcgene.com
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绝对定量分析几要素
一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的
质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以
确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不
2. 创建数据文件 excel编写 csv格式 多次实验 分开上传 统一分析
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3.数据浏览
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样品明细
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基因明细
4.质控分析
样品聚类分析
Leabharlann Baidu
基因CT分布
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内参CT分布
5.数据挖掘分析
多基因比较
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多样品比较
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6.数据分析报告
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相对定量算法-双标准曲线法
相对定量的标准曲线法采用检测待测样品和对照样本的靶基因之间的Ct 差异，利用内参基因Ct进行标准化，调整扩增效率的微小差采用此方法 需要利用标准曲线确定内参基因和目的基因的扩增效率，但无需采用前 面的技术的前提。该技术要求所有分析样本中的内参基因必须相同异。
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双标准曲线法
运用RT-PCR数据分析软件
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软件介绍
主要特点：
简易的操作界面 流程化的数据分析 强大的数据质控检验 很高的数据挖掘能力 多样的数据分析结果
条件： 需对已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释，采用实时荧光定量 PCR扩增，利用获得的数据生成标准曲线，标准曲线以各靶点浓度及相 应的Ct值绘制。
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绝对定量要点：
标准品 标准曲线
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绝对定量标准品的选择
绝对定量分析的标准品选择很重要，尽量选择与实际检测样品结构近似 的样品。 以DNA为样品，则要选择基因组DNA作为标准品； 以RNA为样品，则选择 RNA(total RNA)或目的基因的cDNA为标准品； 如果目的基因丰度低，DNA样品则要构建质粒标准品，RNA样品则要构建 体外转录RNA。
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标准品
目的：生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系 要求：
浓度已知；5点以上； 标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100% 仪器质量一致 试剂质量一致：模板浓度、引物和探针的Tm值、酶活性、缓冲液成分； 反应条件一致：循环参数相同、同一次实验；
不要求： 标准品与目标基因使用相同的DNA；
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绝对定量方法解析
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1.2.1绝对定量
原理： Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的 标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系； 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量； 绝对定量——适合需要测定靶点实际拷贝数可采用此方法；
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假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂。 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
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ΔΔCt方法要求内参和靶基因的效率相同，但无疑明显的问 题是：可接受的偏差范围是多大？ 确定该范围的方法是采用同样的样本生成内参基因和目的靶 基因的标准曲线。可获得每个稀释度的内参基因和靶基因的 平均ΔCt。数值本身并不重要；重要的是各个稀释度的值的 一致性。对于一些研究人员而言，这些小的效率偏差仍可导 致数据不准确。 采用目的基因和内参基因校正可使扩增效率差异最小化。
由于系统误差的原因，不同的样品很难获得相同量的RNA，这时就有必 要引入管家基因来对所有样品进行归一化处理(RNA量校正)，然后再对 不同样品之间的目的基因表达量进行比较。
该技术适用于大多数基因表达研究，可分析对照 (正常) 样本和一个 或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。
采用该技术无需精确测定拷贝数，而是关注与对照样本相比的倍数变化；
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相对定量算法-ΔCt
这是最基本的相对定量形式。获取检测和对照样本的目的基因表达的Ct 值，两者之间的差异为ΔCt。倍数差异为2的ΔCt次幂。 倍数差异 = 2ΔCt 该方法不控制样本数量、样本质量或反应效率的差异，存在不足。
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相对定量算法-ΔΔCt
ΔΔCt法是一种非常普遍的技术，它比较了包括对照样品(如未处 理或野生型样本)和内参基因(如看家基因表达)在内的实验样本的结果。
这里有 2 个问题需要明确 ：
荧光阈值的设定：在定量 PCR 中，需要经过数个循环后荧光 信号才能够被检测到， 一般以前 15 个循环的荧光信号作为 荧光本底信号；
CT值为 PCR 过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所 经过的循环次数。
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重要概念： 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 熔解曲线
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标准曲线生成
采用绝对标准曲线分析法，目的靶点的拷贝数必须已知。 一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区 间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳 定使用的标准品可以适当减少重复的次数。 生成的标准曲线与每个特定的Ct的拷贝数相关。然后通过与该标准 曲线进行比较，推算出未知样本的拷贝数。定量的准确度与标准曲 线的质量直接相关
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标准品梯度稀释方法
选择目标----提取/PCR----纯化----测定浓度----调整浓度---- 梯度稀释 Ct值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 10倍连续梯度稀释方法： —1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii — 1v原液（标准品ii）+9v稀释缓冲液，得标准品iii — 1v原液（标准品iii）+9v稀释缓冲液，得标准品iv — 1v原液（标准品iv）+9v稀释缓冲液，得标准品v —切不可由标准品i分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii，iii， iv，v
需要）。
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相对定量方法解析
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1.2.2 相对定量
绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用，但在有些情 况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异 即可，如X基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了，这时只 需要用相对定量的方法就可以得到结果，而不需要对标准品进行定量来 确定浓度。
荧光定量PCR数据分析
上海启因生物科技有限公司
Http：//www.wcgene.com
1.1荧光定量PCR定量原理
RT-PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始 模板量，是定量基因表达最灵敏的方法，其准确性取决于扩增效率 以及数据的处理方法。 定量的原理： 靶基因初始拷贝数越多， 所产生的循环阈值越小。
1.2荧光定量PCR定量方法
目前最常用的两种分析荧光定量PCR实验数据方法：绝 对定量和相对定量；
绝对定量是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数； 相对定量方法是比较处理过的样品和未处理过的样品目
的基因之间的表达差异，相对定量又有双标准曲线法， 2 -ΔΔCt以及动力学法。
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定量方法的选择取决于实验的目标—— 绝对定量 可测定靶点的实际拷贝数，但也是最费力、最复杂的定量形式。此方法 要求周密的计划和高度准确的标准曲线。绝对定量常用于确定病毒载量。 相对定量 需要仔细规划，但生成的数据是相对丰度，而非确切的拷贝数。这是适 用于基因表达研究的方法； 可提供两种主要的定量方案：ΔΔCt和标准曲线定量法。
采用该方法，可根据检测样本和对照样本中的内参基因(正常)基因 的Ct调整同样两个样本中的目的基因(GOI)的Ct。其得出的ΔΔCt值可 用于测定表达的倍数差异， 倍数差异 = 2-ΔΔCt
△△CT=（CT未知样品- CT未知样品内参）-（ CT基准样品- CT基准内参）
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优点：无需作标准曲线 缺点：假定扩增效率为 100 %；
致力于多样品多基因的数据挖掘， 解读研究新意义
分析流程：上传实验/数据文件—— 数据质控/数据筛选/数据归一化 ——差异表达 /聚类分析
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高通量荧光定量pcr数据分析软件
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• 热点图分析 • 多基因 • 多样品 • 多重聚类 • 直观
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绝对定量分析几要素
一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的
质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以
确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不
2. 创建数据文件 excel编写 csv格式 多次实验 分开上传 统一分析
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基因明细
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样品聚类分析
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基因CT分布
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内参CT分布
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多基因比较
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多样品比较
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6.数据分析报告
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相对定量算法-双标准曲线法
相对定量的标准曲线法采用检测待测样品和对照样本的靶基因之间的Ct 差异，利用内参基因Ct进行标准化，调整扩增效率的微小差采用此方法 需要利用标准曲线确定内参基因和目的基因的扩增效率，但无需采用前 面的技术的前提。该技术要求所有分析样本中的内参基因必须相同异。