毒理学基础各章节知识点

毒理学（Toxicology）：研究外源性化学物质对生物机体的损害作用的学科(传统定义) 。

现代毒理学(modern Toxicology )：研究所有外源因素（如化学、物理和生物因素）对生物系统（living systems）的损害作用、生物学机制(biologic mechanisms)、安全性评价(safty evaluation)与危险性分析(risk analysis)的科学。

（二）研究内容

毒理学两个基本功能：检测理化因素产生的有害作用的性质（危害性鉴定功能）

评价在特殊暴露条件下出现毒性的可能性（危险度评价功能）

三大研究领域：描述毒理学(descriptive toxicology)

机制毒理学(mechanistic toxicology)

管理毒理学(regulatory toxicology)

从整体实验到替代实验，又称“3R”法，即优化试验方法和技术，减少受试动物的数量和痛苦，取代整体动物试验的方法。

第二章毒理学基本概念

毒物(poison)：是指在一定条件下，以较小剂量进入机体就能干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂时的或永久性的病理改变，甚至危及生命的化学物质。

毒性（toxicity）：指化学物质引起有害作用的固有能力。剂量相同时，对机体损害能力越大的化学物质，毒性越高。相对于同一损害指标，需要剂量越小的化学物质，其毒性越大。中毒(poisoning)：是指生物体受到毒物作用而引起功能性或器质性改变后出现的疾病状态。毒物：在一定条件下，以较小剂量进入机体干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂时性或永久性病理变化甚至危及生命的化学物质。

毒效应（toxic effect）：又称为毒作用，是化学物质对机体所致的不良或有害的生物学改变。

毒效应是化学物质或代谢产物在作用部位达到一定数量并停留一定时间，与组织大分子成分互相作用的结果。当改变暴露条件时，毒效应会相应改变。

毒性是一种能力，中毒是一种状态，毒效应是一种表现。

损害作用（adverse effect）：指影响机体行为的生物化学改变，功能紊乱或病理损害，或者降低对外界环境应激的反应能力。

非损害作用（non-adverse effect）：机体发生的生物学变化应在机体适应代偿能力范围之内，机体对其他外界不利因素影响的易感性也不应增高。

选择毒性（selective toxicity）：一种化学物质只对某种生物产生损害作用，而对其他种类生物无害；或只对机体内某一组织器官发挥毒性，而对其他组织器官不具毒作用。

外源化学物作用于生物体的毒效应谱，随剂量增加可以表现为：1）机体对外源化学物的负荷增加，2）意义不明的生理和生化改变，3）亚临床改变，4）临床中毒，5）甚至死亡。适应：机体对一种通常能引起有害作用的化学物显示不易感性或易感性降低。

速发性毒作用：某些外源化学物在一次暴露后的短时间内所引起的即刻毒作用。

局部毒作用：某些外源化学物在机体暴露部位直接造成的损害作用。

可逆或不可逆作用：停止暴露后可逐渐消失的毒作用/毒作用继续存在。

超敏反应：机体对外源化学物产生的一种病理性免疫反应。

特异质反应：机体对外源化学物的一种遗传性异常的反应性。

选择性毒性产生的原因：

（1）物种和细胞学差异（细菌、青霉素）

（2）不同组织器官对化学物质亲和力的差异（百草枯、肺）

（3）不同生物或组织器官对化学物质生物转化过程的差异（磺胺类药物的发明）

（4）不同组织器官对化学物质所致损害的修复能力的差异（肝、肾再生能力强，脑、神经

靶器官(target organ)：外源化学物可以直接发挥毒作用的器官就称为该物质的靶器官。

特点：

一种毒物可以有几个靶器官，不同的毒物可以作用于同一个或同几个靶器官。

在同一靶器官产生相同毒效应的化学物质，其作用机制可能不同。

生物学标志（biomarker）:

又称生物学标记或生物学标志物，是针对通过生物学屏障并进人组织或体液的化学物及其代谢产物，以及它们引起的生物学效应而采用的检测指标。

通常把生物学标志分为暴露标志、效应标志和易感性标志。

暴露生物学标志：是测定组织、体液或排泄物中吸收的外源化学物、其代谢物或与内源性物质的反应产物，作为吸收剂量或靶剂量的指标，提供关于暴露于外源化学物的信息。

效应生物学标志：机体中可测出的生化、生理、行为或其他改变的指标。

易感生物学标志：关于个体对外源化学物的生物易感性的指标，即反应机体先天具有或后天获得的对暴露外源性物质产生反应能力的指标。

剂量：机体接触化学毒物的量或给予机体化学毒物的量。

给予剂量：机体实际摄入、吸入或应用于皮肤的外源化学物的量。

内剂量（吸收剂量）：已被吸收进入体内的量。

暴露特征是决定外源化学物对机体损害作用的另一个重要因素，暴露特征包括暴露途径和暴露期限及暴露频率。

染毒期限包括急性、亚急性、亚慢性、慢性毒性实验。亚急性、亚慢性和慢性毒性试验可统称为重复染毒试验。

量反应（graded response），属于计量资料，有强度和性质的差别，可用某种测量数值表示。质反应（quantal response），属于计数资料，没有强度的差别，不能以具体的数值表示，而只能以“阴性或阳性”、“有或无”来表示。

剂量－效应关系（dose-effect relationship ），现称剂量-量反应关系（graded dose-response relationship）：表示化学物质的剂量与个体中发生的量反应强度之间的关系。曲线基本类型是S形曲线。

剂量-反应关系（dose-response relationship ），现称剂量-质反应关系（quantal dose-response relationship）表示化学物质的剂量与某一群体中质反应发生率之间的关系。

剂量-量反应关系和剂量-质反应关系统称为剂量-反应关系，是毒理学的重要概念。化学物质的剂量越大，所致的量反应强度应该越大，或出现的质反应发生率应该越高。剂量-反应关系是受试物与机体损伤之间存在因果关系的证据。

实验研究（微观）：用实验为人类提供剂量－效应（反应）关系等资料，结合人群接触水平对化学物质进行安全性评价。

* 体内实验* 体外实验

毒理学研究方法的优缺点

研究方法流行病学研究受控的临床研究毒理学体内试验毒理学体外试验

优点真实的暴露条件

在各化学物之间发生相互作用

测定在人群的作用

表示全部的人敏感性规定的限定暴露条件

在人群中测定反应

对某组人群(如哮喘)的研究是有力的

能测定效应的强度易于控制暴露条件

能测定多种效应

能评价宿主持征的作用(如：性别、年龄、遗传特征等和其他调控因素饮食等)

能评价机制影响因素少，易于控制

可进行某些深入的研究(如：机制，代谢)

人力物力花费较少

缺点耗资、耗时多

(多为回顾性)，无健康保护

难以确定暴露，有混杂暴露问题

可检测的危险性增加必需达到2倍以上

测定指标较粗(发病率，死亡率) 耗资多

较低浓度和较短时间的暴露

限于较少量的人群(一般＜50)

限于暂时、微小、可逆的效应

一般不适于研究最敏感的人群动物暴露与人暴露相关的不确定性

受控的饲养条件与人的实际情况不一致

暴露的浓度和时间的模式显著地不同于人群的暴露不能全面反映毒作用，不能作为毒性评价和危险性评价的最后依据

难以观察慢性毒作用

半数致死剂量（median lethal dose，LD50）：

化学物质引起一半受试对象出现死亡所需要的剂量，又称致死中量。LD50是评价化学物质急性毒性大小最重要的参数，也是对不同化学物质进行急性毒性分级的基础标准。化学物质的急性毒性越大，其LD50的数值越小。

观察到有害作用的最低水平：LOAEL。未观察到有害作用水平：NOAEL。

阈剂量：又称最小有作用剂量（MIL），化学毒物引起受试对象中的少数个体出现某种最轻微的异常改变所需的最低剂量。

安全限值：为保护人群健康，对生活和生产环境和各种介质中与人群身体健康有关的各种因素所规定的浓度和暴露时间的限制性量值，在低于此种浓度和暴露时间内，根据现有的知识，不会观察到任何直接和间接的有害作用。制定安全限值的前提是必须从动物实验或人群调查得到LOAEL或NOAEL。

暴露范围（MOE）越大越好。安全范围（MOS）越小越好。

毒作用带（toxic effect zone）：是表示化学物质毒性和毒作用特点的重要参数之一，分为急性毒作用带与慢性毒作用带。

急性毒作用带（acute toxic effect zone, Zac）：为半数致死剂量与急性阈剂量的比值，表示为：Zac=LD50/Limac

Zac值小，说明化学物质从产生轻微损害到导致急性死亡的剂量范围窄，引起死亡的危险性大；反之，则说明引起死亡的危险性小。

慢性毒作用带（chronic toxic effect zone,Zch）：为急性阈剂量与慢性阈剂量的比值，表示为：Zch= Limac /Limch

Zch值大，说明Limac 与Limch之间的剂量范围大，由极轻微的毒效应到较为明显的中毒表现之间发生发展的过程较为隐匿，易被忽视，故发生慢性中毒的危险性大；反之，则说明发生慢性中毒的危险性小。

第三章外源毒物在体内的生物转运与生物转化

1、生物转运（biotransport）：是指在ADME这四个过程中，外源毒物的吸收、分布和排泄过程，即都是外源毒物穿透生物膜的过程，且其本身的结构与性质不发生变化。

2、ADME过程吸收(Absorption) 、分布(Distribution) 、代谢(Metabolism)、

排泄(Excretion

3、生物转化（biotransformation）：是指外源毒物的代谢变化过程，即外源化学物形成新的衍生物的过程，所形成的产物结构与性质均发生了改变，所以又称为代谢转化。

4、外源毒物对机体的毒性作用，一般取决于两个因素：毒物的固有毒性和剂量、毒物到达靶器官的数量以及在靶器官存留的时间。

5、剂量包括外剂量、内剂量和靶剂量；靶剂量指到达靶组织的可与特定器官或细胞交互作用的外源毒物和（或）其代谢产物的剂量，对于外源毒物所致损害作用的性质和强度起决定性作用。

6、毒物动力学(toxicokinetics) ：是指研究外源毒物的数量在ADME过程中随时间变化的动态规律。

7、外源化学物通过生物膜的方式：被动转运（简单扩散、滤过）、特殊转运（主动转运。易化扩散、膜动转运）（主要出选择题）

被动转运(passive transport)：外源毒物顺浓度差通过生物膜的过程

简单扩散（simple diffusion)：毒物由生物膜浓度较高的一侧向浓度较低的一侧扩散，当两侧浓度达到动态平衡时，扩散即终止

脂/水分配系数：当一种物质在脂相和水相之间的分配达到平衡时，其在脂相和水相中溶解度的比值。

滤过(filtration)：外源化学物通过生物膜上亲水性孔道的过程；依靠生物膜两侧的渗透压梯度和流体静压的作用。（eg:肾小球、毛细管）

特殊转运(special transport)：外源化学物借助于载体或特殊转运系统而发生的跨膜运动。

主动转运(active transport)：外源化学物在载体的参与下，逆浓度梯度通过生物膜的转运过程。

特点：1、转运系统对于外源化学物的结构具有特异选择性，只有具备某种结构特征的物质才能被转运。2、载体具有一定的容量，存在转运极限。3、使用同一转运系统转运的外源化学物之间可发生竞争性抑制。4、需要消耗能量，代谢抑制剂可以阻断转运过程。

易化扩散（facilitated diffusion）：外源毒物，利用载体顺浓度梯度转运的过程，所以又称为载体扩散；

膜动转运（cytosis transport）：胞饮和吞噬：液体或固体外源毒物被伸出的生物膜包围，然后将被包围的液滴或较大颗粒并入细胞内，达到转运的目的，前者称为胞饮，后者称为吞噬，总称为胞吞作用；

8、胃肠道吸收胃肠道是外源化学物的主要吸收途径之一；外源化合物的吸收可发生于整个胃肠道，但主要在小肠；吸收方式：主要是通过简单扩散，还可以通过主动转运系统、滤过、胞饮或吞噬

影响因素：1、毒物的理化性质。2、胃肠状况：胃蠕动。3、机体状况：饥饿，病理状态。

9、肝脏的首过消除（first pass elimination）：是指经胃肠道吸收的外源化学物通过门静脉首先到达肝脏，进行生物转化后，再进入体循环，这种现象称为首过消除。

经呼吸道吸收：肺是主要器官；肺泡解剖生理特点；外源毒物经肺吸收迅速，仅次于静脉注射；不经过肝脏的生物转化，直接进入体循环而分布全身；

影响因素：1、气态化合物的浓度。2、气态化合物在呼吸道的吸收部位的深浅决定于水溶性。

3、气态化合物在血液中的溶解度。

10、气溶胶毒物经肺吸收的影响因素：粒子大小、水溶性

粒子大小

a) 气溶胶的直径﹥5 μm者多数沉积于鼻咽部；

b) 2μm～5μm沉降于气管、支气管；

c) 1 μm以下的粒子可吸入肺泡吸收入血；

水溶性：溶解度大的易在上呼吸道吸收，溶解度低的气溶胶易到达肺泡被吸收

11、在毒理学中, 有意义的颗粒直径为0.1~10 μm

经皮吸收影响因素：1、化合物本身的理化性质。2、化合物与皮肤接触的条件。

分布：初期影响分布的主要因素是：1、组织器官的血流量。2、再分布取决于外源化学物与不同组织的亲和力。3、随着时间推移，分布受到外源化学物经膜扩散速率及其与组织器官亲和力的影响，发生再分布。

12、蓄积作用（accumulation）：外源化学物以相对较高的浓度富集于某些组织器官的现象称为蓄积。（CO、铅…）

(1) 物质蓄积（DDT存于脂肪，毒性在神经）

(2) 功能蓄积（百草枯存于肺，引起肺水肿）

凡是毒物蓄积的部位均可认为是贮存库，意义：1、对急性中毒有保护作用。2、成为二次污染源，是慢性中毒的重要条件。

四种贮存库：血浆蛋白贮存库、肝脏肾脏贮存库、脂肪组织贮存库、骨骼贮存库。

13、排泄的主要途径：经肾脏随尿液排出；粪便排出；经呼吸道随同呼出气体排出；其他途径。

14、经肾脏随尿液排泄：：

主要排泄机理肾小球滤过

肾小球简单扩散(脂水分配系数高的物质，肾小管重吸收)

肾小管主动转运

其中简单扩散和主动转运更为重要

15、肠肝循环(enterohepatic circulation) 是指部分外源化学物在生物转化过程中形成结合物，并以结合物的形式排出在胆汁中；肠内存在的肠菌群以及葡萄糖苷酸酶，可将部分结合物水解，则使外源化学物又重新被吸收的过程。

毒理学意义：排泄速度减慢、延长生物半减期、毒作用持续时间延长

16、生物转运的毒理学意义 1.吸收与毒性：进入体内毒物的量；吸收途径；吸收部位；2.分布与毒性：器官组织中毒物的量；毒物不均匀分布，浓集点可能就是靶器官；蓄积作用对急性中毒有保护作用，但又是慢性中毒的一个重要条件。3.排泄与毒性：肾脏排泄；肠肝循环

17、代谢解毒：外源化学物经过生物转化以后成为低毒或无毒的代谢物的过程

18、代谢活化：一些外源化学物经过生物转化后，毒性非但没有减弱，反而明显增强，甚至产生致突变、致癌和致畸作用的现象

最重要的增毒方式：1、环氧化。2、N—羟化。

生物转化酶的基本特性：1、通常都有广泛的底物特异性。2、形成家谱式、超家谱。3、包括结构酶和诱导酶。4、某些生物转化酶的结构在不同个体有所差别，即存在多态性。5、某些外源化学物具有一个或多个手性中心，即存在立体异构体，它们的生物转化表现出立体选择性。生物转化酶主要位于内质网（微粒体）和胞液。

I相反应包括氧化、还原和水解反应。

（1）细胞色素P450酶系（MFO）主要反应类型有：脂肪族与芳香族羟化；环氧化；杂原子氧化和N—羟化；杂原子脱烷基；氧化基团转移；酯裂解；脱氢。

（2）黄素加单氧酶（FMO）：主要存在肝肺肾微粒体中，以FAD为辅酶。不能在碳位上催化氧化反应。

II相反应：1、葡萄糖醛酸结合、尿苷二磷酸酸葡萄糖醛酸：催化反应的酶是UDP-葡萄糖

醛酸基转移酶（UDPGT）。2、硫酸结合：催化反应的酶是硫转移酶。3、谷胱甘肽结合：谷胱甘肽（GSH）酶是谷胱甘肽S-转移酶（GST），其底物的共同特点是：具有一定的疏水性；含有亲电原子；可与GSH发生非酶促反应。4、甲基化反应。5、乙酰化作用。6、氨基酸结合。

毒物代谢酶的诱导和阻遏：

许多外源性化学物可引起某些代谢酶的合成增加并伴有活力增强，毒理学意义：诱导的结果：促进其他外来化合物的生物转化过程，使其增强或加速（1）酶诱导可使长期接触毒物时耐受性增强（2）酶诱导能增强毒物的代谢而解毒，也可增强其毒性。

零级速率：毒物在体内某一瞬间的变化速率与其瞬时含量的零次方呈正比。

非线性毒物动力学：体内外源化学物的数量过多，超过了机体的生物转运、转化及蛋白质结合能力时，其消除由一级速率过程转变为零级速率过程的现象。

第四章毒性机制(Mechanisms of Toxicity)

1、毒性机制涉及多个层次和步骤：毒物从接触部位进入血液循环→毒物从血液循环进入靶部位→增毒与解毒作用→毒物引起的靶分子结构改变或功能紊乱超过修复能力或修复本身障碍时，即产生毒性效应。

2、对细胞的损伤机制：1、膜改变；2、细胞骨架改变；

3、线粒体损伤与功能抑制；

4、内质网损伤；

5、ATP及其辅因子耗竭；

6、Ca2+稳态紊乱；

7、DNA损伤和聚ADP-核糖基化作用；

8、溶酶体不稳定；

9、激发细胞凋亡。

3、毒物引起细胞维持功能改变：

中毒性细胞死亡的机制

细胞损伤即由化学物质或其他因素干扰正常细胞自稳态机制而产生的病理性过程。

1、危害细胞存活的原发性代谢紊乱：A TP耗竭；Ca2+蓄积；ROS/RNS生成情况。

ATP耗竭：干扰线粒体A TP合成的化学物有5类。抑制ATP合酶的4种方式：1、直接抑制；2、干扰ADP的传递；3、干扰无机磷化学物；4、剥夺A TP合酶的驱动力。

细胞内Ca2+持续升高：毒物通过促进Ca2+向细胞浆内流或抑制Ca2+从细胞浆外流而引起胞浆Ca2+水平升高。将导致：1、能量储备的耗竭；2、微丝功能障碍；3、水解酶的活化；

4、ROS和RNS的生成。

ROS与RNS的过度产生：氧化还原循环物质和重金属等外源化学物可直接生成ROS与RNS，细胞内高钙也可引起ROS和RNS的过度产生。

线粒体渗透性转变（MPT）及其后果：

（1）坏死。引起线粒体内膜渗透性突然升高的因素：1、线粒体Ca2+摄取；2、△Ψm下降；

3、ROS和RNS生成；

4、ATP耗竭；

5、原发性代谢紊乱。

（2）凋亡。引起细胞凋亡的机制：线粒体途径；死亡受体途径；内质网应急途径。

ATP的利用度决定细胞死亡的形式：1、当仅有极少数线粒体发生MPT时，被溶酶体自吞噬清除，细胞存货；2、当较多线粒体发生MPT时，自吞噬机制被压制，细胞凋亡发生；3、全部线粒体发生MPT，ATP被严重耗竭，凋亡程序被阻止，细胞倾向于坏死。

4、增毒（toxication)或代谢活化：外源化学物在体内经生物转化为终毒物的过程称为增毒。

5、亲电子剂（electrophiles)：是含有一个缺电子原子的分子；易与含电子的亲核物共享电子对而发生反应；亲电子剂的形成与多种化学物的增毒作用有关：

6、自由基（free radicals)：是指在其外层轨道中含有一个或多个不成对电子的分子或分子片段; 自由基通过接受或失去一个电子，或由化合物的共价键发生均裂而形成。特点：①化学性质十分活泼②反应性极高，半减期极短，作用半径短。

7、解毒（detoxication)：消除终毒物或阻止终毒物生成的生物转化过程；在某些情况下，解毒可能与中毒竞争同一外源化学物。

8、终毒物：是指与生物靶分子（如受体、酶、DNA、微丝蛋白、脂质等）反应或引起机体生物学微环境改变、导致机体结构和功能紊乱并表现出毒物毒性的物质。

第五章毒性作用的影响因素

化学物因素：

构效关系与定量构效关系

带两个基团的苯环化合物的毒性：对位大于邻位大于间位。

理化性质：脂/水分配系数；大小；挥发性；气态物质的血/气分配系数；比重；电离度和荷电性。

个体间在化学物代谢中的差异的主要原因是酶的多态性。

1、化学结构取代基的影响：取代基的影响、异构体和立体构型、同系物的碳原子数和结构的影响、分子饱和度

2、化合物的联合作用（joint action ）：两种或两种以上毒物同时或先后作用于机体时产生的交互毒性作用。

有五种类型：相加作用、独立作用、协同作用、加强作用、拮抗作用

拮抗作用的机制可以是功能拮抗、化学拮抗或灭活、处置拮抗、受体拮抗。

第六章外源性化学物质的一般毒性作用

第一节急性毒作用

一、概述

（一）急性毒性的概念

急性毒性（acute toxicity）:

指机体（实验动物或人）一次接触或24小时内多次接触外源化合物后在短期（最长到14天）内所产生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。（二）急性毒性试验的目的

1、测试和求出毒物的致死剂量以及其他的急性毒性参数，通常以LD50为最主要的参数，并根据LD50值进行急性毒性分级。

2、通过观察动物的中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量－反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性。

3、为后续的重复剂量、亚慢性和慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据。

4、为毒理学机制研究提供线索。

二、急性毒性试验方法的要点

急性毒性替代试验：1、固定剂量法；2、急性毒性分级法；3、上-下移动法。

急性毒性试验的观察和记录内容主要包括：中毒体征及发生过程、体重和病理形态学变化、死亡情况和时间分布等。

LD50试验的意义（LD50的价值）：1、LD50标准化药物毒作用强度，评价药物对机体毒性的大小，比较不同药物毒性的大小；2、计算药物的治疗指数，药效剂量和毒性剂量的距离；

3、为后续的重复给药毒理学试验剂量的选择提供参考；

4、通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息；

5、试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体征，为临床毒副反应提供监测参考。局限性：1、评价新药或化学物时，给予有效的信息较少，实用性有限。2、波动性很大，影响因素很多。3、物种差异对LD50影响大。4、经典急性毒性试验消耗的动物量大。

（二）急性毒性试验设计原则

（1）经口(胃肠道、灌胃)染毒：

?空腹

?灌胃后2-3 h复食

?灌胃的体积不超过体重的1-2％：小鼠为0.1- 0.5ml/10g较合适；大鼠通常用0.5-1.0ml/100g；家兔为10ml/2kg体重，狗不超过50ml/10kg 。

（2）经呼吸道接触吸入接触分为两种方式

?静式吸入

?动式吸入

挥发性化学物质的浓度：

C=（a×d）/L×1000×1000

C：设计化学物质浓度，mg/m3；

a:依设计应该加入化学物质的体积，ml；

d:受试化学物质的比重，g/ml；

L:染毒柜体积，L。

（3）经皮肤染毒

?研究外源化学物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和豚鼠。

?但由于研究化学物经皮肤吸收的毒性(求经皮LD50) 所需的实验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替。

经皮肤染毒程序

给予受试物前24h，确定受试部位

｜

机械或化学脱毛面积10%～15%体表面积

｜

检查去毛部位有无异常现象

｜

单位体重相同容积染毒，接触时间与人实际接触该化学物的时间相仿

（4）注射染毒

对注射药品或需作比较毒性观察的药品进行毒性试验以及某些毒作用机制和毒代谢动力学研究中采用。

急性毒性试验主要目的之一就是对化学物的急性毒性进行分级。

第二节局部刺激试验

蓄积作用(accumulation)：外源化学物连续反复地进入机体，且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量，化学物质可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学物质的蓄积作用。

物质蓄积（material accumulation）：反复多次接触化学毒，可以用分析方法测出体内物质的原型或其代谢产物。

功能蓄积（functional accumulation）或损伤蓄积（ｄａｍａｇｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）：长期接触某些化学毒物后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。

第三节短期、亚慢性和慢性毒性作用

短期重复剂量毒性作用：实验动物或人连续接触外源性化学物14－30天所产生的中毒效应。亚慢性毒性作用：实验动物或人连续较长时间（相当生命周期的1/10）接触外源性化学物所产生的中毒效应。

慢性毒性作用:实验动物或人连续较长时间(接近生命周期)接触外源性化学物所产生的中毒效应。

亚慢性毒性试验的目的

1、观察长期接触受试物的毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官。了解其毒性机制。

2、观察长期接触受试物毒性作用的可逆性。

3、研究重复接触受试物毒性作用的剂量-反应（效应）关系，从初步了解到确定未观察到有害作用的剂量（NOAEL）和观察到有害作用的最小剂量（LOAEL），为制定人类接触的安全限量提供参考值。

4、确定不同动物对受试物的毒效应的差异，为将研究结果外推到人提供依据。

5、亚慢性为以后的试验作指标筛选。

亚慢性毒性的研究方法

1、实验动物的选择

亚慢性毒性作用研究一般要求选择两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的毒性特征。

由于亚慢性毒性试验期较长，所以被选择动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g左右大鼠100g左右。

○急性毒性试验常用大鼠、小鼠、狗

○亚慢性、慢性毒性试验常用大鼠、狗

○皮肤刺激试验和致敏试验常用兔豚鼠

○眼刺激试验常用兔

○遗传毒理学试验多用小鼠

○致畸试验常用大鼠、小鼠和兔

○致癌试验常用大鼠和小鼠

○迟发性神经毒性试验常用母鸡

2.染毒方式与染毒期限

?尽量选择和人类接触途径相似的方式。

?与预期进行的慢性毒性作用研究的接触途径相一致。

?口、呼吸道、皮、静脉（药物）。

染毒方式

?经口染毒

?经口染毒途径：灌胃法、喂饲法、胶囊法

?大小鼠建议灌胃，犬胶囊法或灌胃法。

?受试物掺入饲料的最大量有严格的规定，30天试验不得超过10g/100g饲料，亚慢性

90天试验不得超过8g/100g饲料，慢性试验不得超过5g/100g饲料，否则会影响动物的营养状况，从而影响生长发育

?亚慢性毒性试验每日染毒的时间应保持一致，一般在每日上午进行，给药后喂食

?经呼吸道染毒

?通常每日2-6h。

?工业毒物可以缩短至1h，环境污染物可延长至8h。

?经皮染毒

?每天6h，每周对染毒部位脱毛一次。

?经静脉注射染毒

?长期操作实施困难，必要时可用腹腔替代。

３．观察指标

系统尸解和病理组织学检查

脏器系数 (称脏/体比值)：是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100g体重计。如肝/体比：即(全肝湿重/体重)×100。

此指标的意义是实验动物在不同年龄期，其各脏器与体重之间重量比值有一定规律，若受试化学物使某个脏器受到损害，则此比值就会发生改变，可以增大或缩小。

慢性毒性作用

１．染毒途径和期限

a)染毒途径

?染毒途径和人类实际接触相似的途径

?实际工作多经口染毒，一般每周5-6天。

?长期呼吸道染毒需动式吸入染毒

b)染毒期限

?根据实验要求和动物物种。

?工业毒物6个月或更长，环境毒物、食品要求1-2年。工业毒物的试验通常每日吸

入4～6小时；环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长。

?观察致癌时，最好接近预期寿命，终生染毒。

２．观察指标

?检查项目

?一般性指标

?实验室检查

?病理学检查（最客观）

?其他特异性指标

?以亚慢性毒性实验所提供的毒效应和靶器官为基础，优先其筛选出来的敏感或特异

性指标。

?为研究毒性的迟发性、可逆性，高剂量组和对照组停止染毒后继续观察1-2月。３．慢性毒性试验的注意事项

1、重视实验项目管理：项目管理需要选择具有丰富长期毒性实验经验的专业化人才对项目的设计和实施全面管理。参加实验人员必须经过专业培训的人员，尤其是对每天灌胃或静脉给药等风险较大的操作，应排除一切出现操作失误的可能性。

2、合理的实验设计：剂量设计是长期重复毒性试验成败的关键。剂量设置应能得到如下结果：足够高的剂量以能观察到受试物的毒性作用，动物死亡率不能超过10%，如果是阴性结果，剂量设计必须达到技术规范的要求，否则，应该谨慎做出结论。

3、实验动物环境的要求：实验动物的饲养和实验环境标准化十分重要。正规的毒理学实验一般要求在经GLP认证的科研单位进行。

4、检测条件的控制：仪器设备、试剂的选购、安装、保管、维护、校正，到检测方法、样品处理等的标准操作规程（SOP）制定，经常性的室间和室内质控，操作人员的培训等均要纳入科学的管理之中。

第七章致突变作用

1、突变(mutation) 是指遗传结构本身的变化及其引起的变异。

2、致突变作用或诱变作用(mutagenesis)广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞

核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。

3、遗传毒性：指对基因组的损害能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性及其他各种

不同效应。

4、遗传负荷：物种每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。

5、诱发突变的类型

基因突变（gene mutation）

a)碱基置换(base—pair substitution)：指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。

b)移码突变(frameshift mutation) ：指发生一对或几对（3对除外）的碱基减少或增

加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的

氨基酸。

染色体畸变（chromosome aberration）CA

c)染色单体型畸变(chromatid-type aberration)

d)染色体型畸变(chromosome aberration)

染色体结构异常的类型：缺失，重复，倒位，易位。

染色体数目改变

e)非整倍体和多倍体(aneuploidy and polyloid)

6、DNA损伤与突变

a)碱基损伤

诱导基因突变和染色体畸变的主要靶分子为DNA，而诱导非整倍体和多倍体的靶部位常是有丝分裂和减数分裂的成分，如纺锤丝。

碱基错配：主要物质：亲电子化合物。

烷化剂(alkylating agent)是对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用的物质。

烷化作用指烷化剂提供甲基或乙基等烷基与DNA共价结合的过程。

AP位点：丧失碱基的DNA留下了一个无嘌呤或无嘧啶的位点，通常称AP位点。如果不正确的碱基插入AP位点，可引起突变，大部分是颠换。

鸟嘌呤的O-6位被烷化常引起碱基错配，由原来的G：C转换为A：T（上图），并常诱发肿瘤。

鸟嘌呤的N-7位发生烷化后可导致鸟嘌呤从DNA链上脱落，称为脱嘌呤作用，致使在该位点上出现空缺，形成AP位点；偶然在复制时，随机配一个碱基，导致转换或颠换；多功能烷化剂，导致染色体或染色单体断裂。

DNA损伤的类型：加合物形成；键断裂；交联；嵌入。

b)DNA链受损

1. 二聚体的形成：当细胞或机体受到紫外线刺激，会使DNA发生化学变化，其主要产生环丁烷嘧啶二聚体和(4-6)光产物。可阻止DNA的复制，并引起细胞死亡。

2. DNA加合物（DNA adducts）形成：活性化学物与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物，很难用一般的化学或生物学方法使其解离。

3. DNA-蛋白质交联物(DNA-Protein crosslinks，DPC)形成：它是致突变物对生物大分子物质的一种重要的遗传损害，也是一种稳定的共价结合物。

7、细胞分裂过程的改变与突变

8、观察项目的选择：

1．观察的效应终点类型

i.基因突变和染色体畸变的检测可直接反映外源毒物的致突变性，是评价外源毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic endpoint)。

遗传学终点分为4类：

①DNA原始损伤(形成加合物，断裂，交联)；②基因突变；

③染色体畸变；④染色体组畸变。

2．成套的观察项目

关于遗传毒理学成套观察项目中哪些试验可入选的原则有：

①选择的遗传毒性试验应包括4种类型的遗传学终点。

②通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。

③体内试验与体外试验配合。

④应包括生殖细胞和体细胞。

通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。

机体对DNA损伤有修复机制。

1、直接修复（遗传物质的高度保真原因）：（1）光复活；（2）“适应性”反应。

2、切除修复：切除核苷酸修复（NER），切除碱基修复（BER）。

核苷酸切除修复（NER）：4个基本步骤：（1）糖基化酶；（2）插入酶；（3）DNA聚合酶；（4）DNA连接酶。NER和BER是化学损伤的主要修复方式。

碱基切除修复（BER）由DNA糖基酶作用于受损的DNA，该酶可识别异常的碱基，通过切除碱基与脱氧核糖连接的键，使受损的碱基脱落，产生一个无嘌呤或无嘧啶位点即AP 位点。

致突变试验的目的：评定外来化合物对体细胞及生殖细胞的致突变性，对遗传危害性作出初步评价，并预测其致癌可能性。

将致突变试验的观察终点称为遗传学终点：4种。（1）基因突变；（2）染色体畸变；（3）染色体组畸变；（4）DNA原始损伤。

入选遗传毒理学成套观察项目的原则：（1）一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。（2）通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳动物细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。（3）体内试验与体外试验配合，体内试验接近实际情况，但由于毒性动力学或其他原因，有时会漏检致突变物。

9、常用的致突变试验：(一)细菌回复突变试验(Ames试验)

细菌回复突变试验（Ames试验）：常用菌株有鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌。

Ames试验采用鼠伤寒沙门菌组胺酸缺陷型突变株作为指示微生物，检测受试物的致突变性的试验。其原理是人工诱变的突变株在组胺酸操纵子中有一个突变，突变的菌株必须依赖外源性组胺酸才能生长，而在无组胺酸的选择性培养基上不能存活，致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组胺酸的培养基上也能生长。

正向突变指野生型基因失活的突变。最常用的基因座是hprt和tk，其产物是次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶（HPRT）和胸苷基酶（TK）。

细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其致突变性。常用的菌株有鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和大肠杆菌(E. Coli)。

(二)微核试验: 微核(Micronucleus ，MN)的产生与染色体损伤有关

ⅰ微核是指位于生物细胞的细胞质中独立于主核，直径小于主核1／2O～1／3，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核。

ⅱ它可以是整条染色体，也可以是染色体断片，染色性与主核一致，其中部分微核具有DNA 复制能力。微核是由于外界损害因素使染色体发生断裂，细胞进入下一次分裂时，染色体不能随有丝分裂进入子细胞，而导致染色体丢失或断裂，从而形成一个或数个小核。

微核试验(Micronucleus test，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA 断裂剂和非整倍体诱变剂。

S9：S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。

10、致突变试验的质量控制：设立阴性对照和阳性对照；盲法观察；资料的统计学分

析；试验结果的重现性；

11、评价总原则：实验质量控制；剂量设计是否达到要求；与对照比较有无显著性差异。

第八章外源化学物致癌作用

1、化学致癌过程：引发阶段，促进阶段、恶性进展阶段。指化学物质引起或诱导正常细胞

发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程，具有这类作用的化学物质称为化学致癌物。

引发阶段的主要特征

：不可逆；

所引发的“干细胞”在形态学上无法识别；

需要通过细胞分裂“固定突变”；

剂量-反应关系良好，但很难测定的阈值，无可测定的最大反应；

存在自发启动的引发作用(内源性)；

对外源性化学物质和其他化学因素敏感；

引发剂的强度以经一定的促长阶段后发生的癌前病变来定量。

促长阶段的主要特征

可逆(基因表达、细胞水平)；

促长剂的有效性仅出现在引发作用之后；

促长细胞群（promoted cell population) 的存在取决于促长剂的持续存在；

内源性促长剂可起“自发”促长作用；

剂量-反应显示有可测定的阈值，有可测定的最大效应；

对饮食和激素等因素敏感；

以能否有效的扩大引发细胞群来确定促长剂的相对强度。

促进剂特点：器官特异性；物种特异性；具有阈剂量；是一个可逆过程；受体介导起作用。进展阶段的主要特征

不可逆；

核型不稳性性导致细胞基因组结构的形态学改变；

有可测定的和/或形态学可描述的细胞基因组的改变；

进展的早期阶段，已改变的细胞对环境因素敏感；

可见良性和/或恶性肿瘤；

促进展剂可使已促长的细胞进入该阶段；

可以发生自发的进展作用。

主要表现为：自主性和异质性增加、生长加速、侵袭性加强、出现浸润和转移的恶性生物学特征。

在肿瘤细胞中发现的微卫星不稳定性（MSI）的现象可作为整个基因组中DNA复制错误增多的一种指标，是肿瘤细胞基因不稳定性一项灵敏的生物学标志。

启动与促进剂关系特点：1、启动之后，促慢性作用可引起肿瘤；2、启动剂单独不引起肿瘤；

3、只有促进剂无启动剂不引起肿瘤；

4、二者先后顺序很重要；

5、启动剂不可逆改变，早期为可逆的。

2、化学致癌作用机制两种学说：

体细胞突变致癌学说

（一）DNA加合物、蛋白质加合物、DPC：（二）DNA修复与致癌过程：

变异一般发生在：癌基因、抑癌基因、增变基因。（三）癌基因、原癌基因和抑癌基因： 非突变致癌学说：（四）基因表达调控异常与肿瘤的发生

3、（一）DNA加合物：许多致癌物是亲电剂与生物大分子（如DNA）结合→形成加合物→造成DNA损伤部分细胞恶性转化→肿瘤；

DNA加合物在化学致癌作用过程中起到关键作用，是引起肿瘤的直接原因之一。

（二）DNA修复与化学致癌：正确修复：受损的DNA完全回复原有的结构与功能，不发生突变；

错误修复：经修复的DNA部分仍可能在结构和功能上存在缺陷，细胞虽能生存，但出现突变。

（三）癌基因、原癌基因及抑癌基因：

（四）基因调控异常：表观遗传学调控失调；细胞异常增生；免疫抑制；内分泌激素失衡；过氧化酶体增殖剂激活受体

抑癌基因p53和Rb的失活以及端粒酶的激活是人体细胞获得永生化的必要条件，即“端粒假说”。

根据化学致癌物引起癌变的机制或模式，可将化学致癌物分为遗传毒性致癌物和表观遗传毒性致癌物。

遗传毒性致癌物：进入细胞后与DNA共价结合，引起机体遗传物质改变，导致癌变的化学物质。分为直接与间接致癌物和无机致癌物。间接又有前致癌物、近致癌物和终致癌物。表观遗传毒性致癌物

以灵敏度和特异性两个指标来衡量试验的可靠性。

在哺乳动物致癌试验中，以癌前病变为最终观察点。

5、IARC将化学物对人类致癌性资料(流行病学调查和病例报告)和对实验动物致癌性资料分为四级（2002）：1级，对人类是致癌物；2级，对人类是很可能或可能致癌物；3级，对人的致癌性尚不能确定的物质。(497种)；4级，对人类可能是非致癌物。(1种)

第九章发育毒性与致畸作用

1、畸形(malformation):指出生前因素引起发育生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷（异常）。

2、畸胎(terate):具有畸形的胚胎或胎仔。

3、致畸性(teratogenicity)和致畸作用(teratogenic effect)：均指在妊娠期（出生前）接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用。（致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现）

4、致畸物或致畸原(teratogen):凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化学物。

变异：是由遗传和遗传外因素控制的外观变化，或由于分化改变而引起的差异。

5、胚胎毒性(embryotoxicity)：通常是指外源性因素造成的孕体着床前后直到器官形成期结束的所有的毒性。表现为：胚胎期染毒而出现畸胎、生长迟缓、着床数减少和吸收胎，也偶有晚死胎

6、胚体-胎体毒性：外源性理化因子对孕体着床前后直到器官形成期结束时的有害影响叫胚体毒性，对孕体器官形成期结束之后的有害影响叫胎体毒性或胎儿毒性。

6、发育毒性(developmental toxicity)指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用。具体表现可分为:

生长迟缓:即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。

致畸作用:由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。

功能不全或异常:即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。

胚胎或胎仔致死作用 :某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。

出生缺陷：指婴儿出生前即已形成的发育障碍，包括畸形和功能缺陷。

最容易引起畸形的阶段是器官形成期。

7、着床前期发育毒性

从受精算起，到完成着床之前（人类为11-12天，啮齿类动物为前6天）

通常是未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡，即着床前丢失

也有着床前接触毒物导致畸形的例子，如甲基亚硝脲致小鼠神经管畸形和腭裂

器官形成期：

器官形成期是发生结构畸形的关键期，也叫致畸敏感期。大多数器官对致畸作用有特殊的敏感期，即所谓的时间“靶窗”。

胎儿期：

胎儿期外源化学物的不良作用主要表现为生长迟缓、特异的功能障碍、经胎盘致癌，偶见死胎。

典型致畸作用的剂量-反应曲线的斜率比较大。

从NOAEL到胚胎死亡剂量之间的剂量范围叫致畸带。越宽危险性越大。

8、（一）母体因素对发育毒性的影响

母体毒性(maternal toxicity)是指外源毒物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用

具体表现：

影响发育的母体因素主要包括：遗传、疾病、营养、应激等，也可以通过胎盘毒性影响发育。

（二）母体毒性与发育毒性的关系

?母体毒性作用与致畸作用关系

?具有发育毒性，但无母体毒性出现。(如：沙利度胺，最危险)

?出现发育毒性的同时也表现母体毒性。（不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。）

?仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。

?在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。

胎儿酒精综合症（FAS）

12、反应停的代谢活化产物引起胚胎细胞的粘联受体下调，阻碍发育过程中细胞与细

胞、细胞与基质之间的相互作用，干扰了细胞之间的通讯从而导致肢芽结构异常

13、发育毒性和致畸作用试验与评价：

动物发育毒性试验：三段生殖毒性试验分别为：

I段：生育力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）

II段：胚体-胎体毒性试验（致畸试验）

III段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）

14、外源化学物发育毒性的评价

?结果评定

?活产幼仔平均畸形出现数:即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。

?畸形出现率:即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。

?母体畸胎出现率:即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。

15、致畸作用机理：Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括突变、染色体断

裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用

近年来在分子水平的研究有很大的进展。胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。

第十三章免疫毒理学

免疫毒性特点：1、对比其他更为敏感；2、免疫系统对外来化合物的毒性反应的复杂性；3、对各器官免疫毒性反应的不一致性；4、个体差异大。

1、外源性化学物质对免疫系统的影响：

外源性化学物质对免疫系统的影响表现在三个方面，即免疫抑制、超敏反应和自身免疫反应。

2、免疫抑制

外源化学物免疫抑制的主要表现：外源化学物免疫抑制的结果是宿主抵抗力降低，主要表现为抗感染能力降低和肿瘤易感性增加。

3、超敏反应（hypersensitivity）

亦称变态反应（allergy）指已致敏的机体再次接触相同抗原后，发生的一种以生理功能紊乱或组织细胞病理损伤为主的异常特异性免疫应答。

4、（三）自身免疫

自身免疫是指机体免疫系统对自身成分发生免疫应答的现象，自身免疫性疾病是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病。

新药免疫毒性评价项目：免疫抑制、超敏反应、自身免疫、免疫原性、不良免疫刺激。